胞飲突評估子宮內(nèi)膜容受性的研究進(jìn)展

項(xiàng)怡寧，馮煒煒

子宮內(nèi)膜容受性是指子宮通過自身變化，允許囊胚定位、黏附、穿透及植入子宮內(nèi)膜的能力，與囊胚著床及發(fā)育密切相關(guān)。人類子宮內(nèi)膜容受性出現(xiàn)于月經(jīng)周期的黃體中期（第19～23天），期間子宮內(nèi)膜會(huì)隨孕激素的升高而發(fā)生變化，以確保其對囊胚的接受。而子宮內(nèi)膜接受囊胚植入的時(shí)間是限定的，稱之為種植窗（window of implantation）。評估子宮內(nèi)膜容受性對于不孕癥患者的診斷及治療至關(guān)重要。近年來，子宮內(nèi)膜容受性陣列（endometrial receptivity array，ERA）可對子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行RNA測序，通過分析238個(gè)與子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)的基因表達(dá)陣列來診斷子宮內(nèi)膜的分子狀態(tài)，從而評估子宮內(nèi)膜容受性[1]。然而其局限性包括費(fèi)用較高、結(jié)果相對不精確及測試具有侵入性。因此，亟需尋找新的標(biāo)志物來評估不孕癥女性的子宮內(nèi)膜容受性。胞飲突（pinopode）是黃體期子宮內(nèi)膜上皮表面的一種特殊膜狀突起，得名于在大鼠中觀察到其胞飲活性[2]。目前認(rèn)為胞飲突可用于評估子宮內(nèi)膜容受性，并與妊娠結(jié)局有關(guān)。本文從胞飲突的生理結(jié)構(gòu)、評估方式、調(diào)節(jié)因素及功能等方面，綜述近年來胞飲突評估子宮內(nèi)膜容受性的研究進(jìn)展，重新審視胞飲突研究方法中存在的問題及發(fā)展前景，以期為胞飲突在女性生殖健康中的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 胞飲突的生理結(jié)構(gòu)

人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞主要由纖毛細(xì)胞和微絨毛細(xì)胞構(gòu)成，前者不受周期性激素的影響，而后者則在月經(jīng)周期中受激素調(diào)節(jié)。在種植窗開始時(shí)，幾個(gè)相鄰的微絨毛細(xì)胞通過側(cè)向融合形成胞飲突[3]。當(dāng)囊胚到達(dá)宮腔時(shí)，與胞飲突互相作用，胞飲突內(nèi)的絲狀肌動(dòng)蛋白與其結(jié)合蛋白交聯(lián)為一種正交網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，定位于細(xì)胞的頂端，在囊胚植入子宮內(nèi)膜的過程中發(fā)揮作用[4]。

胞飲突的發(fā)育和退化是一個(gè)循環(huán)的過程，可在不同時(shí)期表現(xiàn)為不同形態(tài)，如氣球狀、蘑菇狀、花狀或氣泡狀的突出物等。對整個(gè)月經(jīng)周期的人類子宮內(nèi)膜進(jìn)行掃描電鏡分析，根據(jù)胞飲突的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)可分為發(fā)育期、成熟期及退化期[5]。在月經(jīng)周期的第17～19天，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞膨大并形成直徑1～2 μm的小胞飲突；至月經(jīng)周期的第20天，即黃體中期，胞飲突完全發(fā)育并覆蓋于子宮內(nèi)膜上，表現(xiàn)為球形、光滑且無絨毛的形態(tài)；至月經(jīng)周期的第23～25天，即分泌晚期，胞飲突發(fā)生退化，表現(xiàn)為褶皺外觀。通常在月經(jīng)周期和生育能力正常的女性中，胞飲突豐富且發(fā)育良好，而在不明原因不孕女性中，胞飲突覆蓋較少且發(fā)育不良[6]。

雖然目前已基本確認(rèn)胞飲突可以作為子宮內(nèi)膜容受性的評估指標(biāo)，其發(fā)育過程及影響子宮內(nèi)膜容受性乃至妊娠結(jié)局的機(jī)制尚待研究。而對胞飲突及其調(diào)節(jié)相關(guān)因素的研究將對不孕女性尤其是接受體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）患者的診治有較大價(jià)值。

2 胞飲突的評估方式

目前，大多數(shù)關(guān)于胞飲突的研究都使用掃描電鏡評估其在子宮內(nèi)膜中的形態(tài)、大小及覆蓋情況。根據(jù)既往報(bào)道，大鼠成熟胞飲突的直徑平均約為4.0μm，小鼠和人類成熟胞飲突直徑則約6.0μm[2]。Jin等[7]建議，為減少在計(jì)數(shù)時(shí)的數(shù)量誤差，實(shí)現(xiàn)評估過程的可重復(fù)性，應(yīng)當(dāng)在每個(gè)樣本中使用60個(gè)顯微場（microscopic fields）的運(yùn)行平均值。

在胞飲突定性及定量的評估上，最初通常由研究者人工對胞飲突的密度進(jìn)行觀察和量化。近年來，Matson等[8]首次使用自動(dòng)定量的方法，通過一種二進(jìn)制插件使掃描電鏡根據(jù)顆粒大小及圓度對胞飲突進(jìn)行定量分析。該方法可以根據(jù)胞飲突的形態(tài)對不同階段的胞飲突進(jìn)行表征，得出更準(zhǔn)確且可重復(fù)的結(jié)果。

由于胞飲突體積較小，存在時(shí)間短，且依賴于激素及細(xì)胞外環(huán)境提供的特定滲透條件，通常較難實(shí)現(xiàn)胞飲突在空間及時(shí)間上的成像。同時(shí)，由于胞飲突缺乏特定標(biāo)志物，盡管掃描電鏡及透射電鏡具有較高的分辨率，依然很難應(yīng)用于胞飲突的電子顯微鏡成像[2]。因此，需要研發(fā)具有超分辨率的成像技術(shù)，并結(jié)合免疫組織化學(xué)完成對胞飲突的進(jìn)一步識別和評估，從而增強(qiáng)對胞飲突結(jié)構(gòu)和功能的了解。

3 胞飲突在評估子宮內(nèi)膜容受性中的臨床價(jià)值

目前，已有多項(xiàng)臨床研究證實(shí)了胞飲突在評估子宮內(nèi)膜容受性中的價(jià)值。早期研究中，Nikas等[9]根據(jù)種植窗期胞飲突所占子宮內(nèi)膜表面積的比例將17例接受輔助生殖助孕的患者分為充分覆蓋（＞50%）、中等覆蓋（20%～50%）和較少覆蓋（＜20%）3組，充分覆蓋組的5例患者全部成功妊娠，中等覆蓋組的7例中有3例妊娠，而較少覆蓋組的5例患者均未妊娠。該研究初步證實(shí)胞飲突在子宮內(nèi)膜中的覆蓋面積可能與妊娠結(jié)局有關(guān)。Qiong等[10]則納入360例接受IVF-ET治療的患者，并引入了胞飲突評分的概念，在×2 000倍數(shù)下對種植窗期間子宮內(nèi)膜上皮中的胞飲突進(jìn)行計(jì)數(shù)（每份樣本計(jì)數(shù)20個(gè)視野，每個(gè)視野中可觀察到約150個(gè)細(xì)胞），并將觀察到的胞飲突數(shù)量總數(shù)相加，作為患者的胞飲突評分。受試者工作特征曲線提示胞飲突評分的最佳截?cái)嘀禐?5分，敏感度74.7%，特異度93.1%；以該截?cái)嘀禐榉纸鐚⒒颊叻譃檎：彤惓?組，正常組（胞飲突評分＞85分）的臨床妊娠率與持續(xù)妊娠率在新鮮周期（臨床妊娠率74.29%vs.19.77%，持續(xù)妊娠率62.86%vs.11.86%，均P＜0.001）和累計(jì)周期（臨床妊娠率95.00% vs.32.22%，持續(xù)妊娠率80.56%vs.23.33%，均P＜0.001）中均高于異常組（胞飲突評分≤85分）。

此外，有學(xué)者認(rèn)為，胞飲突對妊娠結(jié)局的影響不僅與其數(shù)量有關(guān)，也與其發(fā)育階段有關(guān)。Melkozerova等[11]對119例因子宮內(nèi)膜因素導(dǎo)致不孕癥的女性種植窗期間的子宮內(nèi)膜上皮進(jìn)行電鏡掃描，觀察到67.39%女性的子宮內(nèi)膜上存在發(fā)育不完全的胞飲突結(jié)構(gòu)。Jin等[7]的前瞻性研究納入172例接受IVF-ET治療的不孕癥女性，并引入與發(fā)育期胞飲突（developing pinopode，DP）及成熟期胞飲突（fully developed pinopode，F(xiàn)DP） 在 總 胞 飲 突（total pinopodes，TP）中所占比例相關(guān)的胞飲突評分系統(tǒng)，分別將FDP/TP及DP/TP的百分點(diǎn)（percentage point）賦值為1及－1，以此來計(jì)算每例患者的胞飲突指數(shù)。受試者工作特征曲線提示胞飲突評分的最佳截?cái)嘀禐椋?6.48，敏感度83%，特異度45%。以該截?cái)嘀祵⒉辉邪Y患者分為2組，胞飲突評分較高組（＞－26.68）的妊娠率（82.3%vs.53.3%，P=0.001）和著床率（63.0%vs.46.7%，P=0.046）顯著高于胞飲突評分較低組（≤－26.48）。以上研究均證實(shí)，胞飲突的成熟度而非密度才是其評估子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)鍵因素。

諸多研究已證實(shí)胞飲突的數(shù)量、覆蓋面積及發(fā)育階段等可在預(yù)測不孕女性種植窗及評估子宮內(nèi)膜容受性中發(fā)揮的臨床價(jià)值。胞飲突評分較高、覆蓋面積較廣且成熟期胞飲突占比較高的女性的妊娠結(jié)局更佳。然而，對胞飲突精準(zhǔn)且客觀的評估手段仍待進(jìn)一步探索，其評估子宮內(nèi)膜容受性的精確度也待進(jìn)一步的機(jī)制研究證明。

4 胞飲突調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性的機(jī)制

4.1 胞飲突通過調(diào)節(jié)宮腔內(nèi)容物影響子宮內(nèi)膜容受性在囊胚著床前與著床期間，宮腔內(nèi)液體量的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。著床前，宮腔內(nèi)液體量增加促進(jìn)囊胚運(yùn)輸至適宜的宮內(nèi)位置；隨后宮腔內(nèi)液體量減少使囊胚周圍的宮腔閉合，便于其黏附、穿透及植入過程[12]。

胞飲突調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性的機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)宮腔內(nèi)容物的能力有關(guān)。水通道蛋白（aquaporin，AQP）是一個(gè)跨膜通道蛋白家族，分布于細(xì)胞膜上，形成孔洞，促進(jìn)水溶性和脂溶性物質(zhì)以及一些離子進(jìn)出細(xì)胞[13]。目前哺乳動(dòng)物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的13種AQP中，已證實(shí)對水具有較好滲透性的AQP-2在胞飲突中發(fā)揮作用。一些學(xué)者推測胞飲突的表面可能存在AQP的表達(dá)。Hildenbrand等[14]的體外實(shí)驗(yàn)通過共聚焦顯微鏡觀察到AQP-2在人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，而在間質(zhì)細(xì)胞中呈陰性；在胞飲突上可觀察到強(qiáng)陽性的AQP-2表達(dá)，提示AQP-2可能定位于胞飲突。He等[15]證實(shí)人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞上的AQP-2在增殖晚期和分泌中期表達(dá)水平最高，在增殖早期和分泌晚期表達(dá)水平最低，與胞飲突的成熟周期一致；在體外研究中，敲低AQP-2可減少絨毛膜癌JAR細(xì)胞與子宮內(nèi)膜Ishikawa細(xì)胞的球體附著，證實(shí)AQP-2與胞飲突在囊胚植入過程中的作用一致。以上體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)胞飲突可能通過AQP進(jìn)行宮腔內(nèi)液體量的調(diào)節(jié)，從而調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性。

此外，胞飲突也可以通過胞吐作用將物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到宮腔，發(fā)揮調(diào)節(jié)囊胚著床過程的作用。1980年P(guān)arr等[16]在大鼠妊娠第5天靜脈注射辣根過氧化物酶作為示蹤劑，發(fā)現(xiàn)其首先定位于子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的囊泡中，隨后出現(xiàn)于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞靠近頂膜的囊泡內(nèi)，最后在宮腔中被觀察到。因而提出假設(shè)，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞可能通過胞吐作用將囊泡內(nèi)包含的物質(zhì)直接釋放到宮腔內(nèi)。Quinn等[2]利用掃描電鏡觀察到小鼠妊娠第4天的胞飲突上發(fā)生了囊泡內(nèi)的物質(zhì)釋放，進(jìn)一步驗(yàn)證了Parr等[16]的發(fā)現(xiàn)。子宮內(nèi)膜上皮的囊泡內(nèi)容物中可能含有外泌體，外泌體的體積比胞飲突更小，是直徑為30～150 nm的胞外囊泡，在細(xì)胞間的信號傳遞中發(fā)揮作用，其介導(dǎo)的物質(zhì)運(yùn)輸過程直接受雌激素和孕酮的影響[17]。Machtinger等[18]提出，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞釋放的外泌體可以介導(dǎo)種植窗期母體和囊胚間的信號傳遞。胞飲突的胞吐過程及其釋放外泌體的假設(shè)可用于解釋胞飲突評估子宮內(nèi)膜容受性的機(jī)制。

多項(xiàng)研究證實(shí)，胞飲突對宮腔內(nèi)容物的調(diào)節(jié)包括液體量及宮腔內(nèi)容物兩方面。胞飲突可通過其表面表達(dá)的AQP調(diào)節(jié)宮腔內(nèi)液體量，從而影響囊胚著床；同時(shí)，胞飲突通過胞吐作用釋放的細(xì)胞外囊泡也是囊胚著床過程中信號傳遞的重要一環(huán)。然而由于倫理及研究方法的限制，目前的研究大多局限于體外或動(dòng)物研究，人子宮內(nèi)膜上的胞飲突是否具有相似功能，則尚待更深入的研究。

4.2 胞飲突通過表達(dá)植入相關(guān)蛋白參與囊胚-子宮內(nèi)膜相互作用目前已知的子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志物大多與植入相關(guān)蛋白有關(guān)，包括整合素（integrin）、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）及黏蛋白（mucoprotein，MUC）等。目前已有研究證實(shí)，上述子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志物的表達(dá)與胞飲突的出現(xiàn)相關(guān)。

整合素是一種細(xì)胞表面受體，與其配體相互作用，可增強(qiáng)囊胚在子宮內(nèi)膜上的黏附和侵襲[19]。α1β1、α3β1等整合素在種植窗期表達(dá)增加[20]。αvβ3則定位于胞飲突上，參與囊胚與子宮內(nèi)膜之間的信號傳遞[5]。LIF在著床過程中起關(guān)鍵作用，有助于滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲，并影響種植窗期的免疫耐受[21]。Dong等[22]發(fā)現(xiàn)胞飲突在宮腔中釋放含有LIF的分泌囊泡。Chung等[23]則證實(shí)，胞飲突釋放的含有LIF的分泌囊泡可通過上調(diào)整合素αvβ3的表達(dá)，增加囊胚與子宮內(nèi)膜的黏附。子宮內(nèi)膜上的MUC1對囊胚植入存在負(fù)調(diào)控作用，通過抑制囊胚的黏附使其著床于適宜部位；著床位點(diǎn)上MUC1的低表達(dá)則可促進(jìn)囊胚的植入。Wu等[24]通過掃描電鏡觀察到纖毛細(xì)胞的表面存在MUC1的表達(dá)，而在胞飲突中則未觀察到MUC1的表達(dá)，由此證實(shí)胞飲突上MUC1的低表達(dá)與囊胚在其上的黏附及植入相關(guān)。Liu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在接受凍融胚胎移植的女性中，妊娠組子宮內(nèi)膜上MUC16的表達(dá)顯著低于未妊娠組（23.1 vs.58.4，P＜0.001），由此證實(shí)MUC16為囊胚植入的抑制劑。然而該研究提示，胞飲突評分與MUC16的表達(dá)并無相關(guān)性。MUC1及MUC16作為重要的植入相關(guān)蛋白，在部分研究中表現(xiàn)出與胞飲突具有相關(guān)性，部分則無顯著關(guān)系。因此，MUC與胞飲突之間是否存在調(diào)控關(guān)系仍存在爭議，需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

5 胞飲突的調(diào)節(jié)因素

5.1 激素調(diào)節(jié)胞飲突是一種周期性激素依賴性的結(jié)構(gòu)，目前已有部分研究證實(shí)激素對于胞飲突周期性改變具有影響，其中，雌激素與孕激素的作用最受關(guān)注。大多數(shù)研究提出，孕激素可刺激胞飲突的發(fā)育，而雌激素的增加與胞飲突的退化同步[2]。Liu等[26]證實(shí)，黃體功能缺失的女性孕激素分泌不足，其子宮內(nèi)膜上胞飲突的成熟較正常女性延遲。Liu等[27]發(fā)現(xiàn)，與促性腺激素釋放激素拮抗劑（gonadotropinreleasing hormone antagonist，GnRHA）相比，應(yīng)用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRHa）可通過增加胞飲突的表達(dá)，改善年輕不孕患者的IVF-ET結(jié)局（臨床妊娠率66.67%vs.42.17%，P=0.01；植入率46.15% vs.29.71%，P=0.041；持續(xù)妊娠率60.00%vs.34.94%，P=0.018）。周云等[28]在小鼠妊娠期第3.5天腹腔注射GnRHa或GnRHA，發(fā)現(xiàn)種植窗期GnRHa組子宮內(nèi)膜上的胞飲突表達(dá)豐富、發(fā)育完全且均勻分布，GnRHA組子宮內(nèi)膜表面的胞飲突則呈局灶性中等表達(dá)，發(fā)育不同步、大小不一；同時(shí)，GnRHa組小鼠種植窗期子宮內(nèi)膜LIF和同源框基因A10（homeobox A10，HOXA10）mRNA的表達(dá)明顯高于注射生理鹽水的對照組和GnRHA組。證實(shí)在黃體期應(yīng)用GnRHa可能有助于胞飲突發(fā)育，從而提高子宮內(nèi)膜容受性，而GnRHA的作用則相反。Mokhtar等[29]的研究表明，對大鼠連續(xù)3 d使用外源性睪酮（500 mg/kg）后，大鼠子宮內(nèi)膜上的胞飲突表達(dá)受到抑制，減少了大鼠子宮內(nèi)膜上可供著床的部位，使大鼠的生育能力降低。提示睪酮在胞飲突發(fā)育成熟過程中可能發(fā)揮抑制作用。

基于上述研究，推測激素是胞飲突發(fā)育及形態(tài)調(diào)節(jié)的重要影響因素，兩者的相關(guān)性研究將有助于確定胚胎移植的適當(dāng)時(shí)機(jī)；同時(shí)，為外源性添加GnRHa等激素用于調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性，以期改善不孕女性妊娠結(jié)局提供了理論依據(jù)。

5.2 基因影響HOXA10是一種轉(zhuǎn)錄因子，可通過激活或抑制其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的增殖、分化與蛻膜化。已有多項(xiàng)研究證實(shí)，胞飲突的發(fā)育和成熟與HOXA10的高表達(dá)同步，HOXA10基因過表達(dá)可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜上的胞飲突數(shù)量增多，而抑制HOXA10基因表達(dá)則減少胞飲突的形成[30-31]。HOXA10可通過調(diào)節(jié)胞飲突的發(fā)育及成熟影響子宮內(nèi)膜容受性，然而其具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待深入探索。

5.3 環(huán)境暴露目前，環(huán)境污染問題已成為擾亂生態(tài)系統(tǒng)、危害人類正常生產(chǎn)生活的重要議題之一。體外的環(huán)境暴露也可能影響胞飲突的表達(dá)。Zhou等[32]對小鼠予以一種廣譜殺蟲劑β-氯氰菊酯灌胃，與僅灌注玉米油的對照組相比，觀察組小鼠的妊娠率顯著降低，血清雌二醇和卵泡刺激素水平升高，血清孕酮和黃體生成素水平降低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜受損及胞飲突發(fā)育受抑制，證明β-氯氰菊酯可能通過干擾性激素穩(wěn)態(tài)及抑制子宮內(nèi)膜胞飲突的發(fā)育而影響小鼠的生育能力。而體外環(huán)境暴露對胞飲突發(fā)育的影響可能是通過基因的甲基化實(shí)現(xiàn)的。Qu等[33]發(fā)現(xiàn)，多氯聯(lián)苯作為一類在工業(yè)上廣泛應(yīng)用、已造成全球性環(huán)境污染問題的人工合成有機(jī)物，可導(dǎo)致HOXA10啟動(dòng)子區(qū)域高度甲基化，同時(shí)導(dǎo)致種植窗子宮內(nèi)膜胞飲突的發(fā)育不良。

6 結(jié)語

近年來，國內(nèi)外研究者就胞飲突的結(jié)構(gòu)、發(fā)育過程、評估手段、調(diào)控方式及其與子宮內(nèi)膜容受性間的關(guān)系進(jìn)行了多角度的研究和探討。因其在評估子宮內(nèi)膜容受性方面的價(jià)值，對胞飲突的深入研究將有助于明確不孕女性胚胎植入失敗的原因，并由此為基礎(chǔ)，探索改善自然妊娠或接受IVF-ET治療患者不良妊娠結(jié)局的方法。然而目前對胞飲突的研究尚存在一定的局限性：其一，目前胞飲突的評估手段局限于掃描電鏡成像，然而因其體積較小、存在時(shí)間有限且依賴于細(xì)胞外環(huán)境提供的特定滲透條件，其空間及時(shí)間上的成像較難實(shí)現(xiàn)。因此，仍需要尋找胞飲突的特定標(biāo)志物，以實(shí)現(xiàn)對胞飲突的客觀識別及鑒定，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對不孕女性種植窗的精準(zhǔn)評估。其二，目前對胞飲突功能的研究多集中于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)，人體內(nèi)胞飲突的功能研究因倫理等因素的限制尚未進(jìn)行大規(guī)模開展。因此，對胞飲突的功能、其評估子宮內(nèi)膜容受性的機(jī)制及其調(diào)節(jié)因素亟待更多體內(nèi)研究闡明。