鐵死亡在睪丸損傷中的研究進(jìn)展

趙 倩，查文良

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院附屬第二醫(yī)院)

多種原因可導(dǎo)致男性睪丸損傷，如接觸有毒物質(zhì)、疾病所觸發(fā)的并發(fā)癥等。鐵死亡是鐵依賴的，以細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧(reactive oxygen species,ROS)堆積為特征的細(xì)胞死亡形式。睪丸損傷時(shí)會(huì)出現(xiàn)類似鐵死亡的表現(xiàn)，如鐵代謝紊亂、ROS增加等。本文擬對(duì)鐵死亡在睪丸損傷中的作用及機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 鐵死亡概述

鐵死亡是一種由致命的脂質(zhì)過氧化引起的細(xì)胞死亡形式，其所觸發(fā)的細(xì)胞死亡可被鐵螯合劑(如去鐵胺)、親脂型抗氧劑、脂質(zhì)過氧化抑制劑(liproxstatin-1)和多不飽和脂肪酸的消耗所抑制[1]。

盡管初步研究表明，鐵死亡在形態(tài)、生化和遺傳上都不同于凋亡、壞死和自噬[2]，但大多數(shù)研究者認(rèn)為發(fā)生鐵死亡的細(xì)胞通常表現(xiàn)為壞死樣的形態(tài)學(xué)改變[3]。鐵死亡可表現(xiàn)為鐵離子水平的異常、線粒體膜致密、線粒體嵴減少或消失、線粒體外膜破裂、細(xì)胞核大小正常，但染色質(zhì)缺乏凝集[4]。

鐵死亡主要受谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)和半胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)Xc(System Xc)兩個(gè)核心因子的調(diào)控。具體調(diào)節(jié)機(jī)制如下：①GPX4作為一種磷脂氫過氧化物酶，將高毒性磷脂過氧化物(AA/AdA-PE-OOH)轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的無毒性的磷脂醇(PLOH)。GPX4的表達(dá)活性由硒和谷胱甘肽(GSH)控制[5]。②System Xc：其是由輕鏈溶質(zhì)載體家族7成員11(SLC7A11)與重鏈溶質(zhì)載體家族3成員2(SLC3A2)組成的異二聚體，調(diào)控胱氨酸與谷氨酸的互換，其被阻斷時(shí)，可出現(xiàn)谷胱甘肽合成減少、氧化應(yīng)激增加、脂質(zhì)過氧化增加，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[6]。

目前，鐵死亡的相關(guān)機(jī)制仍未完全闡明，但其在各種疾病中被廣泛研究。如帕金森、心力衰竭、急性腎損傷等[7-9]。同時(shí)，鐵死亡與生殖系統(tǒng)損傷的研究近幾年也層出不窮，所以干預(yù)鐵死亡可能成為防治生殖系統(tǒng)損傷的新措施。

2 鐵死亡與睪丸損傷

在各種因素的刺激之下，不論是毒性物質(zhì)的暴露(如亞砷酸鈉)[10]，或是疾病帶來的長(zhǎng)期內(nèi)環(huán)境的紊亂(如糖尿病)，均可引起睪丸組織功能和結(jié)構(gòu)的異常。表現(xiàn)為睪丸的組織學(xué)改變?nèi)绮G丸的帽狀組織，體和尾狀區(qū)域的質(zhì)量減少、立體纖毛減少、上皮細(xì)胞聚集等；也可表現(xiàn)為睪丸功能水平的異常如神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)紊亂、生精及射精功能障礙等[11]。近年來，鐵死亡在生殖系統(tǒng)中的作用也引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。關(guān)鍵性因子GPX4在精子發(fā)生等過程起重要作用，這提示鐵死亡在睪丸損傷中可能扮演重要角色。

2.1 影響鐵代謝

細(xì)胞內(nèi)存在鐵穩(wěn)態(tài)，鐵離子的調(diào)節(jié)對(duì)鐵死亡影響深遠(yuǎn)。肝臟合成的鐵調(diào)素直接調(diào)控血清鐵的水平，而細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)主要依靠鐵調(diào)控蛋白系統(tǒng)。體內(nèi)Fe3+與轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tfrc)結(jié)合，通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TFR1)介導(dǎo)進(jìn)入內(nèi)核，F(xiàn)e3+被STEAP3亞鐵還原酶還原為Fe2+。最后經(jīng)二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(DMT1，也稱SLC11A2)將Fe2+釋放進(jìn)入不穩(wěn)定的鐵池中，多余的鐵儲(chǔ)存在鐵蛋白中。鐵蛋白是一種由鐵蛋白輕鏈多肽(FTL)與鐵蛋白重鏈1(FTH1)構(gòu)成的復(fù)合物。此外，膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Fpn)是鐵調(diào)素的受體，可以調(diào)控鐵向細(xì)胞外釋放[4]，部分Fe2+再經(jīng)過氧化變成Fe3+繼續(xù)體內(nèi)鐵循環(huán)。

睪丸缺血再灌注(I/R)損傷可誘導(dǎo)生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞的死亡，相對(duì)的抑制細(xì)胞死亡可改善急性睪丸I/R損傷。通過構(gòu)建氧糖剝奪/再灌注組(OGD/R)細(xì)胞模型，與正常的Sertoli細(xì)胞對(duì)比，研究發(fā)現(xiàn)該模型導(dǎo)致的睪丸缺血再灌注損傷可能通過降低Fpn的表達(dá)而減少鐵的輸出從而誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生，但在Tfrc、TFR1、DMT1、儲(chǔ)鐵蛋白未觀察到表達(dá)差異性，表明缺血再灌注損傷通過減少鐵的降解，并未改變鐵的攝入而誘導(dǎo)鐵死亡[12]。男性吸煙患者精漿中亦可見鐵水平異常，細(xì)胞呈現(xiàn)鐵死亡特征[13]。在暴露于化療藥物白消安的小鼠與應(yīng)用Ferrostatin-1(Fer-1)，DFO(去鐵胺)組相比，F(xiàn)er-1、DFO組使得FPN1明顯上調(diào)，TFR1表達(dá)下降，DMT1無表達(dá)差異性，說明在其損傷中通過影響FPN的表達(dá)來抑制鐵死亡[14]。暴露于亞砷酸鹽的小鼠中可見亞砷酸鹽以相對(duì)劑量依賴性的方式顯著提高了總鐵和Fe2+的濃度，Tfrc、SLC11A、FTH1表達(dá)均有增加[10]。

2.2 影響脂質(zhì)過氧化

鐵死亡需要脂質(zhì)ROS的產(chǎn)生，與多種過程相關(guān)，包括NADPH(還原型輔酶Ⅱ)介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化、Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的鐵依賴性ROS和GSH的耗竭。脂質(zhì)過氧化是鐵死亡的重要環(huán)節(jié)。

2.2.1 GPX4失活

GPX4在精子形成過程中起著重要作用。GPx4有三種類型：mGPx4主要轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體、nGPx4主要定位于核仁、cGPx4主要分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。研究發(fā)現(xiàn)，睪丸組織中mGPX4 mRNA和nGPX4 mRNA的表達(dá)明顯高于其他組織[14]。尤其是精子發(fā)生期間，睪丸中mGPx4 mRNA和nGPx4 mRNA的表達(dá)顯著，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中mGPX4 KO小鼠由于線粒體結(jié)構(gòu)損傷而表現(xiàn)出雄性不育，但睪丸中精子數(shù)量正常。mGPx4與nGPx4起始密碼子突變轉(zhuǎn)基因可以挽救所有GPx4 KO小鼠的胚胎致死率，而cGPx4起始密碼子突變轉(zhuǎn)基因不能挽救胚胎致死率，證實(shí)其對(duì)小鼠胚胎發(fā)育和正常生長(zhǎng)至關(guān)重要。所有GPx4 KO小鼠的精母細(xì)胞均表現(xiàn)出睪丸中生精細(xì)胞的嚴(yán)重缺陷，精子數(shù)量明顯降低，鞭毛和精子線粒體結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致不育。所有GPx4 KO小鼠給予維生素E治療可挽救小鼠精子發(fā)生的缺陷，從而恢復(fù)精子數(shù)量[15]。

另有研究發(fā)現(xiàn)吸煙會(huì)影響男性精液的質(zhì)量，應(yīng)用GC-2細(xì)胞株暴露于香煙凝霧冷凝物(CSC)中進(jìn)行造模，并與正常GC-2組、GC-2+CSC+Fer-1組、GC-2+CSC+Z-VAD-FMK組進(jìn)行對(duì)比，觀察到，GSH與GPX4在CSC處理24h后顯著降低并在Fer-1處理的細(xì)胞株中升高，提示吸煙與精漿中高水平的鐵死亡有關(guān)，并影響經(jīng)精子質(zhì)量[16]。

2.2.2 System XC

System XC-：其由輕鏈溶質(zhì)載體家族7成員11(SLC7A11)與重鏈溶質(zhì)載體家族3成員2(SLC3A2)組成的異二聚體，影響GSH的含量，進(jìn)而影響脂質(zhì)過氧化。研究發(fā)現(xiàn)[10]，亞砷酸鹽誘導(dǎo)的小鼠睪丸氧化損傷主要來自線粒體脂質(zhì)過氧化，細(xì)胞水平(GC-2)表現(xiàn)出鐵死亡現(xiàn)象，經(jīng)過亞砷酸鹽處理后，導(dǎo)致睪丸中的SLC7A11蛋白表達(dá)下降，GSH耗盡，影響GPX4活性，觸發(fā)鐵死亡。同時(shí)，在p533KR/3KRXRCC4-/-小鼠的脾臟和睪丸中亦可見SLC7A11 被下調(diào)[17]。

2.2.3 Nrf2

核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)在鐵死亡中被證實(shí)起關(guān)鍵調(diào)控作用。Nrf2可以操控下游抗氧化基因(GPX4、血紅加壓素酶1等)，調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡。

實(shí)驗(yàn)[13]將小鼠分成4組：正常組、白消安暴露組、白消安+Fer-1組、白消安+DFO組，觀察到其 GPX4、Nrf2水平明顯異常，經(jīng)鐵死亡抑制劑處理后恢復(fù)至正常水平，精子活力及精子濃度明顯升高，對(duì)其形態(tài)學(xué)表現(xiàn)如小鼠附睪精子形態(tài)亦有改善作用。證實(shí)白消安通過下調(diào)Nrf2表達(dá)，從而導(dǎo)致GPX4表達(dá)下降，誘發(fā)鐵死亡。

2.2.4 脂氧合酶催化多種不飽和脂肪酸

脂氧合酶催化多種不飽和脂肪酸(PUFAs)的氧化和降解，由于其在多種疾病中的作用而備受關(guān)注，如缺血性心肌病、糖尿病、慢性髓系白血病等都與脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物4(4HNE)的升高密切相關(guān)。4HNE來源于組織和細(xì)胞中ω-6多不飽和脂肪酸(PUFAs)的脂質(zhì)過氧化過程，其細(xì)胞毒性很大程度上依賴于其共價(jià)修飾，4HNE修飾會(huì)導(dǎo)致男性生殖細(xì)胞中蛋白穩(wěn)態(tài)的嚴(yán)重變化，受精卵識(shí)別所需的關(guān)鍵蛋白急劇丟失[18]。

我們觀察到在圓形精子細(xì)胞階段是生殖細(xì)胞成熟的一個(gè)臨界點(diǎn)，這個(gè)階段細(xì)胞變得非常容易受到脂質(zhì)過氧化、4HNE的產(chǎn)生以及相關(guān)4HNE修飾蛋白靶點(diǎn)(如熱休克蛋白A2)相關(guān)不穩(wěn)定性因素影響的關(guān)鍵點(diǎn)[19]，且對(duì)鐵死亡具有獨(dú)特的敏感性。在成熟的人類精子中，花生四烯酸-15-脂加氧酶(ALOX15)的抑制可阻止4HNE誘導(dǎo)的蛋白修飾也可改善精子功能和精卵相互作用。同時(shí)，在其他實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用RSL3等抑制劑觀察GPX4等蛋白的變化，證實(shí)ALOX15可以誘導(dǎo)鐵死亡[20]。

2.2.5 P53

P53在腫瘤發(fā)展、基因組完整性和正常細(xì)胞衰老過程中扮演重要角色。運(yùn)用基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[17]，p533KR/3KRXRCC4-/-表型小鼠出現(xiàn)衰老相關(guān)變化，男性生殖系統(tǒng)中的衰老主要表現(xiàn)在睪丸中觀察到睪丸質(zhì)量顯著降低，廣泛的生精上皮細(xì)胞變性。其途徑描述為P53激活，致使SLC7A11表達(dá)下降，半胱氨酸攝取減少，GSH下降，同時(shí)伴隨PTGS2(潛在鐵死亡標(biāo)志物)水平升高，致使鐵死亡的發(fā)生，進(jìn)而損傷睪丸。

2.2.6 其他因子

諸多其他因子也可以影響脂質(zhì)過氧化的水平，如VDAC、CARS等，其中VDAC的研究與睪丸損傷聯(lián)系最為密切。VDAC也稱為線粒體孔蛋白，是在線粒體外膜中鑒定出的能夠形成親水孔結(jié)構(gòu)的一組蛋白質(zhì)。VDAC允許代謝物穿過線粒體外膜，并參與代謝物的運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其有三種同工型：VDAC1、VDAC2、VDAC3。VDAC的開放允許呼吸鏈底物、ADP、磷酸等進(jìn)入線粒體。VDAC內(nèi)含微管蛋白調(diào)節(jié)其開放，阻塞VDAC可以限制上述物質(zhì)流入線粒體及ATP的產(chǎn)生，鐵死亡可以抑制其阻塞作用，促進(jìn)其開放，提高ADP/ATP的比值與氧化應(yīng)激水平。運(yùn)用熒光定位等技術(shù)發(fā)現(xiàn)：VDAC1主要位于Sertoli細(xì)胞中，VDAC2位于晚期精母細(xì)胞和精子細(xì)胞中，VDAC3位于睪丸所有細(xì)胞類型中，特別是在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中[21]。在亞砷酸鹽處理的GC-2細(xì)胞誘發(fā)鐵死亡中也觀察到VDAC3表達(dá)含量的上升[10]。

2.3 MAPK

目前已有文獻(xiàn)[12]報(bào)道證實(shí)MAPK信號(hào)路徑可以誘發(fā)鐵死亡，主要有以下3個(gè)蛋白即ERK、P38和JNK。在OGD/R睪丸支持細(xì)胞模型中對(duì)上述3種因子均進(jìn)行通路分析發(fā)現(xiàn)，其不能促進(jìn)JNK和ERK1/2的磷酸化，但NAC(N-乙酰-L-半胱氨酸)顯著抑制了OGD/R誘導(dǎo)的P38 MAPK磷酸化，即其通過P38-MAPK路徑觸發(fā)鐵死亡。

3 展 望

鐵死亡主要包括兩個(gè)關(guān)鍵因子即GPX4與System Xc，鐵死亡相關(guān)因子與睪丸損傷密切相關(guān)，隨著進(jìn)一步深入的探究，干預(yù)鐵死亡，可為治療睪丸損傷及雄性不育提供理論基礎(chǔ)。