中醫(yī)藥干預(yù)治療椎間盤退行性變基因?qū)W研究進(jìn)展

張立存 趙繼榮 徐兵 陳祁青 趙寧 馬同 張?zhí)忑?蔡毅 李瑋農(nóng) 楊濤

(1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 700030 ；2甘肅省中醫(yī)院)

伴隨老齡化人口的不斷增加，人們生活質(zhì)量的不斷提升，一些退變性疾患如脊柱、骨關(guān)節(jié)退變的防治成為臨床骨科研究的熱點(diǎn)〔1〕。椎間盤退行性變(IDD)是多種因素綜合影響的結(jié)果，其發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，現(xiàn)有相關(guān)研究認(rèn)為椎間盤組織脫水、細(xì)胞外基質(zhì)降解、蛋白多糖含量下降、膠原類型轉(zhuǎn)變及纖維環(huán)外層破裂等為IDD發(fā)生發(fā)展的主要原因〔2〕。臨床上IDD是造成頸肩腰腿痛主要因素之一，有研究指出全球約80%的人一生經(jīng)受腰腿痛折磨，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給家庭和社會(huì)造成了極大的負(fù)擔(dān)〔3，4〕。早期觀點(diǎn)認(rèn)為IDD是由于隨著年齡增大椎間盤衰老引發(fā)，然而近年來(lái)IDD的發(fā)病多呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)〔5〕。因此，明確IDD的發(fā)病機(jī)制并尋求科學(xué)有效的治療手段是當(dāng)前的主要研究方向?；诨蚨鄳B(tài)性研究基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)，大量IDD的椎間盤組織中存在著眾多基因的表達(dá)異常〔6〕。因此，IDD的發(fā)生發(fā)展可能與多種基因異常表達(dá)關(guān)系密切，且IDD的發(fā)生發(fā)展可能通過(guò)基因表達(dá)異常而誘導(dǎo)椎間盤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路和靶點(diǎn)發(fā)生特異性改變。中醫(yī)藥可直接或間接參與IDD的部分相關(guān)基因水平表達(dá)，抑制或激活相關(guān)基因表達(dá)從而達(dá)到延緩或加速IDD的發(fā)生發(fā)展。故從相關(guān)基因表達(dá)入手研究IDD的發(fā)病機(jī)制并利用中醫(yī)藥進(jìn)行早期干預(yù)。

1 退變纖維環(huán)差異基因表達(dá)相關(guān)研究

纖維環(huán)是構(gòu)成椎間盤的重要結(jié)構(gòu)之一，在維持脊柱生物力學(xué)穩(wěn)定、負(fù)重等方面具有重要作用。Gruber等〔7〕利用激光捕獲顯微切割術(shù)對(duì)椎間盤突出癥受試患者纖維環(huán)細(xì)胞進(jìn)行了獲取并對(duì)相關(guān)基因表達(dá)做了研究，結(jié)果顯示有47個(gè)差異性表達(dá)基因，與正常組相比，有 13個(gè)上調(diào)基因，19個(gè)下調(diào)基因，變性過(guò)程中受到顯著調(diào)節(jié)的基因包括細(xì)胞衰老、缺氧等相關(guān)基因。其中生長(zhǎng)停滯特異(GAS)1基因和賴氨酰氧化酶樣(LOXL)2基因兩種基因的表達(dá)上調(diào)最顯著。GAS-1是一種主要參與細(xì)胞融合和生長(zhǎng)抑制過(guò)程的多效性膜蛋白，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、停滯和凋亡，在年齡較大的小鼠骨骼肌干細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)〔8，9〕。LOXL2是賴氨酰氧化酶(LOX)基因家族的成員，是一種能夠通過(guò)催化肽基賴氨酸氧化為氨基己二酸半醛來(lái)啟動(dòng)膠原蛋白和彈性蛋白交聯(lián)反應(yīng)的細(xì)胞外銅依賴性酶，在衰老退化的鼠膽管上皮細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)〔10，11〕。由此表明GAS1和LOXL2可能是椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞退變的特異表達(dá)基因。Kazezian等〔12〕分析人體退化纖維環(huán)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)238個(gè)差異表達(dá)基因中有17種表達(dá)顯著，其中10個(gè)上調(diào)基因，7個(gè)下調(diào)基因，差異表達(dá)基因涉及細(xì)胞增殖和炎癥應(yīng)答相關(guān)基因，四肽重復(fù)蛋白(IFIT)3和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP)3是明顯上調(diào)的兩種基因。 IGFBP3和IFIT3可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖，參與炎性細(xì)胞因子干擾素α信號(hào)傳導(dǎo)途徑從而使得纖維環(huán)發(fā)生退化〔13〕。葉冬平等〔14〕通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)人正常和退變纖維環(huán)細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)，結(jié)果顯示退變纖維環(huán)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β、白細(xì)胞介素(IL)-1、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)和IGF-1mRNA表達(dá)量降低，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-14和膠原Ⅰ型(COL1)A1 mRNA表達(dá)升量高，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)mRNA在正常纖維環(huán)細(xì)胞表達(dá)陰性，而在退變纖維環(huán)細(xì)胞中有表達(dá)。上述研究表明纖維環(huán)退變涉及多種基因的參與，因此針對(duì)纖維環(huán)退變相關(guān)性基因逐個(gè)擊破，有的放矢，才能從根本上防止纖維環(huán)退變。

2 退變髓核差異基因表達(dá)相關(guān)研究

髓核組織處于椎間盤的中心位置，其細(xì)胞變性及活性下降是IDD發(fā)生的主要原因，髓核組織的退變往往是IDD的開(kāi)端〔15〕。在相關(guān)動(dòng)物模型試驗(yàn)研究中，Hideki等〔16〕通過(guò)建立大鼠髓核細(xì)胞饑餓模型，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因高達(dá)2 922個(gè)，其中表達(dá)顯著的有影響細(xì)胞周期進(jìn)程的生長(zhǎng)阻滯和DNA損傷基因(Gadd)45和Tp53相關(guān)基因，p27Kip1，p21Cip1蛋白表達(dá)也有所上調(diào)。p27Kip1和p21Cip1屬于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CKIs)家族成員，主要在養(yǎng)分受限的細(xì)胞中高表達(dá)，其上調(diào)可以妨礙細(xì)胞周期，使細(xì)胞DNA更容易受到損傷〔17〕。Minogue等〔18〕通過(guò)定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)在分離的牛髓核細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了許多差異表達(dá)基因單元并和正常人髓核細(xì)胞及退化的髓核細(xì)胞進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)11個(gè)基因〔突觸小體相關(guān)蛋白25 kD(SNAP-25)、細(xì)胞角蛋白(KRT)8、 KRT18、 KRT19、鈣黏著蛋白(CDH)-2、骨涎蛋白(IBSP)、多功能蛋白聚糖基因(VCAN)、腱調(diào)蛋白 (TNMD)、腦富含膜附著信號(hào)蛋白(BASP)1、叉頭框F1基因(FOXF1)、腓骨蛋白(FBLN)1〕在人正常髓核細(xì)胞中也存在差異表達(dá)，但不顯著，4個(gè)基因(SNAP25，KRT8，KRT18和CDH2)的表達(dá)在人退變髓核細(xì)胞顯著下調(diào)。盡管該實(shí)驗(yàn)存在種間差異，但是這種基因表達(dá)特征將有益于組織工程研究。Shao等〔19〕使用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)鈣化髓核的差異表達(dá)基因，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)了132個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因129個(gè)，下調(diào)基因3個(gè)。顯著上調(diào)基因中前6個(gè)為硬化蛋白(SOST)，多聚IgA和IgM的連接鏈，防御素α4(DEFA4)，人分泌型卷曲蛋白(SFRP)4，蛋白酶(PRTN)3和組織蛋白酶(CTS)G，其中SOST和SFRP4的上調(diào)與Wnt信號(hào)通路的抑制相關(guān)。該研究證明了椎間盤鈣化可能與Wnt通路異常和炎癥相關(guān)因子高表達(dá)相關(guān)。Leung等〔20〕通過(guò)研究BMP在人體髓核細(xì)胞中的作用并比較BMP-7與BMP-2對(duì)髓核細(xì)胞表型和功能活性的影響，發(fā)現(xiàn)在退化的髓核細(xì)胞中BMP表達(dá)比非退化細(xì)胞中整體弱，相比于BMP-2、BMP-7可以誘發(fā)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)1使得退變髓核細(xì)胞中高表達(dá)的EP300基因發(fā)生變化，另外還可以抑制纖維化基因的表達(dá)進(jìn)而延緩髓核退變。這一發(fā)現(xiàn)表明BMP在分子層面防治IDD意義重大。Wan等〔21〕采用基因芯片分析技術(shù)研究人髓核中長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)116個(gè)差異表達(dá)lncRNA，其中上調(diào)67個(gè)，下調(diào)49個(gè)，該研究還發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的Fas相關(guān)蛋白因子(FAF)1在退變的髓核組織中高表達(dá)。

3 退變軟骨終板差異基因表達(dá)相關(guān)研究

椎間盤作為人體最大無(wú)血管組織，其營(yíng)養(yǎng)來(lái)源主要依靠上下軟骨終板擴(kuò)散相鄰椎骨血管內(nèi)物質(zhì)，有研究發(fā)現(xiàn)封閉終板營(yíng)養(yǎng)途徑會(huì)導(dǎo)致IDD的發(fā)生〔22〕。因此軟骨終板的退變會(huì)使椎間盤唯一的營(yíng)養(yǎng)通道被阻斷同時(shí)代謝物質(zhì)在椎間盤內(nèi)積聚從而加速IDD的發(fā)生發(fā)展。低氧狀態(tài)是造成軟骨終板退變的重要因素，Yao等〔23〕在生理缺氧的微環(huán)境中培養(yǎng)并分析了人體軟骨終板間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)448個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)330個(gè)，下調(diào)118個(gè)，與正常氧組相比，低氧組IL-1受體相關(guān)激酶(IRAK)3和補(bǔ)體因子(CF)D顯著上調(diào)。相反，3個(gè)基因(轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，磷酸甘油酸突變酶2和鈣蛋白酶6)的表達(dá)顯著低于正常氧組。表明缺氧狀態(tài)炎癥相關(guān)因子基因高表達(dá)是軟骨終板退變的主要原因。Xiao等〔24〕在人體退變的軟骨終板細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA-0058097(circRNA-0058097)高表達(dá)，進(jìn)一步研究其機(jī)制得出 circRNA-0058097是一種對(duì)機(jī)械張力敏感的非編碼RNA，其可以靶向miR365a5p來(lái)上調(diào)組蛋白脫乙?；?HDAC)4基因表達(dá)，從而促進(jìn)終板軟骨細(xì)胞變性。HDAC4是組蛋白脫乙?；讣易宓某蓡T，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)核小體的結(jié)構(gòu)和抑制轉(zhuǎn)錄因子的活性來(lái)控制細(xì)胞增殖和分化，是軟骨細(xì)胞分化和變性的重要調(diào)節(jié)劑〔25〕。這項(xiàng)研究表明circRNA-0058097-miR365a5p-HDAC4調(diào)節(jié)途徑在機(jī)械張力誘導(dǎo)的終板軟骨細(xì)胞變性中起重要作用。Zhang等〔26〕證實(shí)了變性軟骨終板中細(xì)胞數(shù)量和蛋白聚糖減少，退變軟骨終板中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3、MMP-9、TIMP-3、IL-1α和IL-1β的mRNA表達(dá)顯著升高。軟骨終板的主要成分是Ⅱ型膠原和蛋白聚糖，有研究表明MMP的過(guò)表達(dá)會(huì)促使軟骨終板中Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的降解，IL-1又可以刺激MMP表達(dá)〔27〕。由此可以認(rèn)為MMP-3、MMP-9、TIMP-3、IL-1α和IL-1β可能在軟骨終板變性過(guò)程中發(fā)揮作用。此外，Marfia 等〔28〕發(fā)現(xiàn)在退變軟骨終板細(xì)胞中骨橋蛋白(OPN)的基因表達(dá)顯著增加(超過(guò)400倍)。OPN涉及骨基質(zhì)鈣化和細(xì)胞外基質(zhì)破壞，該研究證明了OPN的異常表達(dá)在IDD的病理生理過(guò)程中起關(guān)鍵作用。以上相關(guān)研究的結(jié)論及成果對(duì)明確軟骨終板退變差異表達(dá)基因意義重大，對(duì)揭示IDD的機(jī)制同樣具有重要的作用。

4 中醫(yī)藥干預(yù)對(duì)IDD相關(guān)基因表達(dá)的影響研究

整體審查和辨證論治是中醫(yī)藥治療退變性疾患最根本特征。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為IDD的發(fā)病主要以肝腎虧虛為內(nèi)因，風(fēng)寒濕痹為外因，氣滯血瘀為病理基礎(chǔ)，故治療指導(dǎo)思想以補(bǔ)益肝腎、祛風(fēng)除濕、行氣活血為主〔29〕。Trinh等〔30〕認(rèn)為中醫(yī)藥治療IDD疾患療效確切。中醫(yī)藥治療IDD疾患相關(guān)分子研究已取得了一定成就。

4.1中藥藥物對(duì)IDD相關(guān)基因表達(dá)的影響 防治IDD的中藥及復(fù)方大都以補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨類為主。董晤訊〔31〕研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可以明顯降低髓核細(xì)胞中炎性因子IL-1β、IL-6的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)Aggrecan和Ⅱ型膠原蛋白(CoL-Ⅱ)表達(dá)水平從而減輕IDD。杜仲為骨傷科常用藥，常用于脊柱疾患的治療。Yang等〔32〕研究發(fā)現(xiàn)杜仲可以改善人體椎間盤髓核細(xì)胞中IL-1和腫瘤壞死因子(TNF)誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)降解。進(jìn)一步研究其作用機(jī)制后發(fā)現(xiàn)杜仲通過(guò)調(diào)節(jié)miR140-CREB1軸改變MMP-3，血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶(ADAMTS)5和CoL-Ⅱ的表達(dá)，IL-1和TNF刺激可抑制miR140的表達(dá)，而杜仲可激活miR140的表達(dá)同時(shí)抑制IL-1和TNF等炎性因子相關(guān)基因的表達(dá)，miR140的高表達(dá)使得MMP-3和ADAMTS5蛋白表達(dá)下調(diào)同時(shí)增加CoL-Ⅱ含量來(lái)保護(hù)髓核細(xì)胞。Zhou等〔33〕發(fā)現(xiàn)烏頭有效成分Karacoline可通過(guò)抑制NF-κB途徑降低IDD中MMP-14的表達(dá)，同時(shí)增加CoL-Ⅱ和蛋白聚糖的表達(dá)。何堅(jiān)等〔34〕發(fā)現(xiàn)葛根素可以上調(diào)IL-1β誘導(dǎo)的椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞中抗凋亡因子B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2，下調(diào)促凋亡因子半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3蛋白的表達(dá)來(lái)抑制纖維環(huán)細(xì)胞的凋亡。川芎嗪可通過(guò)降低終板軟骨細(xì)胞中CoL-Ⅰ，堿性磷酸酶(ALP)，Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2和TGF-β1 mRNA的表達(dá)來(lái)減輕軟骨終板退變〔35〕。除了單味中藥，中藥復(fù)方對(duì)IDD療效亦佳，Zhu等〔36〕發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血方可以通過(guò)Wnt/β-catenin通路上調(diào)miR-483-3p和GSK3B的表達(dá)，抑制miR-23c和CTNNB1表達(dá)，從而調(diào)節(jié)退變椎間盤中髓核細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)重塑和調(diào)控終板軟骨細(xì)胞來(lái)延緩IDD。另外，白榮飛〔37〕的研究表明補(bǔ)腎壯督方可上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)caspase-3的表達(dá)，從而延緩IDD。六味地黃丸治療IDD的相關(guān)分子研究中表明其能上調(diào)IDD模型中糖胺多糖含量、透明質(zhì)酸含量、硫酸軟骨素/硫酸角質(zhì)素比例，增加IDD模型中CoL-Ⅱ mRNA的表達(dá)，降低CoL-Ⅰ mRNA的表達(dá)，從而在一定程度上減緩IDD〔38〕。

4.2中醫(yī)非藥物療法對(duì)IDD相關(guān)基因表達(dá)的影響 除中草藥外，針灸、推拿按摩、針刀等均是中醫(yī)治療疾病的特色手段。楊宗保等〔39〕研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)電針I(yè)DD模型兔環(huán)跳穴可降低其髓核細(xì)胞中炎性因子前列腺素(PG)E2、磷脂酶(PL)A2和IL-1α的表達(dá)。林元杰〔40〕通過(guò)針刺IDD大鼠模型腎俞、大腸俞、環(huán)跳、陽(yáng)陵泉發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)脊髓Janus激酶(JAK)2-信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3信號(hào)通路下調(diào)p-JAK2、p-STAT3蛋白含量的表達(dá)來(lái)延緩IDD。佟思琪等〔41〕探討電針夾脊穴對(duì)IDD兔模型椎間盤組織中終板軟骨細(xì)胞水通道蛋白(AQP)1和3基因表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)其通過(guò)上調(diào)蛋白激酶(PK)A-環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)通路的表達(dá)水平，繼而增加AQP1、3 mRNA的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)椎間盤 AQP1、3 蛋白的表達(dá)來(lái)延緩IDD。王偉軍〔42〕通過(guò)手法按摩與MMPs抑制劑治療IDD進(jìn)行了比對(duì)研究，結(jié)果表明中醫(yī)手法在抑制IDD相關(guān)基因Col-1a、MMP-3表達(dá)，增加椎間盤保護(hù)性基因Col-2a、TIMP-1的表達(dá)與MMPs抑制劑四環(huán)素作用相當(dāng)，而中醫(yī)手法按摩在上調(diào)穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)延緩IDD相關(guān)基因Aggrecan、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因了(TGF)-β1、VDR的表達(dá)量較四環(huán)素更明顯。可見(jiàn)中醫(yī)按摩手法對(duì)調(diào)節(jié)IDD相關(guān)基因的表達(dá)延緩IDD的治療效果比四環(huán)素更顯著。此外，有研究表明痛點(diǎn)揉撥推拿手法可使IDD患者的IL-1β表達(dá)水平顯著降低達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)的作用〔43〕。Sun等〔44〕研究結(jié)果表明針刀治療通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白含量，增加CoL-Ⅰ的產(chǎn)生和減少CoL-Ⅱ生成，同時(shí)改進(jìn)椎間盤超微結(jié)構(gòu)來(lái)抑制IDD。

綜上，中醫(yī)藥防治脊柱退變性疾患經(jīng)過(guò)上千年的傳承與發(fā)展，在認(rèn)識(shí)和治療脊柱退變性疾患方面有著豐富的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，隨著中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究、基因蛋白組學(xué)、基因芯片等現(xiàn)代科技的蓬勃發(fā)展，對(duì)IDD的發(fā)病機(jī)制研究從生物分子學(xué)、基因表達(dá)水平相關(guān)方面創(chuàng)造了新的研究平臺(tái)，也為中醫(yī)藥精準(zhǔn)靶向防治IDD的研究提供了理論依據(jù)，支撐中醫(yī)藥防治IDD相關(guān)疾病不斷取得突破，造福廣大患者。但中醫(yī)藥治療IDD疾患的分子生物學(xué)研究大都局限于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，具體試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)或多或少存在缺陷、調(diào)控過(guò)程和級(jí)聯(lián)方式仍未具體有效闡明、相關(guān)信號(hào)通路研究不夠深入。目前仍需要大樣本，多中心的隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)提供更科學(xué)、更準(zhǔn)確、更客觀的依據(jù)進(jìn)行佐證。因此，借助現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)深入研究中醫(yī)藥靶向治療IDD及相關(guān)疾患的相關(guān)研究將是今后努力方向之一。