鹽度對紫甘藍(lán)自然發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性及品質(zhì)的影響

柳 凱，解雙瑜，李 智，孫 波

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱 150030）

紫甘藍(lán)（Purpura brassica）酸菜是以新鮮紫甘藍(lán)為原料，采用傳統(tǒng)東北酸菜發(fā)酵工藝制作，利用自然環(huán)境中各種微生物菌群以及紫甘藍(lán)原料表面附帶的一些內(nèi)生菌群進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化，進(jìn)而產(chǎn)生獨(dú)特風(fēng)味的發(fā)酵蔬菜制品[1-2]。大多數(shù)工業(yè)化生產(chǎn)或家庭自制紫甘藍(lán)酸菜通常是將紫甘藍(lán)洗凈后，浸入裝有鹽水的發(fā)酵罐中，壓實(shí)密封后，在自然狀態(tài)下進(jìn)行發(fā)酵[3]。紫甘藍(lán)由于含有大量花青素，具有較高的抗氧化特性[4]，同時(shí)具有抗癌、抗衰老等功效[5]，且經(jīng)過發(fā)酵后其口感更佳，同時(shí)富含活性乳酸菌等有益菌群，越來越受到消費(fèi)者的喜愛。

紫甘藍(lán)酸菜的發(fā)酵過程分為同型發(fā)酵和異型發(fā)酵，主要由乳酸菌主導(dǎo)[6-7]，然而，紫甘藍(lán)原料中附帶的其它內(nèi)生菌群種類繁多，對其發(fā)酵至關(guān)重要。早期對于紫甘藍(lán)酸菜中微生物群落的鑒定多采用傳統(tǒng)平板分離法，而這種方法存在較大的局限性，無法檢出所有的微生物，使微生物菌群數(shù)量和多樣性偏低。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的不斷進(jìn)步，16S rRNA 高通量測序技術(shù)現(xiàn)已應(yīng)用于各種發(fā)酵食品的細(xì)菌多樣性研究中，例如泡菜[8]、酸蘿卜[9]、香腸[10]、豆醬[11]等，在甘藍(lán)泡菜等發(fā)酵蔬菜方面對微生物群落的研究也逐漸增多。Zabat 等[12]利用16S rRNA 擴(kuò)增子測序技術(shù)分析甘藍(lán)泡菜發(fā)酵過程中的微生物群落變化，結(jié)果表明，明串珠菌（Leuconostoc）和乳酸菌（Lactobacillus）是甘藍(lán)泡菜發(fā)酵過程中主要的優(yōu)勢菌群。Liu 等[13]收集了10種中國發(fā)酵蔬菜，利用16S rRNA 測序研究細(xì)菌多樣性，鑒定出12 個(gè)門、223 個(gè)屬、348 個(gè)種，其中厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）是主要的優(yōu)勢菌門，而乳桿菌（Lactobacillus）、植物乳桿菌（Lactobacillus versmoldensis）、芽孢桿菌（Bacillus）、魏斯氏菌（Weissella）是厚壁菌門中的優(yōu)勢菌屬，色鹽桿菌屬（Chromohalobacter japonicus）、鹽單胞菌（Halomonas jeotgali）、片球菌屬（Pediococcus）、弧菌屬（Vibrio）是變形菌門中的優(yōu)勢菌屬。

鹽在紫甘藍(lán)酸菜發(fā)酵過程中起著至關(guān)重要的作用，其能夠提供一定的滲透壓力，使細(xì)胞中的水分和可溶性固形物外滲，同時(shí)也對微生物群落的生長有一定的影響[14]。由于紫甘藍(lán)中各種內(nèi)生菌群對鹽度的敏感程度不同，因此鹽度對于紫甘藍(lán)酸菜中微生物群落結(jié)構(gòu)以及優(yōu)勢菌屬的生長順序會有極大的影響[15-17]，進(jìn)而對其風(fēng)味及品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。鹽度過高，一些耐鹽性較差的異型發(fā)酵乳酸菌的生長受到抑制，這使得紫甘藍(lán)酸菜發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌群的生長順序發(fā)生改變[18]，同時(shí)導(dǎo)致紫甘藍(lán)酸菜的發(fā)酵速率變慢；鹽度過低，導(dǎo)致病原微生物和腐敗微生物的生長繁殖不能得到有效控制[19]，同時(shí)會減緩?fù)腿闂U菌的生長，甚至?xí)?dǎo)致紫甘藍(lán)酸菜的腐爛。因此，適宜的鹽度水平才能使得紫甘藍(lán)酸菜中乳酸菌快速增長，同時(shí)使有害微生物的生長得到有效抑制[20]，進(jìn)而促進(jìn)紫甘藍(lán)酸菜的正常發(fā)酵，保證紫甘藍(lán)酸菜的產(chǎn)品質(zhì)量以及獨(dú)特風(fēng)味。目前，關(guān)于酸菜、泡菜等發(fā)酵蔬菜中細(xì)菌多樣性的研究雖然較多，但是不同鹽度對紫甘藍(lán)酸菜細(xì)菌多樣性的影響鮮有研究報(bào)道。

本研究在不同鹽度（1%，3%，5%，10%）下分別自然發(fā)酵紫甘藍(lán)酸菜，使用16S rRNA 擴(kuò)增子測序分析鹽度對發(fā)酵紫甘藍(lán)酸菜細(xì)菌多樣性的影響，并測定其理化特性以及感官品質(zhì)的變化，旨在研究不同鹽度下紫甘藍(lán)酸菜自然發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為提升紫甘藍(lán)酸菜的品質(zhì)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紫甘藍(lán)，購于黑龍江省哈爾濱市香坊區(qū)忠君連鎖超市；TIANamp Bacteria DNA Kit 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、溶菌酶，北京天根生化科技有限公司；瓊脂糖，西班牙biowest 公司；食鹽，中國鹽業(yè)集團(tuán)有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸、氨水、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅、正辛醇、3，5-二硝基水楊酸（均為分析純級），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Illumina NovaSeq6000 PE250 高通量測序儀，美國Illumina 公司；UVP 凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；DYY-10C 電泳儀，北京市六一儀器廠；FA2004 電子天平（0.001 g），上海衡平儀器儀表廠；PHS-3C 型精密pH 計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TU-1800 型紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DH2500A 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料制備 選擇色澤鮮艷的新鮮紫甘藍(lán)，去除根部和爛葉，再用清水沖洗干凈，然后切絲。稱取切絲后的紫甘藍(lán)2 kg，分別裝入4 個(gè)洗凈的5 L 玻璃罐中，邊放菜邊進(jìn)行壓實(shí)，再分別加入等量鹽度為1%，3%，5%，10%的鹽水，鹽水需完全覆蓋紫甘藍(lán)原料，然后在20 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵60 d。

1.3.2 樣品采集 在發(fā)酵第3，30，60 天時(shí)在玻璃罐的同一部位進(jìn)行取樣，以保證每次取樣的一致性，移取紫甘藍(lán)酸菜鹽水發(fā)酵液50 mL 置于無菌離心管中，用于細(xì)菌多樣性的測定與分析。同時(shí)，在玻璃罐的同一位置，于發(fā)酵第0，3，15，30，45，60 天時(shí)進(jìn)行取樣，收集紫甘藍(lán)酸菜的鹽水發(fā)酵液50 mL 和酸菜樣品50 g，用于pH 值、總酸、還原糖含量、亞硝酸鹽含量以及感官品質(zhì)的測定和分析。

1.3.3 總DNA 提取及高通量測序 采用TIANamp Bacteria DNA Kit 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒進(jìn)行提取，然后使用1%瓊脂糖凝膠電泳定量檢測DNA 樣品的純度、完整性、片段大小和濃度，檢測電壓為100 V，電泳時(shí)間為40 min。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳所測定的質(zhì)量濃度，使用無菌水稀釋紫甘藍(lán)酸菜樣本DNA 至1 ng/μL。以上述基因組DNA為模板，使用特異引物（314F 5′-CCTAYGGGRBGCASCAG -3′ 和 806R 5′ -GGACTACN -NGGGTATCTAAT-3′）擴(kuò)增出16S V3-V4 區(qū)域的16S rRNA 基因。每個(gè)擴(kuò)增體系由30 μL 混合物組成，其中包含15 μL Phusion Master Mix（2×），3 μL 引物，10 μL 模板DNA（1 ng/μL），2 μL 水。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：首先進(jìn)行98 ℃變性1 min，然后進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)步驟（98 ℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s；72 ℃，5 min）。每個(gè)紫甘藍(lán)酸菜樣本DNA 重復(fù)3 次操作，然后根據(jù)PCR 產(chǎn)物的濃度，將3 次所重復(fù)的紫甘藍(lán)酸菜樣本PCR 產(chǎn)物進(jìn)行等量混樣。將上述紫甘藍(lán)酸菜樣本PCR 產(chǎn)物進(jìn)行充分混勻后，使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，檢測電壓為80 V，電泳時(shí)間為40 min。

1.3.4 理化特性測定 紫甘藍(lán)酸菜鹽水發(fā)酵液的pH 值用pH 計(jì)進(jìn)行測定，并使用pH 值分別為4.00，6.86，9.18 的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液進(jìn)行校準(zhǔn)?？偹釁⒖糋B 12456-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測定》中的pH 計(jì)電位滴定法進(jìn)行測定。還原糖含量參考NY/T 2742-2015《水果及制品可溶性糖的測定3，5-二硝基水楊酸比色法》進(jìn)行測定。亞硝酸鹽含量參照GB 5009.33-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中紫外分光光度法進(jìn)行測定。

1.3.5 感官評價(jià) 參考GB 2714-2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 醬腌菜》和DBS22/025-2014《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 酸菜》中的感官質(zhì)量評鑒細(xì)則，選用10名專業(yè)人員組成評價(jià)小組，對不同鹽度下紫甘藍(lán)酸菜樣品進(jìn)行氣味、滋味、質(zhì)地、色澤的感官評價(jià)，依次按照30%，30%，20%，20%的權(quán)重計(jì)算出總分。稱取50 g 樣品，置于盤中，觀察其色澤和質(zhì)地，聞其氣味，漱口后品其滋味。樣本按隨機(jī)順序進(jìn)行盲測試驗(yàn)，在每次隨機(jī)測試之前，用清水沖洗口腔后，再品嘗下一個(gè)樣品，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 紫甘藍(lán)酸菜感官品質(zhì)評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory quality evaluation standard of fermented red cabbage

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)QIIME（V 1.9.1）質(zhì)量控制程序，在特定條件下對原始序列進(jìn)行質(zhì)量過濾，得到高質(zhì)量的清潔數(shù)據(jù)（Clean Tags）。使用UCHIME 算法將上述序列與Silva 參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，去除嵌合體，最終獲得有效序列。對所有紫甘藍(lán)酸菜樣本的全部有效序列基于一定相似度的分類單元（Operational taxonomic units，OTUs）進(jìn)行聚類，再對OTUs 序列進(jìn)行物種注釋。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 分析處理，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行顯著性分析，當(dāng)顯著水平P＜0.05 時(shí)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Origin 9.0 軟件處理作圖，所有試驗(yàn)重復(fù)測定3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜細(xì)菌多樣性分析

2.1.1 不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜細(xì)菌多樣性序列數(shù)據(jù)概述 如表2 所示，不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜中細(xì)菌OTUs 數(shù)目的變化有所不同，其中1%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜OTUs 數(shù)目呈現(xiàn)先升高后減小的趨勢，3%和5%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜則呈現(xiàn)先減少后升高的趨勢，而10%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜的OTUs 數(shù)目隨著發(fā)酵時(shí)間不斷增大。除觀察OTUs數(shù)目外，Shannon 指數(shù)值和Simpson 指數(shù)值越大，說明細(xì)菌群落多樣性越高；Chao1 指數(shù)值和ACE指數(shù)值越大，代表物種豐度越大。對不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品中細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行分析，隨著紫甘藍(lán)酸菜發(fā)酵的不斷進(jìn)行，1%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品的細(xì)菌群落多樣性呈現(xiàn)先升高后減小的趨勢，而3%，5%和10%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜則呈現(xiàn)先減少后升高的趨勢。對不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品中細(xì)菌群落的豐度進(jìn)行分析，隨著發(fā)酵時(shí)間的推移，1%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品的細(xì)菌群落豐度呈現(xiàn)先升高后減小的趨勢，3%和5%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品則呈現(xiàn)先減少后升高的趨勢，而10%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品雖呈現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢，但其豐度始終較低，這可能與其鹽度較高有關(guān)。所有紫甘藍(lán)酸菜樣本的測序深度指數(shù)均在0.999 以上，這說明測序所得的結(jié)果能夠完整地反映紫甘藍(lán)酸菜樣品細(xì)菌群落組成的全部信息。綜上所述，不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜細(xì)菌群落組成較為豐富，物種多樣性存在明顯差異。

表2 不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品的細(xì)菌群落的α-多樣性Table 2 α-Diversity of bacterial community in naturally fermented red cabbage samples under different salt concentrations

2.1.2 不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜物種多樣性曲線分析 由稀釋曲線圖（圖1）可以看出，隨著測序數(shù)據(jù)量的增加，OTUs 數(shù)前期急劇增長，最后曲線趨于平坦，這表明測序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的物種，說明紫甘藍(lán)酸菜樣品中大多數(shù)的細(xì)菌類型都能夠被鑒定出來，測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種。圖2 中的等級聚類曲線寬度較大，趨勢較為平緩，這表明紫甘藍(lán)酸菜樣品中的物種豐富度較高，物種分布也較為均勻。

圖1 不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜在不同發(fā)酵時(shí)期細(xì)菌群落的稀釋曲線Fig.1 Dilution curves of bacterial communities of naturally fermented red cabbage under different salt concentrations during different fermentation periods

圖2 不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜在不同發(fā)酵時(shí)期細(xì)菌群落的等級聚類曲線Fig.2 The hierarchical clustering curve of the bacterial community of naturally fermented red cabbage under different salt concentrations at different fermentation periods

2.1.3 不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜細(xì)菌群落組成分析 對不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜在不同發(fā)酵時(shí)期的各樣品中細(xì)菌的OTUs 在門水平上進(jìn)行分析，得到物種組成比例情況，詳細(xì)結(jié)果如圖3 所示。高通量測序結(jié)果表明，所有紫甘藍(lán)酸菜樣品的細(xì)菌群落中的主要菌門包括厚壁菌門、變形菌門、疣菌門（Verrucomicrobiota）、擬桿菌門（Bacteroidota）、彎曲桿菌門（Campilobacterota）、放線菌門（Actinobacteriota）、未識別的細(xì)菌（unidentified_Bacteria）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、棲熱菌門（Deinococcota）、脫硫桿菌門（Desulfobacterota）等。其中，優(yōu)勢菌群為厚壁菌門、變形菌門。在整個(gè)自然發(fā)酵過程中，4 個(gè)鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品中均由變形菌門和厚壁菌門起主導(dǎo)作用，這也與之前報(bào)道的中國傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中細(xì)菌多樣性動(dòng)態(tài)變化的相關(guān)研究一致，例如泡菜[21]、鹽菜[22]、酸辣椒[23]。隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，4 種鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品中的厚壁菌門均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，而變形菌門則呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢。發(fā)酵初期，10%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品中厚壁菌門的相對豐度最小，變形菌門的相對豐度最大。發(fā)酵中期，4 種鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品中厚壁菌門的相對豐度均達(dá)到最大值，而變形菌門的相對豐度則為最小值，并且隨著鹽度的增大，厚壁菌門的相對豐度不斷增加，變形菌門的相對豐度不斷減小。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，10%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品中厚壁菌門的相對豐度最大，而變形菌門的相對豐度最小，并且厚壁菌門與變形菌門隨鹽度的變化趨勢與發(fā)酵中期基本一致。

圖3 不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜在不同發(fā)酵時(shí)期門水平上的物種分布Fig.3 Species distribution of naturally fermented red cabbage under different salt concentrations at the phylum level during

對不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜不同發(fā)酵時(shí)期的各紫甘藍(lán)酸菜樣品細(xì)菌的OTUs 在屬水平上進(jìn)行分析，得到物種組成比例情況，詳細(xì)結(jié)果如圖4 所示。在不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品中，以高豐度檢測到的屬包括乳桿菌屬、腸桿菌屬（Enterobacter）、乳球菌屬（Lactococcus）、明串珠菌屬、沙雷氏菌屬（Serratia）、魏斯氏菌屬、泛菌屬（Pantoea）、哈夫尼亞-肥桿菌屬（Hafnia-Obesumbacterium）、鏈球菌屬（Streptococcus）、杜氏桿菌屬（Dubosiella）等。如圖4 所示，不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜在發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬、腸桿菌屬、乳球菌屬以及明串珠菌屬，這也與之前報(bào)道的傳統(tǒng)自制東北酸菜中細(xì)菌多樣性基本保持一致[24]。在發(fā)酵前期，1%，3%，5%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品的優(yōu)勢菌屬分別是乳桿菌屬、腸桿菌屬，而10%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品中乳桿菌屬的相對豐度較低，主要由腸桿菌屬和明串珠菌屬主導(dǎo)。隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，1%，3%，5%，10%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品的乳桿菌屬呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在發(fā)酵中期達(dá)到峰值。然而，在發(fā)酵中后期，乳桿菌屬的下降趨勢并不大，與中期的最大峰值基本保持一致。出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能是紫甘藍(lán)酸菜在自然發(fā)酵過程中由于乳桿菌屬迅速增殖，有機(jī)酸不斷積累使得耐酸性較差的微生物生長受到抑制[25]。乳酸菌對于食品的風(fēng)味和質(zhì)地等特性有重要的影響，能夠提供酸味，同時(shí)與醇、醛和酮等化合物相互作用以產(chǎn)生更多獨(dú)特的風(fēng)味，并且乳酸菌與人體健康息息相關(guān)，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗癌等生物功能特性[26]。另外，4 種鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品中的腸桿菌屬呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在發(fā)酵中期達(dá)到最小值，這可能與紫甘藍(lán)原料自身附著的微生物菌群有關(guān)[27]。值得注意的是，相較于其它鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品，1%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品中乳球菌屬的豐度相對較高，在發(fā)酵第3，30，60 天分別達(dá)到0.205，0.191，0.256，這可能是由于乳球菌屬的生長繁殖更適合較低的鹽度環(huán)境。明串珠菌屬在紫甘藍(lán)酸菜的整個(gè)自然發(fā)酵過程相對含量都比較豐富，對紫甘藍(lán)酸菜的發(fā)酵起著促進(jìn)作用，其在1%，5%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜中隨著發(fā)酵時(shí)間的增長呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，而在3%，10%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜中呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。

圖4 不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜在不同發(fā)酵時(shí)期中屬水平上的物種分布（前10）Fig.4 Species distribution of red cabbage naturally fermented under different salt concentrations at the genus level during different fermentation periods（Top 10）

2.1.4 不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜細(xì)菌多樣性PCA 分析 采用主成分分析（PCA）來反映不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異和距離，兩個(gè)樣本在圖中的位置越近，它們之間的細(xì)菌組成越相似。在4 種鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品中，每種樣品在不同發(fā)酵時(shí)期的細(xì)菌群落組成具有顯著性差異（P<0.05）。如圖5 所示，橫、縱坐標(biāo)PC1 和PC2 分別表示第1主成分和第2 主成分，第1 主成分對樣品的貢獻(xiàn)為17.13%，第2 主成分為14.86%。相較于其它兩種鹽度，1%和10%鹽度下自然發(fā)酵的第3，30，60天的紫甘藍(lán)酸菜樣品之間的距離相對較近，說明該鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜在發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為相似；3%和5%鹽度下自然發(fā)酵的第3，30，60 天的紫甘藍(lán)酸菜樣品之間的距離相對較遠(yuǎn)，說明該鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜在發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異比較大。發(fā)酵前期，5%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品中細(xì)菌群落組成與其它3 種鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品相距較遠(yuǎn)，表明其細(xì)菌群落組成與其它3 組存在一定的差異；發(fā)酵中期，3%，5%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品之間聚集較為緊密，說明2種鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品中細(xì)菌群落組成差異并不大，而1%，10%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品中距離其它2 種鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品較遠(yuǎn)，表明其細(xì)菌群落的組成與其它2 組相差較大；發(fā)酵后期過程中，4 種鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品比較分散，說明4組紫甘藍(lán)酸菜樣品的細(xì)菌群落存在顯著性差異。

圖5 不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜在不同發(fā)酵時(shí)期中PCA 分析Fig.5 PCA analysis of naturally fermented red cabbage under different salt concentrations during different fermentation periods

2.2 不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜理化特性的變化

由圖6a 和圖6b 可知，不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜在自然發(fā)酵過程中pH 值隨發(fā)酵時(shí)間呈下降趨勢，在發(fā)酵前期下降迅速，發(fā)酵后期下降的速度又逐漸緩慢。發(fā)酵30 d 直至發(fā)酵結(jié)束，pH 值的變化沒有顯著性差異，發(fā)酵結(jié)束時(shí)1%，3%，5%，10%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜的pH值分別為3.36，3.27，3.32，3.42。相應(yīng)的，4 種鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜中總酸均隨發(fā)酵時(shí)間增加，最終1%，3%，5%，10%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜的總酸分別保持在1.26，1.63，1.42，0.9 g/100 mL。這是由于乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠球菌屬、鏈球菌屬、魏斯氏菌屬等能夠產(chǎn)生乳酸的乳酸菌在紫甘藍(lán)酸菜的發(fā)酵前期豐度較低，使得總酸的含量較低。然而，在紫甘藍(lán)酸菜發(fā)酵的中后期，乳桿菌屬迅速增殖，產(chǎn)酸量持續(xù)增大，同時(shí)隨著總酸的持續(xù)增大，一些耐酸性較差的菌群和雜菌的豐度逐漸減小，使得乳桿菌在發(fā)酵中后期占據(jù)著絕對優(yōu)勢地位。

如圖6c 所示，4 種鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜在自然發(fā)酵過程中還原糖的變化隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，這可能與不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜中還原糖的溶出速率不同有關(guān)。發(fā)酵初期，由于細(xì)胞中的還原糖還沒有完全溶出，因此還原糖的含量較低。此時(shí)，乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠球菌屬、鏈球菌屬、魏斯氏菌屬等能夠產(chǎn)生乳酸的乳酸菌由于沒有足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，生長速度較為緩慢。隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，還原糖在鹽的脅迫下溶出速率不斷增大，在發(fā)酵第3 天達(dá)到最大值。發(fā)酵后期，4 種鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜中乳桿菌屬迅速增殖，還原糖也隨其增長不斷被消耗，最后轉(zhuǎn)化為乳酸。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，乳桿菌屬的豐度已經(jīng)穩(wěn)定在最大值附近，使得還原糖已經(jīng)消耗至較低值，這同時(shí)也表明4種鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜基本發(fā)酵成熟。

紫甘藍(lán)酸菜中的亞硝酸鹽含量與產(chǎn)品的安全性息息相關(guān)，因?yàn)閬喯跛猁}食用過多，會導(dǎo)致高鐵血紅蛋白癥，增加癌癥的發(fā)病率，甚至可能會致死[28]。由圖6d 可以看出，4 種鹽度下紫甘藍(lán)酸菜在自然發(fā)酵過程中亞硝酸鹽的變化隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行先升高，并在發(fā)酵前期達(dá)到最大值，然而，最終4 種鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜中的亞硝酸鹽都降低至較低水平，并趨于平穩(wěn)。本研究中所有紫甘藍(lán)酸菜樣品中的亞硝酸鹽含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)和世界衛(wèi)生組織推薦的攝入量，因此本研究中的紫甘藍(lán)酸菜樣品均達(dá)到安全可食用的標(biāo)準(zhǔn)。在紫甘藍(lán)酸菜的發(fā)酵前期，一些硝酸鹽還原菌快速增殖，使得亞硝酸鹽含量急速增長。到了發(fā)酵中期，乳酸菌的大量繁殖使得還原硝酸鹽的細(xì)菌生長受到抑制，同時(shí)乳酸菌能夠?qū)喯跛猁}還原成二氧化氮、一氧化氮和氮?dú)鈁29]。

圖6 不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜在發(fā)酵過程中理化特性的變化Fig.6 Changes in physicochemical properties of naturally fermented red cabbage under different salt concentrations during the fermentation process

2.3 不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜細(xì)菌多樣性與理化特性的相關(guān)性

不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品中所產(chǎn)生的細(xì)菌與理化特性的關(guān)系如圖7 所示。乳桿菌豐度與pH 值呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），腸桿菌屬與pH 值呈顯著正相關(guān)（P<0.05），魏斯氏菌屬與pH 值呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。魏斯氏菌屬、不明線粒體與總酸呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。鏈球菌與還原糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）。乳桿菌與亞硝酸鹽含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05），阿克曼菌屬與亞硝酸鹽含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），腸桿菌屬、乳球菌屬、哈夫尼亞-肥桿菌屬、費(fèi)克蘭姆氏菌與亞硝酸鹽呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

圖7 不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜在發(fā)酵過程中理化特性與細(xì)菌多樣性的相關(guān)性熱圖Fig.7 The heat map of the correlation between the physicochemical indexes and microbial diversity of the naturally fermented red cabbage under different salt concentrations during the fermentation process

2.4 不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜感官品質(zhì)的變化

紫甘藍(lán)酸菜的感官評價(jià)能夠良好的反應(yīng)出產(chǎn)品的品質(zhì)，感官品質(zhì)與微生物的生長也有密切的聯(lián)系[30]，本文從氣味、色澤、滋味、質(zhì)地等4 個(gè)方面對不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜進(jìn)行感官評價(jià)，評分統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖8 所示。1%，3%，5%，10%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜的感官評價(jià)總分分別為6.0，9.1，7.3，5.3。其中，氣味、滋味、質(zhì)地等指標(biāo)在不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品中差異明顯，而色澤無顯著性差異。在氣味指標(biāo)中，3%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品氣味醇厚柔和，而1%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜則帶有少許腐爛氣息。3%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品滋味中酸味較為柔和，而10%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品則帶有一些苦味。不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜質(zhì)地變化顯著（P<0.05），其中3%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品質(zhì)地較脆，咀嚼性最佳，而10%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品質(zhì)地略微有些軟爛，1%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品較硬。綜上所述，3%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品感官評價(jià)總體最佳，10%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品感官評價(jià)總體較差。

圖8 不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜的感官評價(jià)分布圖Fig.8 Sensory evaluation distribution map of naturally fermented red cabbage under different salt concentrations

3 結(jié)論

通過16S rRNA 擴(kuò)增子測序技術(shù)，在不同鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜樣品中檢測出大量有效序列，其具有豐富的細(xì)菌多樣性，其中變形菌門和厚壁菌門是紫甘藍(lán)酸菜自然發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌門，而乳桿菌屬、腸桿菌屬、乳球菌屬以及明串珠菌屬是紫甘藍(lán)酸菜自然發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌屬。鹽度對于紫甘藍(lán)酸菜自然發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌屬的順序以及含量有顯著影響，PCA 分析的結(jié)果也表明其細(xì)菌多樣性存在顯著性差異。相關(guān)性結(jié)果表明，乳桿菌屬、腸桿菌屬、乳球菌屬、魏斯氏菌屬、鏈球菌屬、阿克曼菌屬與pH 值、總酸、還原糖含量以及亞硝酸鹽含量等理化特性的相關(guān)性較大。相對于1%，5%，10%鹽度，3%鹽度下自然發(fā)酵的紫甘藍(lán)酸菜細(xì)菌多樣性豐度較高，總酸積累最高，還原糖的消耗速率較快，能夠快速通過亞硝酸鹽最高峰，在口感方面也是最佳選擇，較為適合紫甘藍(lán)酸菜的發(fā)酵。該研究成果能夠?yàn)樘岣咦细仕{(lán)酸菜的產(chǎn)品質(zhì)量以及產(chǎn)品安全性提供一定的參考價(jià)值。