超聲輔助提取冬蓀菌托多糖的工藝優(yōu)化

蒲晗旭，張 露，李茂淋,3，陶 烽，王 靜，羅 鵬*，王國澤*

（1.貴州醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與健康學院，環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室，貴陽 550025；2.貴州省食品營養(yǎng)與健康工程研究中心，貴陽 550025；3.成都大學食品與生物工程學院，四川成都 610106）

冬蓀，又稱白鬼筆（Phallus impudicus），屬于鬼筆目（Phallales）、鬼筆科（Phllaceae）、鬼筆屬（Phallus），屬于珍稀食藥用真菌[1]，在夏季和秋季主要生長于樹林里的腐爛樹葉堆中，具有獨特的外觀且達到成熟期時會散發(fā)臭味[2]。Li 等[3]從形態(tài)學與系統(tǒng)發(fā)育樹證實了其是一個新種，并命名為“冬蓀”。貴州大方冬蓀，是貴州省畢節(jié)市大方縣特產(chǎn)，2016 年11 月04 日，大方冬蓀被批準為中國國家地理標志產(chǎn)品[4]。冬蓀具有極高的藥食兩用價值[5]。在藥用方面，冬蓀子實體可入藥，有祛風除濕和活血止痛的功效；冬蓀多糖具有保濕、增強免疫等作用[6-7]。而作為食品，冬蓀味道鮮美、口感嫩滑，有著極高的營養(yǎng)價值。食用菌多糖作為一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖類物質(zhì)，由10 個以上的單糖通過糖苷鍵等連接構(gòu)成，目前研究發(fā)現(xiàn)其對肥胖[8]、血脂異常和二型糖尿病[9]等多種慢性代謝疾病有一定的改善作用。食用菌多糖作為益生元，具有減少體內(nèi)脂肪積累、降低體質(zhì)量、保護肝臟的功能[10]。此外，大量研究發(fā)現(xiàn)食用菌多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等多種生物活性，如杏鮑菇多糖可促進免疫因子的分泌，進而加強宿主免疫[11]等。

目前多糖的提取方法很多，有水提醇沉、微波輔助提取、超聲輔助提取、煎煮法、回流提取與膜分離技術(shù)等[12-13]。微波輔助提取選擇性高、操作時間短、溶劑消耗量少，但設(shè)備泄漏的微波輻射會給人體造成慢性損傷。煎煮法簡便易行，能煎出大部分有效成分。尤其適用有效成分能溶于水，對溫、熱均穩(wěn)定的藥材；但對有效成分的選擇性差，且雜質(zhì)較多，精制較困難，樣品容易霉變、腐敗變質(zhì)，不易保存。一些不耐熱及揮發(fā)性成分在煎煮過程中易被破壞，揮發(fā)而損失。回流提取法消耗溶劑少，回流法由于連續(xù)加熱，浸出液在蒸發(fā)鍋中受熱時間較長，故不適用于受熱易破壞的樣品成分浸出。膜分離技術(shù)有效成分損失極少，特別適用于熱敏性物質(zhì)，如抗生素等醫(yī)藥、果汁、酶、蛋白的分離與濃縮；適應(yīng)性強，處理規(guī)模可大可小，可以連續(xù)也可以間隙進行，工藝簡單，操作方便，易于自動化；缺點為不能將產(chǎn)品濃縮成干物質(zhì)。水提醇沉法是目前較為常見的食用菌多糖提取方法，試驗設(shè)備簡單，操作容易，準確度高，成本低廉，一次性投入較小，缺點為耗時長，勞動強度大，提取效率低，提取過程中醇使用量大，但多糖是熱敏性物質(zhì)，長時間在高溫下會影響其生物活性。近年來，超聲技術(shù)提取植物活性成分的研究方法日益興起[14-15]，該提取技術(shù)作為一種物理粉碎過程，借助超聲波強烈的“空穴作用”，通過破碎植物細胞壁、提高細胞內(nèi)容物穿透性，進而釋放更多植物內(nèi)部的有效成分，具有易操作、提取快捷、提取率高等特點[16]。超聲的物理性質(zhì)，可促使植物組織破裂或變形，使中藥有效成分的提取更加充分，與傳統(tǒng)工藝相比，提取率提高50%～500%。與傳統(tǒng)工藝相比，超聲強化提取一般能在24～40min內(nèi)得到理想的提取率，比傳統(tǒng)的中藥提取法縮短2/3 以上，從而提高了原料的處理效率。超聲波提取藥液雜質(zhì)少，有效成分容易分離純化。基于此，本研究擬采用超聲輔助熱水浸提法優(yōu)化冬蓀多糖的提取工藝。

目前貴州省大方縣冬蓀得到了大量的推廣種植，冬蓀采摘過程中，僅采摘其菌柄以上部分，而大量冬蓀菌托被直接遺留在田間地頭，造成大量的資源損失，而且加重環(huán)境負擔。已有研究表明冬蓀菌托中多糖含量很高[17]，因此可將其作為提取多糖的良好來源。目前對冬蓀多糖的成分研究多集中在多糖的組成、結(jié)構(gòu)和分子量等方面，而研究對象多集中在其子實體（干品、鮮品、菌蓋、菌托、菌柄）和菌絲體[18-20]。本文以冬蓀菌托為研究對象，采用響應(yīng)面法優(yōu)化冬蓀菌托多糖的提取工藝，以期為冬蓀菌托的產(chǎn)業(yè)鏈開發(fā)，冬蓀菌托多糖生物活性研究提供理論基礎(chǔ)。基于此，本研究擬采用響應(yīng)面法進一步優(yōu)化冬蓀菌托多糖的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冬蓀菌托購買于貴州省畢節(jié)市大方縣，經(jīng)反復(fù)清洗，用60 ℃電熱恒溫鼓風干燥機烘干至恒質(zhì)量，粉碎后備用。

葡萄糖，天津市科密歐化學試劑有限公司；正丁醇，純度≥99.5%，天津市科密歐化學試劑有限公司；苯酚，純度≥99.0%，重慶川東化工（集團）有限公司；三氯甲烷，純度≥99.0%，重慶川東化工（集團）有限公司；無水乙醇，純度≥99.7%，重慶川東化工（集團）有限公司；濃硫酸，純度95.0%～98.0%等。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

400A 多功能打粉機，永市紅太陽機電有限公司；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DZ-3BCⅡ真空干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；SCIENTZ-ⅡD超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技有限公司；multiskan 酶標儀，賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冬蓀菌托多糖的制備

選擇新鮮冬蓀菌托，洗凈、冷凍烘干，用粉碎機粉碎，按照液料比27∶1（mL/g）加水溶解，535 W 超聲32 min，熱水浸提，3 500 r/min 離心10 min，去掉沉淀，濃縮上清液，最終使得濃縮后的多糖溶液40 mL 左右，采用Sevag法脫蛋白按照比例（試劑∶濃縮液）=1∶1 進行配比，試劑組成為正丁醇∶三氯甲烷=1∶4，加入試劑，快速攪拌10 min 左右，在通風櫥里操作，再放到空氣浴振蕩器中震蕩30 min，轉(zhuǎn)速200 r/min，取出樣品，分裝到50 mL 離心管，4 000 r/min、15 min。離心結(jié)束后取出，去除中間蛋白質(zhì)，將多糖溶液與有機試劑繼續(xù)攪拌混勻，再次振蕩30min，然后離心，去蛋白，重復(fù)3 次，直至中間無蛋白質(zhì)層出現(xiàn)。加入95%乙醇，置于冰箱4 ℃沉淀過夜，用80 目的過濾篩過濾棄去乙醇溶液，將各樣品放入真空干燥箱，關(guān)閉箱門用真空干燥箱烘干沉淀物，獲得冬蓀菌托多糖。

1.3.2 葡萄糖標準曲線繪制

本試驗采用苯酚-硫酸法檢測多糖的含量[21-23]。購買葡萄糖標準品，用真空干燥箱將其干燥至恒質(zhì)量，精確稱量200 mg，加入去離子水使其溶解，用100 mL 容量瓶定容，得到2.0 mg/mL 的葡萄糖標準溶液。使用2.0 mg/mL的葡萄糖標準溶液配制成濃度分別為0、20、40、60、80、100 μg/mL的葡萄糖標準溶液，分別用移液槍吸取200μL，置于2 mL 連蓋圓底離心管中，再各自加入200 μL 5%的苯酚溶液，快速搖勻，緊接著緩慢滴加700 μL 濃硫酸，快速搖勻，80 ℃水浴加熱10 min；冷水浴5 min 使之冷卻至室溫，在490 nm 波長處測量吸光度值，葡萄糖的吸光度值與濃度之間的回歸方程為y=0.006 9x-0.003，R2=0.999 3，即葡萄糖標準品在0～100 μg/mL 濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.3.3 冬蓀菌托多糖含量測定

按上述方法進行樣品溶液多糖含量的測定，根據(jù)所測樣品溶液的吸光度值得出冬蓀菌托多糖的含量，按照公式（1）計算冬蓀菌托多糖的提取得率。

式中，y為多糖提取得率，%；c為溶液中多糖濃度，mg/mL；V為多糖溶液體積，mL；N為多糖溶液稀釋倍數(shù)；m為冬蓀菌托干粉質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗

水浴溫度分別設(shè)置為75、80、85、90、95 ℃，超聲功率設(shè)置為350、400、450、500、550 W，超聲時間設(shè)置為20、25、30、35、40 min，液料比設(shè)置為18∶1、23∶1、28∶1、33∶1、38∶1 mL/g，進行單因素試驗。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

基于單因素試驗的結(jié)果，確定冬蓀菌托多糖提取得率為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平的中心組合響應(yīng)面試驗，對冬蓀菌托多糖提取方案進行優(yōu)化（表1）。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-expert 8.0.6 軟件分析試驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 水浴溫度對冬蓀菌托多糖提取得率的影響

固定超聲功率550 W、超聲時間為30 min、液料比為33∶1（mL/g），調(diào)整水浴溫度進行冬蓀菌托多糖提取試驗。由圖1 可知，隨水浴溫度升高，多糖提取得率先升高后降低，當水浴溫度為90 ℃時，達最大值（6.321%）。有研究發(fā)現(xiàn)較高溫度會破壞多糖結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致多糖發(fā)生降解[24]。因此，最佳水浴溫度選擇90 ℃。

圖1 水浴溫度對冬蓀菌托多糖提取得率的影響Fig.1 Effects of extraction temperatures on the extraction rate of polysaccharide

2.1.2 超聲功率對冬蓀菌托多糖提取得率的影響

固定水浴溫度為90 ℃、超聲時間為30 min、液料比為33∶1（mL/g），調(diào)整超聲功率進行冬蓀菌托多糖提取試驗。由圖2 可知，隨超聲功率的逐漸增大，多糖提取得率先升高后降低，當超聲功率達500 W 時，多糖提取得率達最大值，為6.997%。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能在于超聲功率增大到一定程度后，體系空化作用過于強烈，分子快速聚積使局部產(chǎn)生高溫，多糖分子因長時間受高溫作用而失活，因此多糖提取得率反而減少[26]。故超聲功率選擇500 W。

圖2 超聲功率對冬蓀菌托多糖提取得率的影響Fig.2 Effects of ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharide

2.1.3 超聲時間對冬蓀菌托多糖提取得率的影響

固定水浴溫度為90 ℃、超聲功率為500 W、液料比為33∶1（mL/g），改變超聲時間進行冬蓀菌托多糖提取試驗。由圖3 可知，隨超聲時間的延長，多糖提取得率先升高后降低，當超聲時間為30 min 時達最大值（6.807%）。超聲波促進多糖分子溶出的原理是通過物理作用破碎細胞壁，當超聲時間延長后，因儲蓄了超負荷的超聲能量，多糖分子的化學鍵容易斷開，多糖失活并析出，致使出現(xiàn)多糖提取得率減少的現(xiàn)象[25]。故確定超聲時間為30 min。

圖3 超聲時間對冬蓀菌托多糖提取得率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic time on the extraction rate of polysaccharide

2.1.4 液料比對冬蓀菌托多糖提取得率的影響

固定多糖提取條件為水浴溫度90 ℃、超聲功率500 W、超聲時間30 min，改變液料比進行冬蓀菌托多糖提取試驗。由圖4 可知，隨液料比的增大，多糖提取得率先升高后降低，當液料比為28∶1 時達最大值（7.228%）?？赡芤蛉軇┰龆嗪笫钩暡ㄆ扑榧毎淖枇﹄S之增大，導(dǎo)致細胞破碎程度降低[26]，且溶劑過多，大量雜質(zhì)隨之析出，多糖溶出空間被搶占，致使多糖提取得率反而下降。因此，液料比選擇28∶1。

圖4 液料比對冬蓀菌托多糖提取得率的影響Fig.4 Effects of liquid-solid ratio on the extraction rate of polysaccharide

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化竹蓀菌托多糖提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果

如表2 所示，本試驗的響應(yīng)面試驗結(jié)果利用Design-expert 8.0.6 軟件進行回歸分析，建立了如下響應(yīng)面回歸方程：冬蓀菌托多糖提取得率Y=7.25+0.47A+0.60B+0.28C+0.24D-0.041AB+0.41AC+0.34AD+0.27BC-0.678D-0.25CD-0.84A2-0.59B2-0.83C2-0.53D2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Arrangement and experimental results of response surface test

由表3 可知，此模型R2=0.951 5，模擬顯著性P＜0.01，失擬項（0.091 9）＞0.01，表明該模型具有較好的穩(wěn)定性，可用該模型對真實情況進行預(yù)測。本試驗設(shè)置的4個單因素對多糖提取得率均有極顯著影響，AC、BD 交互作用對冬蓀菌托多糖提取得率的影響是極顯著的，AD交互作用對多糖提取得率影響為顯著，而AB、BC、CD 交互作用對菌托多糖提取率無顯著影響。Design-expert 8.0.6 軟件分析表明冬蓀菌托多糖最優(yōu)提取工藝為水浴溫度91.6 ℃，超聲功率535.43 W，超聲時間31.97 min，液料比26.94∶1（mL/g），多糖提取得率預(yù)測最高理論值為7.568%。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results for regression model

2.2.2 因素交互作用分析

圖5（見下頁）反映各因素對響應(yīng)值的影響。由圖5a可知，當水浴溫度升高及超聲時間延長時，冬蓀菌托多糖提取得率出現(xiàn)先增大后減小的情況，且等高線為橢圓形，表明兩因素的交互作用顯著。而對于多糖提取得率的影響程度來說，水浴溫度發(fā)生變化導(dǎo)致的影響更為明顯，超聲時間對其影響程度相對較小，即冬蓀菌托多糖提取得率受水浴溫度的影響更大。由圖5b 可知，多糖提取得率隨水浴溫度和液料比升高，出現(xiàn)先增后減的情況，但多糖提取得率在水浴溫度方向的變化較液料比方向的變化更明顯，也表示多糖提取得率受水浴溫度的影響更突出。從圖5c 可知，隨著超聲功率增大和超聲時間延長，冬蓀菌托多糖提取得率先提高后減小，但多糖提取得率在超聲功率方向增加程度比在超聲時間方向增加程度更明顯，說明超聲功率對多糖提取得率的影響比超聲時間更大。圖e、d、f 依次按此法進行分析。由響應(yīng)面圖分析可得出結(jié)論：超聲功率對多糖提取得率影響最顯著，其次是水浴溫度，而超聲時間、液料比影響較小。

圖5 兩因素交互作用對冬蓀菌托多糖提取得率的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagram of the interaction of two factors on the extraction yield of polysaccharide from volva of P. impudicus

2.2.3 最佳工藝驗證試驗結(jié)果

為便于實際操作，調(diào)整最佳提取條件為水浴溫度92 ℃、超聲功率535 W、超聲時間32 min、液料比27∶1（mL/g），經(jīng)進一步驗證試驗，得出多糖提取得率為7.442%，與模擬預(yù)測值接近。因此利用響應(yīng)面法優(yōu)化冬蓀菌托多糖的提取方法是較為可靠的。

3 討論與結(jié)論

有研究表明冬蓀菌托的多糖含量是冬蓀菌蓋和菌柄的3 倍多，從冬蓀菌托中提取多糖并將其開發(fā)為具有生物活性的健康食品不僅解決了冬蓀菌托對環(huán)境的影響，還實現(xiàn)了冬蓀的綜合利用，延長了冬蓀產(chǎn)業(yè)鏈。

本試驗采用響應(yīng)面分析方法，得出冬蓀菌托多糖提取的最佳工藝條件為水浴溫度92 ℃、超聲功率535 W、超聲時間32 min、液料比27∶1（mL/g），此工藝條件下所得冬蓀菌托多糖提取得率為7.442%，與模型理論最大值相近。此工藝可為冬蓀菌托多糖的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。