菌種保藏室建設(shè)與管理初探

羅小葉，王曉丹 ，邱樹毅

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025）

貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室是專門從事貴州傳統(tǒng)發(fā)酵食品及白酒釀造的省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，是貴州省統(tǒng)發(fā)酵工程研究中心和人才培養(yǎng)基地。依托貴州省豐富的生物資源和傳統(tǒng)發(fā)酵資源優(yōu)勢，針對貴州區(qū)域發(fā)酵產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的需求，開展相關(guān)研究，已經(jīng)形成發(fā)酵微生物資源挖掘與利用、發(fā)酵功能生物分子分離與風(fēng)味物質(zhì)解析、發(fā)酵食品工藝創(chuàng)新與現(xiàn)代食品技術(shù)應(yīng)用、發(fā)酵食品安全檢測技術(shù)等研究方向，經(jīng)過多年的建設(shè)和發(fā)展，實(shí)驗(yàn)室在學(xué)科建設(shè)、人才培養(yǎng)、導(dǎo)師隊(duì)伍的建設(shè)、科學(xué)研究上取得了很大的發(fā)展，并在加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室管理、提升重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)新能力、促進(jìn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室“開放、流動(dòng)、聯(lián)合、競爭”等方面開展了一系列的工作。在微生物學(xué)研究工作中，微生物是基本材料，也是深加工產(chǎn)品的重要生產(chǎn)原料。重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主要涉及貴州微生物資源的挖掘與利用，主要包括醬香型白酒固態(tài)釀造微生物、貴州特色米酒微生物、貴州特色果酒微生物、貴州特色酸湯微生物及其他食品微生物資源的挖掘與利用，涉及的微生物包括細(xì)菌、酵母、霉菌、放線菌及高溫放線菌等代表菌株。菌種保藏為持久而有效利用微生物資源提供了保證[1]，重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)行集中保藏、科學(xué)的育種傳代及分類管理，并負(fù)責(zé)同其他高校及科研院所相互交流，以及研究保藏菌種的科技情報(bào)工作，以使各類菌種長期滿足科研需要，更好地為科學(xué)研究和貴州產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)。

一、菌種保藏室建設(shè)與管理

（一）菌種保藏室建設(shè)的歷史追溯

世界上約有550個(gè)菌種保藏機(jī)構(gòu)，最早意識(shí)到菌種保藏意義的是捷克斯洛伐克微生物學(xué)家Frantisek Kral[2]。為了更好地將這些菌種服務(wù)于當(dāng)時(shí)的微生物學(xué)研究和應(yīng)用，他先后公布了菌種目錄，該目錄共63頁，有800個(gè)菌株，包括引起人或動(dòng)物流行性疾病的致病菌、食品發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)菌，還有真菌、藻類和厭氧菌[2]。部分私立菌種保藏機(jī)構(gòu)，主要設(shè)在巴黎、倫敦、比利時(shí)和日本等有關(guān)微生物的研究所，但不幸的是現(xiàn)今無法找到這些保藏機(jī)構(gòu)的資料，對于微生物菌種保藏工作的重要性令人深思。經(jīng)過大量的篩選及微生物工作，分離篩選得到微生物菌種，因此，我們更應(yīng)加以保護(hù)和利用珍貴的微生物資源。

（二）菌種保藏的目的與任務(wù)

就微生物學(xué)工作者而言，微生物保藏是一項(xiàng)非常重要的工作，不僅涵蓋原料菌種的分離篩選、微生物純化、理化分子鑒別及儲(chǔ)藏保管，還與微生物生理學(xué)、生物化學(xué)、生態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)、形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科有著必然聯(lián)系[3]。根據(jù)國際及國內(nèi)保藏中心的發(fā)展與任務(wù)，菌種保藏中心主要是對現(xiàn)今的各種微生物進(jìn)行有效保存，保持其形態(tài)及功能特性，避免在保藏期間和生產(chǎn)過程中產(chǎn)生死亡或者變異，從而為微生物學(xué)研究提供最基本的原料[3]。

（三）國家級(jí)菌種保藏中心的概況

我國國家級(jí)菌種保藏管理中心主要負(fù)責(zé)全國微生物菌種資源的收集、鑒定、評(píng)價(jià)、保藏、供應(yīng)及國際交流任務(wù)[4]，目前國家級(jí)微生物菌種保藏中心有：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）、中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC）、中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）、中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC）、中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CFCC）、中國抗生素菌種保藏管理中心（CACC）、中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（CMCC）、中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）等[5]，例如目前本重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室大部分教師的微生物均保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，該保藏中心是于1985年由國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局（原中國專利局）指定、經(jīng)教育部（原國家教委）批準(zhǔn)建立的專利微生物保藏機(jī)構(gòu)，受理國內(nèi)外用于專利程序的微生物保藏菌種保藏，為各團(tuán)隊(duì)知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)及轉(zhuǎn)化起到保駕護(hù)航作用。

（四）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏室的建設(shè)與管理

1.重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏室的建設(shè)。重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室立足于貴州，面向西部，通過配套完善的實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備和實(shí)驗(yàn)室條件，依托國家重大科技計(jì)劃專項(xiàng)、國家自然科學(xué)基金及地方重大科技計(jì)劃專項(xiàng)，開展發(fā)酵工程與生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用基礎(chǔ)理論與技術(shù)研究，建設(shè)一個(gè)產(chǎn)學(xué)研緊密結(jié)合、人才培養(yǎng)和研究開發(fā)同步的技術(shù)研發(fā)平臺(tái)，以及一支具有較高創(chuàng)新能力的學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)。目前，實(shí)驗(yàn)室在貴州從學(xué)科建設(shè)、人才培養(yǎng)、科學(xué)研究、社會(huì)服務(wù)等方面較好地發(fā)揮了技術(shù)支撐和引領(lǐng)作用優(yōu)勢，提升了貴州省發(fā)酵工程與生物制藥的水平和創(chuàng)新能力，縮短了與國內(nèi)外的科技水平差距，推進(jìn)了貴州省發(fā)酵工程與生物制藥產(chǎn)業(yè)快速、穩(wěn)定、健康發(fā)展。

筆者在重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開展科研工作的同時(shí)，參與了實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)與管理工作。由于重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主要從事發(fā)酵與生物制藥科學(xué)研究，其中涉及的微生物尤其眾多，菌種微生物資源事關(guān)生物技術(shù)創(chuàng)新的未來，菌種是從事微生物學(xué)及生命科學(xué)研究的基本材料，也是與微生物有關(guān)的生產(chǎn)部門的重要生產(chǎn)資料。微生物具有生命活力，其世代時(shí)間一般很短，在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡。因此，菌種保藏是進(jìn)行微生物學(xué)研究和微生物育種工作的重要組成部分。

自重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室成立建設(shè)至2017年11月，實(shí)驗(yàn)室各類微生物菌種保藏一直存在一大問題：缺乏統(tǒng)一的保藏點(diǎn)及保藏方法對整個(gè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的微生物菌種進(jìn)行保藏，重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室各科研團(tuán)隊(duì)出現(xiàn)各自為政的狀態(tài)，難以將整個(gè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的微生物資源進(jìn)行挖掘與應(yīng)用。為解決此問題及更好地挖掘微生物資源，2018年，在重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任及各位教師的指導(dǎo)與支持下，筆者在貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院崇德樓454實(shí)驗(yàn)室籌備并建立了重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的菌種保藏室，面積約30平方米，菌種保藏室現(xiàn)有儀器設(shè)備包括普通微生物常用的培養(yǎng)基、化學(xué)試劑及檢測儀器設(shè)備，以滿足微生物培養(yǎng)、保藏及檢測。2020年下半年已經(jīng)將整個(gè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室各個(gè)課題組的所有菌種保藏在重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，保藏的微生物類型包括酵母（218株）、霉菌（226株）、細(xì)菌（318株）、高溫放線菌（10株）、放線菌（5株）等微生物，這些微生物主要以貴州傳統(tǒng)發(fā)酵釀造食品為原料分離篩選得來，主要包括醬香型大曲、醬香型酒醅、米酒、酸湯、酸菜、果酒等原料，菌種類型十分豐富，功能特性比較多樣，微生物保藏方式包括4 ℃斜面保藏、甘油保藏、-80 ℃超低溫凍干保藏等保藏方式。為便于菌種的存取，經(jīng)過實(shí)地考量，在-80 ℃超低溫冰箱中制作菌種保藏架放入冰箱中，再將各菌株按照各課題組及各菌種類型分門別類放入保藏架內(nèi)，并在架子外側(cè)編上編號(hào)，十分便于菌種的快速搜索與存取，在節(jié)約時(shí)間的同時(shí)，減少了微生物染菌的可能。

2.重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏室的管理。重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏室的建設(shè)與運(yùn)行為各類微生物的保藏及使用提供便捷的通道，作為重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏室的負(fù)責(zé)人，為更好地規(guī)范管理菌種保藏室及重要菌種，制訂《貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏室保藏申請流程》，按照以下流程完成菌種保藏工作，具體要求如下：與保藏室負(fù)責(zé)教師取得聯(lián)系并填寫菌種保藏申請表；準(zhǔn)備好需保藏的菌種，根據(jù)菌種選擇合適的保藏方法并告知負(fù)責(zé)教師保藏條件；菌種保藏期間如要取出菌種，需提前與負(fù)責(zé)教師聯(lián)系方可取出菌種，不得私自拿?。辉诒２仄陂g需與負(fù)責(zé)教師一起定期檢查菌種的存活率、種株純度及其有關(guān)特性；本保藏中心只接收用于發(fā)酵及食品生產(chǎn)用的有益無害菌種，具有毒性及傳染性的菌種或病毒不在保藏范圍。

其次，根據(jù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心的實(shí)際情況，制訂《貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏室菌種保藏與管理辦法》，該辦法包括菌種各種保藏方法的詳細(xì)概述及菌種檢查與復(fù)壯，辦法規(guī)定的具體內(nèi)容根據(jù)本保藏室具體實(shí)際情況作出相應(yīng)調(diào)整。菌種保藏分四個(gè)階段：（1）挑選特征典型的純菌菌落；（2）確定保藏的合適菌體形態(tài)；（3）選擇最適宜的保藏方法進(jìn)行保藏；（4）定期對保藏的菌種進(jìn)行檢查，保藏期滿應(yīng)及時(shí)進(jìn)行移種。保藏方法包括直接傳代保藏法、液體石蠟保存法、沙土管保藏法、麩皮保藏法、濾紙保藏法、液氮超低溫保藏法、冷凍真空干燥保藏法。具體的保藏方法在以后實(shí)際保藏工作中根據(jù)各個(gè)課題組的微生物類型而定，比如在重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中，有用于食醋釀造的醋酸菌、用于米酒釀造和醬油釀造的霉菌、用于果酒啤酒發(fā)酵的酵母、用于白酒釀造的霉菌細(xì)菌及酵母、用于酸湯和發(fā)酵辣椒醬的乳酸菌等類型，比如霉菌適合沙土保藏，酵母和細(xì)菌適合液氮或者冷凍保藏等，需要根據(jù)各個(gè)課題組的實(shí)際微生物而定保藏類型，而不能“一法通用”——這對微生物功能特性保持是非常不利的；在實(shí)際菌種保藏室管理工作中需定期對微生物進(jìn)行污染檢查及特性檢查，保藏期滿后要及時(shí)進(jìn)行移種，而不是保藏在載體中就是幾年不管——這對發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室特有微生物資源的損失是非常嚴(yán)重的。微生物菌種是科研工作的基礎(chǔ)，對于在菌株篩選、保藏、管理方面有突出貢獻(xiàn)的，應(yīng)適當(dāng)予以獎(jiǎng)勵(lì)；由于保藏方式不妥或管理疏漏，導(dǎo)致菌株死亡或外泄的，需根據(jù)具體情況，報(bào)告重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任，給予必要的懲處。

二、菌種保藏室的應(yīng)用成果

（一）服務(wù)科研

重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏室已經(jīng)投入使用兩年多，建設(shè)管理下使用效果較好，相對于之前實(shí)驗(yàn)室微生物菌種各自為家、雜亂無章的狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)室各個(gè)課題組微生物都能得到有效保藏與利用；重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主要從事貴州特色發(fā)酵食品的研發(fā)，各類微生物在其中起到舉足輕重的作用。在重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室發(fā)展建設(shè)中，主要以微生物為中心，開展各項(xiàng)科學(xué)研究，近兩年來，通過重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏室建設(shè)，各科研團(tuán)隊(duì)共計(jì)承擔(dān)國家級(jí)項(xiàng)目10項(xiàng)，省部級(jí)項(xiàng)目20余項(xiàng)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文100余篇，獲得授權(quán)發(fā)明專利13項(xiàng)，省部級(jí)科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)勵(lì)2項(xiàng)，參與制定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)7項(xiàng)，產(chǎn)學(xué)研合作經(jīng)費(fèi)700余萬元。

重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏室主要應(yīng)用于各類微生物的保藏管理，這些功能微生物均在菌種保藏室及中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，大部分功能微生物各課題組均對其功能及代謝開展研究，應(yīng)用這些功能微生物申請獲批一系列科研項(xiàng)目，如利用功能芽孢桿菌及酵母進(jìn)行的研究，包括貴州醬香型白酒品質(zhì)提高與丟糟高效利用關(guān)鍵共性技術(shù)研究及示范、高品質(zhì)醬香型白酒釀造工藝優(yōu)化、利用功能微生物強(qiáng)化易地生產(chǎn)高品質(zhì)醬香型白酒關(guān)鍵技術(shù)研究、產(chǎn)白酒醇甜風(fēng)味物質(zhì)微生物篩選及關(guān)鍵技術(shù)研究、高產(chǎn)酯化酶的紫色紅曲霉在提高濃香型青酒品質(zhì)的應(yīng)用、利用醬香白酒丟糟生產(chǎn)低度果香型白酒的工藝研究及示范、利用功能乳酸菌進(jìn)行濃香型白酒酒醅中耐酸乳桿菌產(chǎn)酸特性及酸脅迫應(yīng)答機(jī)制研究 、利用高溫放線菌對醬香型大曲中高溫放線菌的分離篩選及搖瓶液體發(fā)酵條件優(yōu)化 ，以及研究傳統(tǒng)發(fā)酵酸湯及米酒品質(zhì)研究與新產(chǎn)品開發(fā)等項(xiàng)目。同時(shí)，利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏的一系列微生物開展的研究也獲得一系列國家及省獎(jiǎng)項(xiàng)。重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)科技成果也更利于進(jìn)行科技成果產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用及開展與外單位的合作應(yīng)用研究，將科學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力，推動(dòng)貴州特色產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

（二）輔以教學(xué)

雖然貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主要以科學(xué)研究服務(wù)產(chǎn)業(yè)為主，但是在教學(xué)中，也扮演著重要角色。為了更好地將各門專業(yè)課程理論教學(xué)與實(shí)踐相互融會(huì)貫通，充分利用實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)資源，重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室也為本科教學(xué)中的本科生提供開放平臺(tái)，包括實(shí)驗(yàn)場所、儀器設(shè)備等，使學(xué)生能在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行SRT實(shí)驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)室開放項(xiàng)目、大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽、互聯(lián)網(wǎng)+創(chuàng)業(yè)大賽等項(xiàng)目的研究。重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主要以發(fā)酵產(chǎn)物為研究內(nèi)容，在課余教學(xué)過程中，學(xué)生利用菌種保藏室的功能酵母制作米酒、啤酒、櫻桃酒、蜂蜜茶酒、茶啤酒、獼猴桃酒、苦蕎酵素、藍(lán)莓酒，利用功能霉菌制作霉豆腐、特色醬油，利用功能乳酸菌發(fā)酵酸奶、特色醋等產(chǎn)品。一方面，使學(xué)生全面回到課堂、回到教室；另一方面，培養(yǎng)了學(xué)生綜合提出問題、解決問題的能力。

重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏室的建設(shè)與管理運(yùn)行為各類微生物的保藏及使用提供便捷的通道，也為了解貴州省發(fā)酵產(chǎn)業(yè)特有微生物資源提供有力支撐。今后，作為重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏室的負(fù)責(zé)人，筆者會(huì)加強(qiáng)保藏室的有效利用，做好微生物菌株的分離鑒定、篩選保藏，做好為重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室各位師生的服務(wù)工作，保藏好實(shí)驗(yàn)室珍貴的微生物資源特性不退化，挖掘出更多的有用微生物資源，實(shí)行集中保藏、科學(xué)的育種傳代及分類管理，并積極主動(dòng)和貴州省內(nèi)及全國其他高?？蒲袉挝唤涣?，將課題組的微生物資源有效利用；加強(qiáng)對菌種保藏工作的研究與探索，與大數(shù)據(jù)信息化相結(jié)合，使各類菌種長期滿足實(shí)驗(yàn)室科研需要；將圍繞各產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求，加快重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科研成果向生產(chǎn)力轉(zhuǎn)化，提高微生物資源的應(yīng)用價(jià)值。