母乳中膽鹽激活脂肪酶性質(zhì)及功能的研究進(jìn)展

楊寶嘉，蘆晶，呂加平，逄曉陽，張書文，劉妍妍

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；3.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048）

0 引言

膽鹽激活脂肪酶 (Bile salt stimulated lipase，BSSL)也被稱為羧酸酯脂肪酶和膽固醇酯酶是一種對(duì)各種脂類具有活性的酯酶，包括甘油酯、膽固醇和脂溶性維生素。早期，認(rèn)為腸腔內(nèi)的BSSL 起源于乳腺或胰腺[1]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在血小板、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和肝臟、內(nèi)皮細(xì)胞等也有表達(dá)[2]。BSSL 也是一些哺乳動(dòng)物母乳的重要組成部分，如人類、小鼠等，但不包括大鼠和牛。眾所周知，新生兒的健康快速的成長(zhǎng)需要飲用優(yōu)質(zhì)的脂肪和必需營(yíng)養(yǎng)素。然而，嬰兒外分泌胰腺在出生時(shí)是不成熟的，分泌BSSL 的含量不足以支持脂肪的充分吸收[3]。但這種脂肪吸收不良現(xiàn)象幾乎只出現(xiàn)在配方奶喂養(yǎng)的嬰兒中，母乳喂養(yǎng)則不會(huì)出現(xiàn)該情況。1977年，Olle 首次報(bào)道BSSL 在人乳中大量存在，約占人乳蛋白總量的1%[4]。

1 BSSL 的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)

理化性質(zhì)：BSSL 發(fā)揮作用的最適pH 值為7.3～8.6，但在酸性環(huán)境下也仍能發(fā)揮作用，在pH3.5，37 ℃的環(huán)境1 h 也仍能保持活性不被破壞[1]。因此，這也可以說明在其經(jīng)過胃部的酸性環(huán)境條件，到達(dá)十二指腸時(shí)BSSL 活性可以保持穩(wěn)定而不被破壞。但BSSL 對(duì)高溫敏感性極強(qiáng)，如巴氏殺菌（62.5 ℃，30 min）會(huì)使BSSL完全喪失失活，但低溫冷藏、凍融對(duì)BSSL 的活性幾乎無影響。人奶中的乳鐵蛋白可以使BSSL 活性提升近1.4 倍；毒扁豆堿和二異丙基氟磷酸對(duì)BSSL 活性具有抑制作用[5]。

基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：BSSL 基因位于9 號(hào)染色體長(zhǎng)臂端粒部分，位于9q34.3 位點(diǎn)，基因全長(zhǎng)9850 bp，具有11個(gè)外顯子和10 個(gè)內(nèi)含子[6]。BSSL 活性需要被膽鹽激活正是由于外顯子4 編碼由Gly117 至Glu130 間一致序列組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，一旦膽鹽結(jié)合后此環(huán)便移開，底物便會(huì)進(jìn)入酶活性位點(diǎn)[7]。在沒有膽鹽分子的情況下，有研究表明這種酶具有預(yù)先形成的催化位點(diǎn)和功能性氧陰離子孔[8]，這解釋了酶對(duì)水溶性酯的活性。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：母乳來源的BSSL 包含722 個(gè)氨基酸的單一肽段，含有16 個(gè)PEST 重復(fù)（重復(fù)序列為PVPPPTDSQ）[5]。BSSL 的活性位點(diǎn)是位于435 位組氨酸，320 位天冬氨酸和位于194 位絲氨酸的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)?；悄扄}是最有效的激活膽鹽激活脂肪酶的膽鹽[9]。含有1 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和9 個(gè)O-糖基化位點(diǎn)[10]，這使BSSL 在抗菌抗病毒方面具有重要作用；也正是因?yàn)锽SSL 的該結(jié)構(gòu)，有學(xué)者提出BSSL 在免疫調(diào)節(jié)方面具有潛在的功能特性。

2 影響B(tài)SSL 濃度的因素

影響母乳中BSSL 質(zhì)量濃度的因素：首先，成熟乳中BSSL 濃度大于初乳（產(chǎn)后0～3 d）中BSSL 濃度，初乳中的BSSL 質(zhì)量濃度（71.49±40.61）μg/mL[11]。胎齡對(duì)母乳中BSSL 的濃度存在影響，有學(xué)者研究了并證明了早產(chǎn)兒母親BSSL 濃度略高于足月兒母親[11]。Pamblanco M 等人[12]也認(rèn)為，胎齡可能會(huì)影響B(tài)SSL 濃度。因此我們可以認(rèn)為母乳喂養(yǎng)的早產(chǎn)兒與足月新生兒相比，可能獲得相同或更大的脂肪消化能力，從而改善能量獲取，使早產(chǎn)兒在早期生活中趕上足月嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育。其次，孕期肥胖與初乳中BSSL 濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，這可能是由于母乳中BSSL 濃度受到催乳素的影響，肥胖的母親催乳素水平較低，從而導(dǎo)致了BSSL 分泌的減少。眾所周知，孕期肥胖會(huì)增加患有孕期和產(chǎn)后并發(fā)癥的幾率，并且對(duì)胎兒和新生兒的身體健康產(chǎn)生不良影響[13]。因此，早期營(yíng)養(yǎng)過剩是肥胖和代謝綜合征的危險(xiǎn)因素，不僅會(huì)影響自身健康也會(huì)對(duì)嬰兒的健康產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。妊娠期糖尿病對(duì)初乳中BSSL 濃度有顯著影響，患有妊娠期糖尿病的母親初乳中BSSL 濃度較低，由于葡萄糖和胰島素隨著血液循環(huán)進(jìn)入母乳中[14]，母乳中葡萄糖和胰島素水平升高，可能會(huì)影響乳腺分泌BSSL。嬰兒的性別不同BSSL 濃度也存在差異，研究表示女嬰則母乳中BSSL 濃度比男嬰高10 μg/mL。最后，隨著泌乳時(shí)間的延長(zhǎng)，BSSL 濃度會(huì)隨之下降，有學(xué)者跟蹤測(cè)定了產(chǎn)后6 個(gè)月的母乳中BSSL 濃度發(fā)現(xiàn)，隨著嬰兒的成長(zhǎng)，消化系統(tǒng)的成熟，BSSL 濃度逐漸降低且有趨于零的趨勢(shì)[15]。

3 不同殺菌方法對(duì)BSSL 活性的影響

巴氏殺菌法是一種比較溫和的通過加熱的方式，殺滅生鮮乳中大多數(shù)的病原體和腐敗菌[16]。目前大部分人乳庫中都使用巴氏殺菌的方法。人乳在62.5 ℃水浴中加熱30 min，這能使人乳中大腸桿菌、陰溝腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌減少5-10 倍，但這樣的條件會(huì)導(dǎo)致乳中活性成分含量減少甚至完全喪失；BSSL 在這種殺菌條件下會(huì)完全喪失活性而免疫球蛋白的含量會(huì)顯著降低[17]。高壓處理是一種非熱加工處理的方法，是通過對(duì)整個(gè)樣品快速、均勻的加壓而達(dá)到殺菌、延長(zhǎng)保質(zhì)期等目的。高壓處理的方法可以減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失、風(fēng)味可以得到最好的保證、加工過程中污染低等眾多優(yōu)點(diǎn)[18]。紫外線照射是一種物理方法，能有效的控制微生物得污染，主要是由于紫外線對(duì)微生物的核酸產(chǎn)生光化學(xué)危害、對(duì)蛋白質(zhì)也有危害作用從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。紫外殺菌具有無化學(xué)殘留、殺菌徹底和殺菌用時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)[19]。

Koh Jeewon[20]等人通過對(duì)比γ-射線，紫外線照射，高壓處理，巴氏殺菌等殺菌技術(shù)對(duì)人乳中BSSL 活性的影響進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)巴氏殺菌BSSL 的活性降低99.7%；γ-射線處理后的樣品BSSL 活性比未經(jīng)處理的母乳相比降低了70.8%；紫外線處理后使樣品中BSSL活性降低64.7%；高壓技術(shù)處理后使樣品中BSSL 活性降低了38.4%。Wesolowska[21]等人，研究了高壓處理與巴氏殺菌對(duì)母乳中活性成分的影響，發(fā)現(xiàn)巴氏滅菌法處理后的母乳脂肪酶活性僅殘留2.1%。相比之下，在450 MPa 15 min 條件下高壓處理后發(fā)現(xiàn)，該條件下最大限度地保留了人乳中的脂肪酶。Lukas Christen[22]等人將7 種菌（阪崎氏腸桿菌、屎腸桿菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌和3 種孢子類菌種）接種人乳樣品中，然后用紫外線照射。對(duì)未經(jīng)處理和處理的樣品進(jìn)行細(xì)菌含量、BSSL 活性、堿性磷酸酶活性和脂肪酸譜分析，發(fā)現(xiàn)紫外線照射可以將母乳中的細(xì)菌含量降低到人乳庫要求的標(biāo)準(zhǔn)，該方法保留了乳中BSSL 的活性并不改變?nèi)巳榈闹舅峤M成。綜上所述，巴氏殺菌技術(shù)幾乎可以使人乳中的BSSL 完全損失，而高壓處理和紫外照射后BSSL 損失相對(duì)較少。

4 BSSL 的生物學(xué)功能性質(zhì)

4.1 BSSL 促進(jìn)脂代謝作用

BSSL 由乳腺分泌并通過乳汁提供給嬰兒，從而彌補(bǔ)內(nèi)源性脂肪酶的不足[23-24]。剛出生的嬰兒從以葡萄糖為主的能量供應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)橐灾|(zhì)為主的能量供應(yīng)。母乳中的乳脂主要在乳脂肪球中，其核心成分是甘油三脂（95%以上）被三層膜包裹[25]。除了能量，乳脂還提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如n-3 和n-6 長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸、磷脂和膽固醇，這些物質(zhì)對(duì)出生后第一年大腦和認(rèn)知功能的發(fā)展非常重要。因此，脂類的有效吸收至關(guān)重要，不僅對(duì)能量利用，對(duì)最佳生長(zhǎng)也很重要。母乳來源的BSSL 一旦被小腸上部的內(nèi)源性膽汁鹽激活，對(duì)嬰兒吸收和利用乳脂有顯著的貢獻(xiàn)[26-27]，可以將甘油三酯水解生成甘油和游離的脂肪酸。因此，BSSL 對(duì)早產(chǎn)兒的生長(zhǎng)及發(fā)育具有重要作用。眾所周知，出生后早期生長(zhǎng)缺陷可能會(huì)對(duì)未來的生長(zhǎng)、身體健康以及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和新陳代謝產(chǎn)生不利影響[28-29]。BSSL 是一種脂肪分解酶，具有廣泛的特異性可水解多種不同的底物，例如甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯、膽固醇酯和視黃酯、磷脂和神經(jīng)酰胺，可促進(jìn)食物脂肪消化和吸收。嬰兒脂肪的消化始于胃部的胃脂肪酶，由胃黏膜上主要的酶原細(xì)胞分泌。它主要位于胃底和胃體，并水解甘油三酯的sn-3 位。嬰兒胃脂肪酶活性與成人水平相似。乳脂肪膜上的磷脂在胃部不被消化，進(jìn)入十二指腸后BSSL可以進(jìn)行催化。在嬰兒早期，十二指腸中的胰腺甘油三酯脂肪酶蛋白含量低，胰腺和乳汁中的BSSL 蛋白是小腸中脂肪消化的主要脂肪酶。

嬰兒在剛出生時(shí)，胰腺外分泌功能并未完全發(fā)育，BSSL 產(chǎn)物不足以支持適當(dāng)?shù)闹疚铡Ｒ虼诵枰ㄟ^母乳提供給嬰兒，從而彌補(bǔ)內(nèi)源性脂肪酶的不足[30-31]。人乳中BSSL 的重要性已在動(dòng)物模型中得到證明。早在2008年的時(shí)候Miller Rita[32]等人進(jìn)行了動(dòng)物試驗(yàn)，喂食給小鼠純化的BSSL，發(fā)現(xiàn)BSSL 缺陷型小鼠能正常吸收脂肪，無腸道損害。BSSL 對(duì)早產(chǎn)兒的健康生長(zhǎng)和發(fā)育的重要性已有臨床試驗(yàn)證明。有報(bào)導(dǎo)將人膽汁鹽激活脂肪酶基因在小鼠中表達(dá)[33]，轉(zhuǎn)基因母鼠喂養(yǎng)的早產(chǎn)新生鼠的存活率顯著增高，并且發(fā)現(xiàn)通過對(duì)照發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因母鼠喂養(yǎng)的早產(chǎn)鼠體質(zhì)量增加了43.8%，糞便粗脂肪水平降低了33.3%。Casper Charlotte[34]等人通過臨床試驗(yàn)研究重組人BSSL 對(duì)早產(chǎn)兒生長(zhǎng)速度和脂肪吸收的影響，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)重組人BSSL 治療耐受性良好顯著改善了嬰兒的生長(zhǎng)指標(biāo)和嬰兒對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的吸收。綜上所述，BSSL 能夠促進(jìn)嬰兒對(duì)脂肪的消化吸收，并促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育且無腸道損害。

4.2 BSSL 的抗菌抗病毒作用

母乳的各種多功能性成分協(xié)同工作，為母乳喂養(yǎng)的嬰兒提供廣泛的即時(shí)的防御，提供母乳先天免疫系統(tǒng)的一部分。母乳喂養(yǎng)可以降低新生兒感染疾病的風(fēng)險(xiǎn)，是由于母乳中含有大量外來抗原和宿主因子，它們與母乳喂養(yǎng)嬰兒的食管和腸黏膜相互作用[35]。越來越多的證據(jù)表明，母乳可以保護(hù)新生兒免受感染，母乳喂養(yǎng)的嬰兒與配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒相比，因腹瀉而導(dǎo)致的發(fā)病率和死亡率均有所下降[36-37]。

早在1983年Gillin 就提出了母乳中的脂肪酶可以殺死藍(lán)氏賈第鞭毛蟲；不是依賴于分泌性免疫球蛋白A（IgG A）而是與一種不尋常的脂肪酶有關(guān)，這種脂肪酶存在于人類的乳中，但不存在于低等哺乳動(dòng)物的乳中[38]。1985年發(fā)現(xiàn)殺死藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的脂肪酶需要在膽鹽的刺激下才能完成[39]。在1986年研究發(fā)現(xiàn)這種脂肪酶就是BSSL，殺死藍(lán)氏賈第鞭毛蟲需要人乳中的BSSL 起到間接作用，BSSL 水解甘油三酯后釋放出游離脂肪酸對(duì)賈第鞭毛蟲有毒[40]。Naarding 等發(fā)現(xiàn)人乳中的BSSL 是一種攜帶Lewis X 的糖蛋白，可以結(jié)合樹突細(xì)胞上的非整合素分子，抑制HIV 病毒向CD4+T 細(xì)胞上轉(zhuǎn)移[41]。有研究證明了母乳中的巖藻糖基化寡糖能夠保護(hù)母乳喂養(yǎng)的兒童免受腹瀉的侵害[42]。Nathalie 等人研究發(fā)現(xiàn)[43]含有α1-2 連接巖藻糖的人乳BSSL 可以作為誘餌受體，阻止諾如病毒附著在胃十二指腸組織上，可以起到抑制病毒的效果。綜上所述，BSSL 在抗菌抗病毒方面發(fā)揮作用的主要原因，一方面是由于其高豐度的糖基修飾，BSSL 能夠抑制病原微生物黏附在人上皮細(xì)胞的受體。另一方面BSSL的水解產(chǎn)物是游離脂肪酸和單酰甘油酯，具有抗菌抗病毒的作用。

5 BSSL 潛在生物學(xué)功能特性

5.1 BSSL 對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

腸道菌群是定植在腸道內(nèi)的龐大微生物群落[44]。腸道菌群與Ⅱ型糖尿病[45]、心血管疾病[46]、肥胖[47]等疾病都息息相關(guān)，因此新生兒腸道菌群的建立影響其未來的身體健康。母乳是調(diào)節(jié)嬰兒腸道菌群的一個(gè)重要的因素，同時(shí)也是新生兒營(yíng)養(yǎng)的最佳來源。嬰兒腸道菌群的形成容易受到分娩方式、胎齡、喂養(yǎng)方式、免疫系統(tǒng)、家庭生活方式、地理位置以及益生菌和抗生素的使用等多種因素的影響[48]。

有研究表示，影響腸道菌群建立的最重要因素是喂養(yǎng)方式的不同，Aifric[49]等人認(rèn)為純母乳喂養(yǎng)嬰兒與配方奶喂養(yǎng)的嬰兒在腸道微生物群和生長(zhǎng)方面存在很大差異。Bezirtzoglou[50]等人使用熒光原位雜交技術(shù)對(duì)比了母乳喂養(yǎng)和配方奶喂養(yǎng)的嬰兒糞便中的微生物區(qū)別，提出采用兩種不同喂養(yǎng)方式的嬰兒，母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便微生物群中的雙歧桿菌細(xì)胞數(shù)量是配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒的兩倍多。母乳喂養(yǎng)嬰幼兒腸道菌群中雙歧桿菌數(shù)量約為99%, 其他常見菌為0.11%～1%[51]。配方奶粉喂養(yǎng)的嬰幼兒，雙歧桿菌占比量大約為40%，腸道菌群種除雙歧桿菌外, 還包括擬桿菌、腸桿菌、腸球菌和梭狀芽孢桿菌等[52]。在分析由與胃腸道相關(guān)的所有可用細(xì)菌基因組組成的參考基因組時(shí)，發(fā)現(xiàn)53%的微生物編碼的基因在糖解、蛋白水解和脂肪分解活性方面具有同等的特異性。研究表明，人奶中寡聚糖可以促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長(zhǎng)，BSSL在初乳中有豐富的寡糖修飾，這些寡聚糖不會(huì)被嬰兒消化，主要的作用是調(diào)節(jié)腸道菌群[53]。因此，我們可以認(rèn)為嬰兒腸道菌群的建立及成熟的過程中BSSL 發(fā)揮潛在的調(diào)作用。

5.2 BSSL 的免疫調(diào)節(jié)作用

新生嬰兒免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，容易受到病原微生物及其他有害因素的侵害。在嬰兒免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)尚未發(fā)育完全之前，母乳的攝入十分重要；母乳中含有大量的免疫成分[54]，包括：（1）促進(jìn)免疫發(fā)育的細(xì)胞:巨噬細(xì)胞、噬中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞；（2）促進(jìn)免疫發(fā)育的成分：細(xì)胞因子、長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸、核苷、生長(zhǎng)因子和其他蛋白；（3）免疫調(diào)節(jié)因子：抗炎細(xì)胞因子、促炎癥細(xì)胞因子、其它免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)。不少學(xué)者認(rèn)為純母乳喂養(yǎng)對(duì)新生兒營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)及免疫狀態(tài)的影響相對(duì)更好[55]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，乳脂球膜能提高嬰兒的抵抗力，而BSSL 可以促進(jìn)乳脂的吸收[56]。雖然，目前并沒有研究證明BSSL 在免疫調(diào)節(jié)方面的功能，但基于糖基化修飾特點(diǎn)，BSSL 很有可能是免疫調(diào)節(jié)方面的重要組分。這也將成為BSSL 的下一步研究方向。

6 結(jié)束語

現(xiàn)已有大量的實(shí)驗(yàn)以及臨床觀察證實(shí)了純母乳喂養(yǎng)的嬰兒可以大大降低感染性疾病的發(fā)生危險(xiǎn)、降低過敏性疾病的發(fā)生、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、促進(jìn)智力發(fā)育、促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等眾多益處[57]。母乳中的BSSL 對(duì)乳脂的吸收、膽固醇的吸收都有十分重要的作用，對(duì)腸道菌群的建立以及免疫調(diào)節(jié)方面也有潛在的積極影響。而在嬰兒配方奶粉中BSSL 是不存在的，BSSL在巴氏殺菌后也會(huì)完全失去活性，因此嬰兒額外的補(bǔ)充BSSL 就變得十分重要?，F(xiàn)在已經(jīng)有研究將BSSL 基因成功的在牛及小鼠中表達(dá)。未來將對(duì)BSSL 進(jìn)行更加深入的研究為其以后能夠批量生產(chǎn)并添加到配方奶粉中奠定基礎(chǔ)。