Kisspeptin作為妊娠并發(fā)癥潛在生物標志物的研究進展

王金玉，王倩，崔趁趁，羅穎鎏，張嘯龍，張杰平，張翠蓮

（鄭州大學人民醫(yī)院／河南省人民醫(yī)院生殖中心，河南 鄭州 450003）

1996年，kisspeptin及其編碼基因KISS1首次被發(fā)現并確定為黑色素瘤轉移抑制因子［1］。KISS1基因編碼了包含145個氨基酸的多肽產物，但通常檢測到的是被蛋白酶水解后具有生物活性的kisspeptin-54、kisspeptin-14、kisspeptin-13、kisspeptin-10等多種酰胺短肽，都與共同受體KISS1R（也稱GPR54）有相似的親和力，具有相似的生物學活性及功能［2］。kisspeptin在下丘腦、胎盤、卵巢、胰腺等均有表達，KISS1R在下丘腦、胎盤、胰腺中高表達，在卵巢中低表達［2］。越來越多的研究發(fā)現，kisspeptin可通過作用于胎盤來調節(jié)滋養(yǎng)細胞的浸潤及血管重鑄，可能是預測或診斷流產、異位妊娠、妊娠糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）和子癇前期的潛在生物標志物［3-6］。本文對其相關機制進行歸納，以期為妊娠并發(fā)癥的預測及診斷提供理論依據。

1 Kisspeptin在妊娠過程中的生理作用及機制

1.1 Kisspeptin參與妊娠的建立與維持孕期循環(huán)kisspeptin（kisspeptin-54）主要來自胎盤，與未妊娠婦女相比，孕早期婦女kisspeptin-54增加900倍，孕晚期增加7 000倍，分娩后5 d內恢復正常［7］。由此推測，一定水平的kisspeptin對妊娠的建立與維持有重要的作用。

1.2 Kisspeptin與滋養(yǎng)層細胞侵襲胎盤中主要是滋養(yǎng)層細胞分泌kisspeptin，可抑制滋養(yǎng)層細胞的遷移與侵襲。孕早期滋養(yǎng)層細胞通過分泌基質金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）降解細胞外基質中Ⅳ型和Ⅴ型膠原蛋白，在促進滋養(yǎng)層細胞遷移與侵襲中起著重要作用［8］。MMP可被MMP組織抑制因子（tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP）滅活［9］。分離并培養(yǎng)人工終止妊娠獲得的胎盤滋養(yǎng)層細胞，發(fā)現kisspeptin-10通過刺激細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ErK1／2）磷酸化，抑制滋養(yǎng)層細胞中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-10、MMP-14以及血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）的表達并增加TIMP-1、TIMP3的表達，從而抑制滋養(yǎng)層細胞對子宮內壁的侵襲［9］。kisspeptin-10通過刺激細胞外調節(jié)蛋白激酶-P90核糖體S6激酶-糖原合成酶激酶3β-黏著斑激酶（ErK1／2-p90rsk-GSK3β-FAK）反饋信號通路，使MMP表達下調，從而抑制人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞（HTR-8／SVneo）的遷移［10］。有研究顯示人孕早期、早產胎盤的KISS1／KISS1R表達高于足月胎盤，說明隨著胎盤成熟，胎盤滋養(yǎng)細胞的侵襲力逐漸下降，KISS1表達也逐漸降低，然而，隨孕周增加，循環(huán)kisspeptin水平升高［11-12］。因此，未來需要研究人胎盤KISS1／KISS1R水平逐漸降低而循環(huán)kisspeptin水平逐漸升高的相關機制。

1.3 Kisspeptin與胎盤血管Kisspeptin屬于抗血管生成因子，與促血管生成因子（如VEGF-A）共同參與胎盤良好發(fā)育和子宮螺旋動脈重鑄。有研究通過離體培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞，發(fā)現過表達的kisspeptin-10通過刺激人臍靜脈內皮細胞中的ERK1／2通路，抑制VEGF-A活性及血管內皮增殖與新生血管發(fā)生，導致胎盤功能障礙［13］。

1.4 Kisspeptin與胚胎植入小鼠囊胚存在kisspeptin和KISS1R，kisspeptin-10增加了小鼠囊胚對Ⅰ型膠原蛋白（胎盤細胞外基質的主要成分）的黏附，由此推測kisspeptin-10可能促進小鼠胚胎著床［14］。Radovick等［15］將KISS1正常表達的小鼠胚胎植入KISS1基因敲除的小鼠子宮但未能成功種植，發(fā)現子宮KISS1／KISS1R系統(tǒng)通過控制小鼠子宮內膜腺體分泌物（如白血病抑制因子）調節(jié)胚胎植入，而這些分泌物對于胚胎黏附到子宮上皮細胞至關重要。但既往單細胞RNA測序分析顯示KISS1R在人胚胎（從受精卵到囊胚階段）幾乎不表達［16］。

1.5 Kisspeptin與子宮蛻膜化人蛻膜化基質細胞表達KISS1／KISS1R系統(tǒng)，可抑制蛻膜基質細胞遷移并調控子宮內膜蛻膜化［15］。Wu等［17］分離并培養(yǎng)孕早期（6～12周）人工終止妊娠婦女的蛻膜，發(fā)現蛻膜基質細胞可分泌kisspeptin-10，并通過抑制黏著斑激酶／類固醇激素受體輔激活因子（FAK／Src）信號通路活化，刺激ErK1／2磷酸化，從而抑制其下游MMP表達，最終抑制蛻膜基質細胞的運動。進一步研究表明kisspeptin-10可以協(xié)同孕酮通過Notch1／ERK1／2信號通路調控子宮內膜蛻膜化［18］。

1.6 Kisspeptin與子宮肌層熒光免疫組化結果顯示KISS1R主要分布在妊娠大鼠子宮平滑肌層，并發(fā)揮抑制宮縮作用［19］。但逆轉錄聚合酶鏈反應和免疫組化結果顯示育齡非妊娠期婦女及絕經后婦女的子宮肌層不存在KISS1／KISS1R系統(tǒng)［20］。孕婦子宮肌層是否存在KISS1／KISS1R尚待研究。

1.7 Kisspeptin與妊娠免疫體外研究顯示kisspeptin-54通過抑制產生白細胞介素17的T淋巴輔助細胞和Th1細胞，抑制細胞毒性反應，促進形成2型免疫反應保護胎兒，并誘導外周血CD4+T淋巴細胞分化為調節(jié)性T細胞，協(xié)同母體對胎兒的免疫耐受［20］。

1.8 Kisspeptin與分娩免疫組化結果顯示大鼠預產期（妊娠21 d）腦室周圍核投射到視上核的核周區(qū)中kisspeptin-10上調，進一步研究發(fā)現腦室內注射kisspeptin-10后提高了孕晚期（妊娠18～21 d）大鼠催產素神經元的放電率，證實kisspeptin-10在分娩時可激活催產素神經元［21］。研究顯示足月經陰道分娩胎盤中KISS1水平高于足月剖宮產胎盤，推測KISS1可能參與人胎盤局部分娩［12］，但具體機制尚未闡明。

2 Kisspeptin在妊娠維持中的作用及機制

2.1 Kisspeptin在流產中的作用及機制Kisspeptin是預測／診斷自然流產（spontaneous abortion，SAB）的潛在生物標志物，SAB患者循環(huán)kisspeptin水平及胎盤局部KISS1／KISS1R表達均降低［5，22-24］。目前主要通過連續(xù)檢測血清人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，HCG）預測／診斷流產，但孕早期HCG波動范圍較大，無法找到確診流產的臨界值［22］，因此，研究預測流產的新型生物標志物非常有必要。Abbara等［5］通過前瞻性巢式病例對照研究納入孕早期（＜14周）SAB（n＝95 173）與正常妊娠（n＝265 557）孕婦，采用放射免疫法測定kisspeptin（kisspeptin-54、kisspeptin-14、kisspeptin-13、kisspeptin-10）水平，發(fā)現SAB組循環(huán)kisspeptin水平低于正常妊娠組，在診斷SAB中，孕周＜8周時kisspeptin和HCG的診斷性能相似，但孕周≥8周時kisspeptin的診斷性能有高于HCG的趨勢。劉林麗等［23］通過meta分析納入3個巢式病例對照研究、2個病例對照研究和1個前瞻性隊列研究，發(fā)現SAB組（n＝157）循環(huán)kisspeptin水平低于正常妊娠組（n＝1 018）。Colak等［24］通過免疫組化檢測發(fā)現SAB組胎盤KISS1水平降低。此外，實時熒光定量PCR、Westernblot和免疫組化結果也證實kisspeptin、KISS1R在復發(fā)性流產婦女絨毛組織中同樣呈低表達［25］。

在胚胎植入過程中，胚胎滋養(yǎng)層可識別、黏附、侵入子宮內膜，同時子宮內膜發(fā)生蛻膜反應，使滋養(yǎng)層細胞與母體建立緊密聯系。破壞胚胎植入過程中的任一環(huán)節(jié)，可能影響妊娠結局。研究發(fā)現低水平kisspeptin-10可使ErK1／2磷酸化，下調MMP、VEGF-A的表達，使滋養(yǎng)層細胞侵襲減少70%，造成胚胎淺著床甚至著床失敗，最終發(fā)生SAB［5］及復發(fā)性流產（recurrent spontaneous abortion，RSA）［25］。低水平kisspeptin-10抑制FAK／Src信號通路活化，導致子宮蛻膜基質細胞遷移能力減退［5］。流產婦女蛻膜組織中kisspeptin-10與蛻膜化相關的Notch1通路相關靶基因表達呈一致性，推測kisspeptin-10調控脫膜化的機制與Notch1通路有關［18］。Kisspeptin-10能促進體外培養(yǎng)的牦牛卵巢顆粒細胞分泌孕酮［26］，孕酮通過作用于妊娠淋巴細胞表達的孕酮受體產生孕激素誘導阻斷因子（progesterone-induced blocking factor，PIBF），對妊娠免疫起到保護作用，而流產孕婦母胎kisspeptin-10與PIBF表達均下降且二者水平呈正相關，可能是妊娠免疫異常導致流產的機制之一［27］。盡管研究推測妊娠大鼠子宮肌層KISS1R表達降低導致異常宮縮可能是流產的機制之一［28］，但人孕期子宮肌層是否存在KISS1R表達尚待研究。

2.2 Kisspeptin在異位妊娠中的作用及機制循環(huán)kisspeptin水平是孕早期篩查異位妊娠（ectopic pregnancy，EP）的潛在生物標志物。盡管目前EP診斷方法為經陰道超聲檢查和連續(xù)測定HCG，但假陽性和假陰性的情況仍會發(fā)生［22］，因此，尋找其他生物標志物以期早期診斷EP十分有必要。Romero-Ruiz等［6］通過放射免疫分析法測定循環(huán)kisspeptin（kisspeptin-54、kisspeptin-14、kisspeptin-10），結果顯示人孕早期（＜12周）EP患者kisspeptin水平降低并且與胎盤組織中KISS1水平呈正相關，胎盤缺陷和EP組織中miR324-3p／KISS1信號通路失控，從而導致kisspeptin水平降低，說明kisspeptin可以作為孕早期篩查EP的潛在生物標志物。而大鼠輸卵管KISS1高表達可以預防EP［29］。目前，人孕早期kisspeptin失調與EP的具體機制有待進一步研究完善。

2.3 Kisspeptin在子癇前期中的作用及機制子癇前期（preeclampsia，PE）滋養(yǎng)細胞浸潤功能損傷并且子宮螺旋動脈無法正常重鑄，從而使流向絨毛間隙的血流減少，螺旋動脈無法充分轉化為低阻力血管，存在引發(fā)妊娠高血壓疾病以及胎兒缺氧的危險［30］。Kisspeptin-10可用于診斷PE和評估PE嚴重程度。研究顯示PE組在孕中期和／或孕晚期的kisspeptin-10水平低于正常妊娠組，提示kisspeptin-10可能是診斷PE的生物標志物［30-31］。孕中期（孕25周）低水平kisspeptin-10的PE組胎兒臍動脈收縮期流速／舒張期流速比值（S／D）和阻力指數低于正常對照組胎兒，提示循環(huán)kisspeptin-10可以做為胎盤灌注血運不佳的指標，以便早期識別胎盤源性疾病，提高母胎質量［30］。并且，孕晚期PE組循環(huán)kisspeptin-10水平與24 h尿蛋白、平均動脈壓呈負相關，提示kisspeptin-10與PE的嚴重程度有關［32］。然而，免疫組化結果顯示PE組胎盤（36.3±1.8周）KISS1／KISS1R水平高于正常足月妊娠組（39.5±0.9周）［33］。因此，未來需要研究PE組孕期循環(huán)kisspeptin水平降低和胎盤KISS1／KISS1R水平升高這一矛盾現象的機制。

Kisspeptin調控PE的機制有以下幾點。胎盤局部高表達的KISS1可下調胎盤中MMP和VEGF-A的表達［4］，使胎盤滋養(yǎng)細胞侵襲不足及胎盤血管發(fā)育不良，胎盤缺血缺氧導致氧化應激反應，氧化應激是指體內氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)，這種狀態(tài)可影響胎盤形成過程中滋養(yǎng)細胞的活力、增殖和侵襲，最終導致胎盤淺著床［34］。研究顯示抑制KISS1表達可通過介導HTR-8／SVneo細胞中磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B／哺乳動物雷帕霉素蛋白（PI3K／AKT／mTOR）途徑，減弱過氧化氫引起的細胞自噬和凋亡，增強滋養(yǎng)細胞活力和侵襲能力［34］，這為KISS1可能參與PE胎盤形成早期氧化應激狀態(tài)導致的胎盤淺著床提供了證據。PE組高表達的KISS1可直接抑制滋養(yǎng)細胞的增殖活力，導致其侵襲能力下降。PE產婦胎盤組織中KISS1的表達與促增殖基因Notch1、HLA-G mRNA的表達呈負相關，與抗增殖基因PHLDA2 mRNA的表達呈正相關，證實高表達的KISS1可直接抑制滋養(yǎng)細胞的增殖活力［35］。KISS1高表達可能誘導PE組滋養(yǎng)層細胞凋亡，從而導致胎盤功能障礙［4］。Bcl-2是凋亡抑制基因。Bax屬于促凋亡基因，Fas是凋亡誘導的主要分子，caspase-3是細胞凋亡標志物分子，三者均與促進細胞凋亡有關。PE產婦胎盤組織中KISS1的表達與凋亡基因bcl-2的表達呈負相關，與bax、Fas、caspase-3的表達呈正相關，證實KISS1高表達可直接促進滋養(yǎng)細胞凋亡［35］。目前，在模擬PE的病理表現方面尚缺乏理想的動物模型，PE的發(fā)病機制亟待進一步的研究和完善。

2.4 Kisspeptin在GDM中的作用及機制 胎盤向循環(huán)中釋放大量的kisspeptin，在胰島適應妊娠狀態(tài)中發(fā)揮生理作用，可通過激活胰島β細胞KISS1R受體來維持母體葡萄糖穩(wěn)態(tài)［3］。有研究發(fā)現循環(huán)kisspeptin可能是診斷和／或治療GDM 的新興生物標志物［33，36-37］。有研究采用酶聯免疫吸附測定法檢測循環(huán)kisspeptin（kisspeptin-54、kisspeptin-10）水平，結果顯示孕中晚期（26～34周）GDM組kisspeptin水平低于正常妊娠組，推測其可能作為診斷GDM的潛在指標，并對病情評估起到良好的輔助作用［36］。而且，kisspeptin是孕期調節(jié)β細胞功能的新型胎盤信號之一，為治療性干預GDM提供了方向［37］。盡管GDM的循環(huán)kisspeptin水平較低，但GDM組足月（38.5±0.6周）胎盤的KISS1／KISS1R水平高于正常妊娠組足月（39.5±0.9周）胎盤［33］。本研究以“kisspeptin、KISS1、GDM、妊娠糖尿病”為關鍵詞檢索到國內外共5篇文獻，但研究較淺顯且納入樣本量較小，無法解釋這種矛盾現象的機制。

Kisspeptin與GDM的可能機制如下。有研究將正常妊娠組和GDM組足月胎盤中分離的原代滋養(yǎng)層細胞進行體外培養(yǎng)，采用2D細胞網絡形成、細胞劃痕實驗、趨化遷移及增殖實驗探究血管調節(jié)基因的表達，發(fā)現GDM組血管生成素2、肝細胞生長因子和胎盤源性血管生成因子等促血管生成因子表達增加，而抗血管生成因子KISS1表達也增加，這種調節(jié)不平衡可能導致GDM 組胎盤血管數量增加及胎盤血管結構改變［38］。低水平循環(huán)kisspeptin導致kisspeptin依賴性β細胞代償受損及葡萄糖刺激胰島素（glucose-stimulated insulin secretion，GSIS）分泌減少，這可能是人GDM的致病因素。體外研究表明，高濃度葡萄糖（17 mmol·L-1）培養(yǎng)的人胰島和胰腺細胞系中的kisspeptin-54可以誘導GSIS分泌增加［39］。Bowe等［36］在孕婦中觀察到kisspeptin水平和β細胞功能標志物（穩(wěn)態(tài)模型2評估的胰島β細胞功能指數、GSIS水平）呈正相關。有研究選取女性非肥胖對照組［體質量指數（body mass index，BMI）＜25 kg·m-2］和肥胖組（BMI＞35 kg·m-2）進行分析，結果顯示非孕期循環(huán)kisspeptin水平與胰島素抵抗標志物［BMI、空腹胰島素和穩(wěn)態(tài)模型評估的胰島素抵抗指數］呈負相關［40］。有研究采用kisspeptin和／或ERK1／2信號通路抑制劑體外培養(yǎng)大鼠胰腺組織，發(fā)現kisspeptin對胰島β細胞凋亡具有抑制作用，ERK1／2信號通路是其中一個主要作用通路［41］。目前孕期循環(huán)kisspeptin水平與胰島素抵抗的相關性仍待闡明。

3 總結與展望

綜上所述，kisspeptin參與妊娠建立、維持以及妊娠并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的調控，循環(huán)kisspeptin水平可能作為預測或診斷流產、異位妊娠、妊娠期糖尿病和子癇前期的潛在生物標志物。但當前研究報道中的對象主要為kisspeptin-10和kisspeptin-54，其他亞型的作用情況有待進一步研究，以便確定kisspeptin能否在臨床上廣泛用于預測或診斷母體／胎兒的健康狀況。將kisspeptin與其他生物標志物（例如HCG）聯合用于預測妊娠并發(fā)癥也是未來的研究方向。到發(fā)文為止，國內外還沒有關于kisspeptin水平與其他妊娠并發(fā)癥（如多胎妊娠、前置胎盤、胎盤植入等）的研究。期待有更多該方面的研究，以期為孕產婦及嬰幼兒健康提供理論基礎。