快速熱激處理對甘薯愈傷層形成及代謝的影響

辛 奇，孫 潔，馮欣欣，趙澤眾，劉幫迪,*，江麗華，郝光飛

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)劃設(shè)計研究院，北京 100125；2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部產(chǎn)地初加工重點實驗室，北京 100121）

甘薯（Ipomone batatasL.）又名甜薯，具有易種植、產(chǎn)量高的特性，是我國糧食作物的重要組成部分[1]。甘薯是一種塊根類作物，具有塊根表皮薄、含水量高、組織易損傷的特點，在機械化或人工的采收、采后過程中極易造成表皮損傷，導(dǎo)致其在貯藏運輸中出現(xiàn)呼吸作用增強以及營養(yǎng)物質(zhì)消耗和外源微生物侵染可能性增加的問題，從而引起甘薯塊根快速腐爛和經(jīng)濟價值降低[2-3]。甘薯塊根受損傷脅迫后體內(nèi)自我防御系統(tǒng)受傷信號傳導(dǎo)，快速啟動自我修復(fù)功能，可在損傷部位重新形成愈傷組織使傷口完全愈合[4]。但自然狀態(tài)下甘薯塊根傷口自我愈合的時間較長，且自然愈傷易受天氣條件影響，管理成本高，處理不當(dāng)還會造成塊根的大面積腐爛。為促進甘薯傷口的快速愈合，理論研究和實際生產(chǎn)中越來越多地采用人工處理條件進行愈傷。有研究報道，通過外源施加農(nóng)藥、激素或含硫化合物等化學(xué)藥物能促進果蔬愈傷相關(guān)代謝途徑，加速損傷組織愈合[5-6]，但化學(xué)藥物殘留及環(huán)境污染的問題一直受到質(zhì)疑。因此，亟待開發(fā)一種安全、高效的采后甘薯愈傷方法。

熱處理是將采后果蔬置于非致死高溫條件下進行短時處理，通過高溫處理殺死病原微生物或抑制其活動，激活果蔬組織內(nèi)相關(guān)酶，從而促進果蔬抗性物質(zhì)積累使傷口快速愈合的一種物理保鮮方法[7]。熱激處理不僅能有效激發(fā)活性氧代謝途徑，誘導(dǎo)抗氧化酶活性升高，催化參與愈傷過程中酚類物質(zhì)與芳香類物質(zhì)的氧化交聯(lián)[8]，還能有效提高苯丙烷代謝途徑中關(guān)鍵酶活性，促進木質(zhì)素、酚類和脂肪酸類等愈傷進程所需成分的積累，加速形成愈傷木栓層，從而提高果蔬的抗性，減少腐爛的發(fā)生[9-11]。目前國內(nèi)外對于果蔬愈傷技術(shù)的研究主要集中在馬鈴薯上，如韓占紅等[12]將‘隴薯7號’馬鈴薯塊莖置于常溫（20～25 ℃）、相對濕度70%～80%黑暗環(huán)境中愈傷，發(fā)現(xiàn)愈傷期間馬鈴薯塊莖傷口處苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）和過氧化物酶（peroxidase，POD）活性始終高于未愈傷處理組，木質(zhì)素、總酚和部分單體酚不斷積累；對傷口處組織進行觀察發(fā)現(xiàn)，有明顯的木質(zhì)素、軟木脂及酚類等愈傷成分沉積。宋若茗等[13]指出，國內(nèi)外關(guān)于甘薯的專業(yè)愈傷技術(shù)研究十分匱乏，新型技術(shù)研究較少且推廣力度不夠。根據(jù)對山東、河北、福建等我國甘薯主產(chǎn)區(qū)進行實地調(diào)研和美國甘薯產(chǎn)業(yè)文獻(xiàn)[6]調(diào)研情況分析發(fā)現(xiàn)，目前甘薯采后最主要應(yīng)用的愈傷技術(shù)是整庫（窖）加熱封閉愈傷，具體條件為（35±2）℃處理2～7 d，并且在整庫（窖）甘薯愈傷期間不開啟庫門。該愈傷處理技術(shù)雖然可以減少部分采后病害和損失，但是存在愈傷均一性較差、愈傷效率極低、愈傷效果不可控、熱能大量浪費和不滿足小批量處理需求等問題，亟待開發(fā)新型甘薯愈傷技術(shù)解決上述問題。

因此，為了滿足甘薯產(chǎn)業(yè)中小批量生產(chǎn)、連續(xù)作業(yè)、處理效果均一、低碳環(huán)保等需求，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，提出一種專用于甘薯的較高溫度、更短時間的熱刺激愈傷處理方式——快速熱激處理（rapid heat treatment，RHT），并探討RHT對甘薯塊根愈傷組織形成的影響，觀察塊根傷口處木質(zhì)素和軟木脂沉積情況，分析愈傷木栓層形成相關(guān)的活性氧代謝和苯丙烷代謝變化，以期為采后甘薯塊根的快速愈傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試‘大葉紅’甘薯于2019年7月16日購于福建漳州禾谷鳥生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，單果套袋后裝箱（20個/箱），第2天運抵農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后處理重點實驗室（北京）。挑選外觀整齊、大小均勻（（250±50）g）、無損傷且無病蟲害的新鮮甘薯作為實驗材料。

過氧化氫測定試劑盒、羥自由基測定試劑盒、抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基測試盒 南京建成生物工程研究所有限公司；羥胺鹽酸、正己烷、冰乙酸 北京化工廠；L-苯丙氨酸 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DM500顯微鏡 德國徠卡公司；UV-1800P型紫外-可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司；HH-2A電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；TGL-16gR高速冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；LAC-350HPY-2人工氣候箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甘薯塊根人工損傷與熱激處理

將新鮮甘薯塊根用清水溫和洗滌2 次，用蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。不銹鋼刀和打孔器（直徑為15 mm）經(jīng)體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液擦拭消毒后，先利用打孔器在每個甘薯上做圓形標(biāo)記，再用不銹鋼刀沿打孔器標(biāo)記處對甘薯表皮切出直徑為15 mm、深度為3 mm的傷口，每個甘薯分上中下隨機取6 處傷口。

實驗設(shè)置3個組，分別是快速熱激愈傷處理組（RHT）、傳統(tǒng)窖藏式長時間低溫度熱激處理組（陽性對照，CK+）和不熱激處理組（陰性對照，CK-）。RHT方式和條件為本課題組前期研究優(yōu)化所得結(jié)果[14]，CK+熱激處理條件、方式為本課題組前期調(diào)研結(jié)果[14-15]，具體條件和其他參數(shù)[14,16]如表1所示。由于植物愈傷是一個長時間的過程，為完整地觀察愈傷情況和差異，將甘薯熱激之后貯藏于（13±1）℃和相對濕度（80±5）%條件下，設(shè)定熱處理和貯藏時間共為7 d。

表1 熱激實驗設(shè)計和相關(guān)參數(shù)Table 1 Experimental design and parameters of heat treatments

分別在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7 d取樣，取樣時先用不銹鋼刀切取甘薯塊根創(chuàng)傷部位和其下（2.0±0.5）mm處的愈傷組織，一部分用于木質(zhì)素和軟木脂沉積情況觀察。剩余樣品則立即用液氮冷凍粉碎，混勻后封于自封袋中，在（-80.0±0.2）℃超低溫冰箱中冷凍保存，以備各項指標(biāo)測定。每組處理用甘薯100個，重復(fù)3 次。

1.3.2 甘薯形成愈傷后傷口處木質(zhì)素積累和軟木脂積累情況觀察

木質(zhì)素沉積情況觀察參照Alba等[17]的方法并作修改，采用雙面不銹鋼刀片將上述已取下的愈傷組織切成0.2～0.3 mm厚薄片，浸泡于蒸餾水中，按照以下步驟進行木質(zhì)素染色：取切好的薄片，置于載玻片上，先滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的間苯三酚溶液，立即滴加濃鹽酸染色1 min，蓋上蓋玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

軟木脂沉積情況觀察參照Lulai等[18]的方法并作修改，采用雙面不銹鋼刀片將上述已取下的愈傷組織切成0.2～0.3 mm厚薄片，浸泡于蒸餾水中，將切好的薄片置于載玻片上，按照以下步驟進行軟木脂染色：初染：先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%的甲苯胺藍(lán)染液染色45 min；脫染料：用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液沖洗3 次，再用蒸餾水沖洗干凈；復(fù)染：用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的中性紅染液染色1 min；脫染料：用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液沖洗3 次，再用蒸餾水沖洗干凈；觀察：將染好的切片置于載玻片上，蓋上蓋玻片在藍(lán)色熒光顯微鏡下觀察拍照。

木質(zhì)素和軟木脂沉積厚度的測量：采用圖像分析軟件對染色后的木質(zhì)素沉積和軟木質(zhì)沉積厚度進行測量，使用軟件標(biāo)準(zhǔn)卡尺功能對染色部位進行垂直方向高度測量，每張染色照片均取左中右3個點，每個取樣點測定不少于5 張染色照片，計算平均值。

1.3.3 過氧化氫、羥自由基和超氧陰離子自由基含量的測定

過氧化氫（H2O2）和羥自由基（·OH）含量的測定：分別稱取2 g冷凍愈傷組織置于10 mL離心管中，加入5 mL 0.1 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液混勻后，離心（4 ℃、10 000 r/min）20 min，收集上清液，按照對應(yīng)試劑盒說明書步驟依次加入相應(yīng)的試劑，混勻后，分別于405 nm（H2O2）和550 nm（·OH）波長處測定其吸光度。H2O2含量單位為mmol/g，·OH含量單位為U/g。

1.3.4 活性氧代謝相關(guān)酶活力的測定

稱取2 g冷凍愈傷組織置于10 mL離心管中，加入5 mL 0.1 mol/L pH 7.5磷酸緩沖液（含0.005 mol/L二硫蘇糖醇和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%聚乙烯吡咯烷酮）混勻后，離心（4 ℃、10 000 r/min）30 min，收集上清液用于活性氧代謝相關(guān)酶活力的測定。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力測定采用氮藍(lán)四唑光還原法[19]；過氧化氫酶（catalase，CAT）活力的測定采用比色法[19]；抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力的測定采用紫外分光光度法[19]；POD活力的測定參考張靜榮等[5]的方法；多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力的測定參考Jiang Hong等[20]的方法。以上酶活力單位均為U/g，均以樣品濕質(zhì)量計。

1.3.5 抗氧化活性的測定

取5 g冷凍愈傷組織置于離心管（50 mL）中，加入20 mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液，混勻后，超聲處理1 h，離心（4 ℃、10 000 r/min）20 min，取上清液作為提取液。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力的測定參考范新光[21]的方法并作修改，吸取0.05 mL的提取液于試管中，先加入3 mL 0.3 mmol/L DPPH-乙醇溶液，混勻，置于30 ℃條件下水浴1 h后，立即冷卻終止反應(yīng)，于517 nm波長處測定其吸光度，以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算DPPH自由基清除能力，結(jié)果以每100 g樣品反應(yīng)生成Trolox的質(zhì)量表示，單位為mg/100 g。

2,2’-聯(lián) 氮 -二 (3-乙 基 -苯 并 噻 唑 -6-磺 酸 )（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）陽離子自由基清除能力的測定參考范新光[21]的方法并作修改，ABTS工作液的制備：將0.2 mL ABTS水溶液（7.4 mmol/L）和高硫酸鉀水溶液（2.6 mmol/L）混勻，在避光環(huán)境下放置12 h后，再用無水乙醇稀釋12 倍獲得ABTS工作液，備用。測定時取0.05 mL上述提取液于試管中，加入5 mL ABTS工作液混勻后，避光條件下靜置10 min。于734 nm波長處測定其吸光度，以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算ABTS陽離子自由基清除能力，結(jié)果以每100 g樣品反應(yīng)生成Trolox的質(zhì)量表示，單位為mg/100 g。

1.3.6 苯丙烷代謝相關(guān)酶活力的測定

PAL活力的測定參考楊書珍等[22]的方法并作改進，稱取2 g冷凍愈傷組織置于10 mL離心管中，加入5 mL預(yù)冷的硼酸緩沖液，混勻后，離心（4 ℃、1 000 r/min）10 min，取上清液并測量體積。PAL活力測定：取0.1 mL上述提取液、3.9 mL 0.1 mol/L硼酸緩沖液和0.6 mol/LL-苯丙氨酸溶液混勻后，立即于290 nm波長處測定吸光度作為初始值，然后將混合液置于40 ℃恒溫水浴保溫1 h，加入0.2 mL 0.002 mol/L鹽酸溶液終止反應(yīng)，于290 nm波長處測定其吸光度作為終止值，以每分鐘反應(yīng)體系吸光度變化0.01為一個酶活力單位（U），PAL活力單位為U/g，以樣品濕質(zhì)量計，下同。

肉桂酸-4-羥基化酶（cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H）活力的測定參考Wang Caixia等[23]的方法并作改進，稱取2 g冷凍愈傷組織置于10 mL離心管中，加入5 mL 4 ℃預(yù)冷的0.05 mol/L pH 7.5 Tris-HCL緩沖液（含0.015 mol/Lβ-巰基乙醇、0.005 mol/L抗壞血酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15%聚乙烯吡咯烷酮）研磨勻漿，離心（4 ℃、1 000 r/min）10 min，取上清液備用。C4H活力測定：取2.5 mL 0.05 mol/L pH 7.5 Tris-HCL緩沖液（2 μmol/L反式肉桂酸、2 μmol/L氧化型輔酶II二鈉、5 μmol/LD-葡萄糖6-磷酸鹽）和0.5 mL上述提取液混勻，將反應(yīng)混合液置于25 ℃下振蕩30 min后，加入0.1 mL 6 mol/L鹽酸溶液終止反應(yīng)，離心后取上清液，于340 nm波長處測定吸光度。以每分鐘反應(yīng)體系吸光度變化0.01為一個酶活力單位（U），C4H活力單位為U/g。

4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumaric acid coenzyme A ligase，4CL）活力的測定參考Yang Ruirui等[24]的方法并改進，稱取2 g冷凍愈傷組織置于10 mL離心管中，加入5 mL 4 ℃預(yù)冷的0.15 mol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液（含體積分?jǐn)?shù)25%甘油和0.1 mol/L二硫蘇糖醇）研磨勻漿，離心（4 ℃、1 000 r/min）10 min，取上清液備用。4CL活力測定：取0.5 mL 15 μmol/L氯化鎂、0.2 mL 5 μmol/L對香豆酸、0.15 mL 50 μmol/L腺苷三磷酸、0.15 mL輔酶A和0.5 mL上述提取液混勻，將反應(yīng)混合液置于40 ℃下水浴30 min后，加入0.1 mL 6 mol/L鹽酸溶液，離心后取上清液，于333 nm波長處測定吸光度。以每分鐘反應(yīng)體系吸光度變化0.01為一個酶活力單位（U），4CL活力單位為U/g。

肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）活力的測定參考張志鵬等[25]的方法并作改進，稱取2 g冷凍愈傷組織置于10 mL離心管中，加入5 mL 4 ℃預(yù)冷的0.1 mmol/L pH 6.25磷酸緩沖液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、體積分?jǐn)?shù)2%聚乙二醇和0.1 mol/Lβ-巰基乙醇）研磨勻漿后，于4 ℃下超聲處理20 min，離心（4 ℃、1 000 r/min）10 min，取上清液備用。CAD活力測定：取1 mL 0.01 mol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、1.2 mL反式肉桂酸和0.3 mL上述提取液混勻，將反應(yīng)混合液置于37 ℃下水浴30 min后，加入0.1 mL 6 mol/L鹽酸溶液，離心并取上清液，置于340 nm波長處測定吸光度。以每分鐘反應(yīng)體系吸光度變化0.01為一個酶活力單位（U），CAD活力單位為U/g。

1.3.7 總酚和木質(zhì)素含量的測定

總酚含量的測定參考李昌健等[26]的方法并作改進，取冷凍甘薯愈傷組織1 g，加入提前預(yù)冷的6 mL體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸-甲醇溶液，轉(zhuǎn)入離心管于黑暗4 ℃環(huán)境下反應(yīng)20 min，離心（4 ℃、8 000 r/min）15 min，吸取上清液在280 nm波長處測定光密度值。總酚含量單位為OD280nm/g。

木質(zhì)素含量的測定參考Hamerschmidt[27]的方法并作改進。取冷凍愈傷組織1 g，加入4 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，用打漿機打勻，轉(zhuǎn)入離心管中4 ℃、10 000 r/min離心20 min，棄掉上清液后，加入2 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液混勻后離心（4 ℃、10 000 r/min）10 min，重復(fù)上述操作3 次，再用V（乙醇）∶V（正己烷）＝1∶2的溶液將沉淀物反復(fù)沖洗3 次，收集沉淀將其烘干至恒質(zhì)量后移至小試管中，測定前需提前將水浴鍋置于通風(fēng)櫥中預(yù)熱至70 ℃，先向試管中加入1 mL體積分?jǐn)?shù)25%溴化乙酰溶液，混勻，立即置于水浴鍋中反應(yīng)30 min后，依次加入1 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液、0.1 mL 7.5 mol/L鹽酸羥胺溶液和2 mL冰醋酸，隨后4 ℃、10 000 r/min離心20 min，吸取上清液0.5 mL，用冰醋酸定容至5 mL，于280 nm波長處測定光密度值，重復(fù)3 次。木質(zhì)素含量單位為OD280nm/g。

1.3.8 甘薯塊根愈傷組織中酚類物質(zhì)含量測定

甘薯愈傷組織中酚類物質(zhì)含量的測定參考范新光[21]的方法并作修改，實驗所用的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀配有LC-20AT泵、C18反相柱（粒徑5 μm）和SPD-M20A二極管陣列檢測器；測定參數(shù)為柱溫35 ℃、流速1 mL/min、進樣體積20 mL、流動相A為1%乙醇溶液、流動相B為甲醇。提取液制備：取5 g冷凍愈傷組織置于離心管（50 mL）中，加入20 mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液混勻，混合液超聲處理1 h，隨后離心（4 ℃、10 000 r/min）20 min，取上清液作為提取液。HPLC條件：將甘薯愈傷組織提取液按照0～15 min 12%～25% B、15～25 min 25%～35% B、25～50 min 35%～55% B、50～60 min 55%～65% B、60～70 min 65%～12% B進行分離，于280 nm波長處測定吸光度。使用實驗室配制的混合標(biāo)準(zhǔn)品對甘薯愈傷組織的酚類物質(zhì)進行定性和定量分析。酚類化合物的含量單位為mg/g。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

以上實驗均做3 次重復(fù)，采用Excel 2010軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差并繪圖，用SPSS 18.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析和多重差異顯著分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 RHT對甘薯愈傷期間傷口處木質(zhì)素和軟木脂沉積的影響

如圖1所示，愈傷期間，甘薯傷口部位的木質(zhì)素不斷沉積，木栓化周皮的細(xì)胞組織不斷加厚，軟木脂不斷沉積。木質(zhì)素經(jīng)間苯三酚-HCl染色后呈現(xiàn)紅色，木質(zhì)素含量越高顏色越深。愈傷2～6 d時，CK+和RHT甘薯傷口處的木質(zhì)素染色程度始終深于CK-，木栓細(xì)胞組織厚度明顯大于CK-，對比RHT和CK+甘薯發(fā)現(xiàn)，RHT的愈傷效果更為明顯，其最終木質(zhì)素染色更深、厚度更大（圖1A）。由圖2A可知，木質(zhì)素沉積厚度隨著愈傷時間的延長逐漸增加，愈傷6 d時，RHT和CK+甘薯木質(zhì)素沉積厚度分別為49 μm和47 μm，木栓細(xì)胞較小且排列緊密。而CK-的木質(zhì)素沉積厚度僅為40 μm，木栓細(xì)胞較大、排列松散。軟木脂是構(gòu)成甘薯愈傷組織的重要成分之一，它是由脂肪酸代謝途徑作用下產(chǎn)生的大量α-、ω-二元酸，ω-羥基酸和脂肪酸類物質(zhì)單體通過酯鍵連接聚合而成，這些單體物質(zhì)能與甲苯胺藍(lán)中的陽離子結(jié)合而被染成紫藍(lán)色[28]。隨著愈傷時間的延長，各處理組軟木脂自發(fā)熒光強度逐漸增強，細(xì)胞厚度也不斷增加（圖1B），其中RHT和CK+甘薯自發(fā)熒光始終強于CK-。從圖2B可以看出，RHT和CK+甘薯軟木脂沉積厚度明顯高于CK-，愈傷6 d時分別比CK-高80.09%和72.54%。木質(zhì)素的產(chǎn)生速率和積累量可反映果蔬傷口損傷愈合的效果。由圖2C可知，損傷甘薯在愈傷期間木質(zhì)素含量總體呈上升的趨勢；與CK-相比，CK+和RHT甘薯愈傷期間木質(zhì)素產(chǎn)生速率始終高于CK-，其中RHT甘薯木質(zhì)素在前期愈傷過程（0～2 d）中積累較少，之后開始大量積累，愈傷6～7 d時趨于平緩。上述實驗結(jié)果表明，RHT能夠促進甘薯塊根傷口處木質(zhì)素和軟木脂的沉積。

圖1 RHT對甘薯愈傷期間傷口處木質(zhì)素（A）和軟木脂（B）沉積的影響Fig. 1 Effect of RHT on the deposition of lignin (A) and softwood resin (B)at the wound site

圖2 RHT對甘薯愈傷期間傷口處木質(zhì)素（A）和軟木脂（B）沉積厚度及木質(zhì)素含量（C）的影響Fig. 2 Effect of RHT on the deposition thickness of lignin (A) and suberin (B) and lignin content (C) at the wound site during healing

2.2 RHT對甘薯愈傷期間傷口處H2O2、·OH和O-2·積累的影響

果蔬在受到外界損傷脅迫或病原菌侵染時，會誘導(dǎo)體內(nèi)H2O2、·OH和等活性氧物質(zhì)的快速積累，其作為信號分子誘導(dǎo)采后果蔬抗逆性增加[29]。愈傷期間，對照組（CK+和CK-）和RHT甘薯H2O2含量均呈逐漸上升的趨勢（圖3A）。RHT甘薯組織中H2O2含量在愈傷7 d時達(dá)到最大值（57.66 mmol/g），與CK+沒有顯著差異，而CK-的H2O2含量僅有41.68 mmol/g。各處理組產(chǎn)生的·OH從愈傷第2天開始也呈逐漸上升的變化趨勢（圖3B）。RHT和CK+甘薯·OH含量始終高于CK-，在愈傷3～5 d時各組·OH含量急劇升高，這可能是苯丙烷代謝產(chǎn)生的大量酚類物質(zhì)激活調(diào)控活性氧產(chǎn)生的相關(guān)酶，導(dǎo)致·OH大量積累[30]。愈傷7 d時，RHT和CK+甘薯·OH含量均達(dá)到最大值，RHT組分別比CK-和CK+高67.89%和6.64%。甘薯愈傷組織中含量的變化趨勢（圖3C）與·OH含量的變化趨勢（圖3B）相似。愈傷前期（0～3 d）各組處理基本沒有明顯變化，從愈傷3 d開始呈明顯上升的趨勢，其中RHT甘薯含量始終處于較高水平，愈傷7 d時達(dá)到168.94 U/g，顯著高于CK-（P＜0.05），與CK+沒有顯著差異。上述結(jié)果表明，RHT可以明顯誘導(dǎo)甘薯塊根短期內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)，從而促進甘薯愈傷。

圖3 RHT對甘薯愈傷期間傷口處H2O2（A）、·OH（B）和（C）積累的影響Fig. 3 Effect of RHT on the accumulation of H2O2 (A), hydroxyl radical (B) and superoxide anion radial (C) in sweet potato callus during healing

2.3 RHT對甘薯愈傷期間傷口處SOD、CAT、APX、POD和PPO活力的影響

如圖4A、B所示，愈傷期間，甘薯的SOD和CAT活力呈不斷上升的趨勢，RHT組總體顯著高于對照組（CK+和CK-）（P＜0.05）。APX活力則呈先升高后降低的趨勢，愈傷2.5 d和4 d時，RHT和CK+甘薯的APX活力分別達(dá)到峰值，之后開始逐漸下降（圖4C），這可能是甘薯受應(yīng)激脅迫影響使得APX活力在愈傷前期迅速升高，而在愈傷后期，細(xì)胞活性氧代謝系統(tǒng)平衡被破壞，導(dǎo)致APX活力降低[31]。POD和PPO是愈傷過程中重要的防御酶，可有效清除活性氧自由基，減輕氧化損傷，增加甘薯的抗性。由圖4D、E可知，隨著愈傷時間的延長，各處理組POD和PPO活力總體呈上升的趨勢，RHT甘薯POD活力始終高于對照組（CK+和CK-），愈傷4～7 d時達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）。PPO活力在愈傷0～2.5 d時各組的差異不明顯，3 d時CK-的PPO活力有所降低，這可能由于愈傷組織在形成過程中活性氧代謝紊亂，抑制了膜脂的過氧化作用[32]。RHT和CK+甘薯的PPO活力在愈傷7 d時明顯高于CK-，分別達(dá)到42 U/g和39 U/g。

圖4 RHT對甘薯愈傷期間傷口處SOD（A）、CAT（B）、APX（C）、POD（D）和PPO（E）活力的影響Fig. 4 Effect of RHT on the activities of SOD (A), CAT (B), APX (C),POD (D) and PPO (E) in sweet potato callus during healing

2.4 RHT對甘薯愈傷期間傷口處DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力的影響

從圖5可以看出，甘薯愈傷組織DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力的變化趨勢基本一致，總體呈上升趨勢，其中RHT甘薯的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力均顯著高于其他兩組（P＜0.05），在愈傷7 d時達(dá)到最大值（209.1 mg/100 g和168.2 mg/100 g），分別是CK+的1.16 倍和1.25 倍，而CK-的DPPH自由基清除能力呈單峰型變化趨勢，在第5天時達(dá)到最大值，ABTS陽離子自由基清除能力則呈緩慢上升的趨勢，這可能是甘薯愈傷組織在形成過程中活性氧代謝失衡，導(dǎo)致抗氧化能力降低[33]。

圖5 RHT對甘薯愈傷期間傷口處DPPH自由基（A）和ABTS陽離子自由基（B）清除能力的影響Fig. 5 Effect of RHT on DPPH radical (A) and ABTS cation radical (B)scavenging capacity in sweet potato callus during healing

2.5 RHT對甘薯愈傷期間傷口處黃酮及酚類化合物的影響

酚類物質(zhì)作為合成甘薯木栓層和木質(zhì)素的前體物質(zhì)，是構(gòu)成甘薯塊根愈傷周皮的主要組成成分之一[5]。利用HPLC法對RHT甘薯愈傷組織中酚類物質(zhì)進行分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)甘薯愈傷組織中的酚類物質(zhì)主要有新綠原酸、兒茶素、綠原酸和表兒茶素4種酚類物質(zhì)。由圖6可知，愈傷期間，各組處理的總酚和蘆丁含量變化趨勢基本一致（圖6A、B），愈傷前2 d各處理組間總體無明顯差異，之后對照組（CK+和CK-）總酚含量出現(xiàn)逐漸下降后上升的趨勢，這可能與PPO不斷催化酚類物質(zhì)氧化生成醌類化合物有關(guān)[34]；而RHT甘薯則呈不斷上升的趨勢，愈傷5 d時達(dá)到了峰值，顯著高于對照組（CK+和CK-）（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，RHT能在一定程度上促進甘薯傷口處總酚和類黃酮的產(chǎn)生和積累。新綠原酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素和蘆丁5種單酚類物質(zhì)的變化趨勢也基本一致，總體呈逐漸上升的趨勢，新綠原酸、綠原酸和蘆丁愈傷前1.5 d各組間差異較小，愈傷后期（2～7 d），RHT甘薯新綠原酸、綠原酸和蘆丁含量整體顯著高于CK-和CK+（P＜0.05），其中愈傷7 d時，RHT甘薯綠原酸含量達(dá)到0.379 mg/g，分別是CK+和CK-甘薯的1.04 倍和1.08 倍。甘薯在愈傷期間兒茶素和表兒茶素含量也呈逐漸上升的變化趨勢，其中RHT甘薯兒茶素和表兒茶素含量始終高于其他各組，愈傷0～2 d時，RHT甘薯兒茶素和CK+之間沒有顯著差異，愈傷7 d時，RHT甘薯的兒茶素含量顯著高于對照組（CK+和CK-）（P＜0.05），而RHT甘薯表兒茶素含量在整個愈傷過程中始終處于較高水平，第7天時達(dá)到0.063 mg/g，分別比CK+和CK-甘薯高出46.51%和70.27%，說明采后RHT能夠有效促進甘薯愈傷過程中酚類化合物的積累，幫助甘薯傷口快速形成愈傷木栓組織。

圖6 RHT對甘薯愈傷期間傷口處總酚（A）、蘆?。˙）、新綠原酸（C）、綠原酸（D）、表兒茶素（E）和兒茶素（F）含量的影響Fig. 6 Effects of RHT on the contents of total phenols (A), rutin (B),neochlorogenic acid (C), chlorogenic acid (D), epicatechin (E) and catechin (F) in sweet potato callus during healing

2.6 RHT對甘薯愈傷期間傷口處PAL、C4H、4CL和CAD活力的影響

如圖7A所示，在愈傷過程中，隨著愈傷時間的延長，3個組甘薯PAL活力呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，RHT甘薯PAL活力始終顯著高于對照組（CK+和CK-），0.5 d時就受熱刺激促使PAL活力大幅上升，而CK+甘薯愈傷組織PAL活力在1.5 d時才大幅度上升。愈傷期間4CL和C4H活力的變化趨勢基本一致（圖6B、C），RHT和CK+甘薯的4CL和C4H活力均呈先升高后逐漸下降的趨勢，且RHT甘薯4CL和C4H活力峰值提前于CK+出現(xiàn)。RHT甘薯的CAD活力呈先上升后下降的趨勢，愈傷2 d時達(dá)峰值，顯著高于CK+和CK-（P＜0.05）。CK+和CK-甘薯的CAD活力則呈逐漸上升的趨勢，在愈傷7 d時，CK+甘薯的CAD活力達(dá)到了0.164 U/g，與RHT組沒有顯著差異，而CK-甘薯的CAD活力僅有0.113 U/g。上述結(jié)果表明，RHT能在短時間內(nèi)誘導(dǎo)甘薯愈傷組織中關(guān)鍵酶活性快速升高，激活苯丙烷代謝，對甘薯傷口的快速愈合具有積極作用。

圖7 RHT對甘薯愈傷期間傷口處PAL（A）、4CL（B）、C4H（C）和CAD（D）活力的影響Fig. 7 Effect of RHT on the activity of PAL (A), 4CL (B), C4H (C) and CAD (D) in sweet potato callus during healing

3 討 論

果蔬在采后的愈傷過程主要涉及細(xì)胞增殖與分化、信號傳導(dǎo)、抗病反應(yīng)、次生代謝和能量產(chǎn)生等過程[35]。但目前采后果蔬的愈傷還屬一個較新的研究方向，相關(guān)研究較少，許多研究指出馬鈴薯、甘薯等塊根類作物愈傷途徑主要涉及3個部分，包括活性氧代謝、脂肪酸代謝和苯丙烷代謝[36]，并且這3 條代謝途徑中涉及的相關(guān)酶系參與整個愈傷過程。

活性氧在塊莖愈傷組織形成過程中具有信號分子和氧化交聯(lián)雙重作用[37]。如圖8所示，研究指出甘薯受到外界損傷脅迫及外來病原菌侵染時，由于自身的應(yīng)激反應(yīng)刺激細(xì)胞膜外Ca2+內(nèi)流，從而導(dǎo)致膜內(nèi)Ca2+濃度升高[38]，而膜內(nèi)鈣依賴蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase，CDPK）作為鈣離子識別蛋白，可以識別并結(jié)合Ca2+，這種聚合物在磷酸化后由呼吸爆發(fā)氧化酶同系物（respiratory burst oxidase homologues，Rbohs）作用產(chǎn)生大量和·OH。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甘薯受到RHT處理帶來的溫度刺激時，活性氧代謝途徑快速響應(yīng)，迅速累積大量·OH和。這些活性氧的大量聚集破壞了甘薯自有的活性氧代謝平衡，從而致使甘薯體內(nèi)SOD、PPO、POD等相關(guān)抗氧化酶大量產(chǎn)生，此后在SOD的歧化作用下，這些活性氧歧化生成大量H2O2，進而加速細(xì)胞核引導(dǎo)的兩條糖代謝途徑的次生代謝（脂肪酸代謝和苯丙烷代謝）[39]。在苯丙烷代謝途徑下，愈傷組織會產(chǎn)生大量單酚類物質(zhì)，并且在相關(guān)酶的催化下形成聚酚軟木脂（suberin polyphenolic，SPP），此外單酚類物質(zhì)還可以參與木質(zhì)素特異代謝途徑，合成大量木質(zhì)素從而堆疊在愈傷組織周圍[40]。在脂肪酸代謝途徑下，愈傷組織會產(chǎn)生的大量小分子脂肪酸，并聚合形成大分子脂肪酸，最終堆疊成為聚酯軟木脂（suberin polyaliphatic，SPA）。脂肪酸代謝途徑生成的SPA和苯丙烷代謝途徑生成的SPP最終參與聚合生成軟木脂生物聚合物，作為愈傷層的最終沉積物質(zhì)形成封閉層[41]。

圖8 熱激處理參與甘薯塊莖愈傷的代謝通路模式圖Fig. 8 Pattern of metabolic pathways involved in callus of sweet potato tuber under heat shock treatment

本研究發(fā)現(xiàn)，在活性氧代謝過程中，受損甘薯在RHT的溫度刺激效應(yīng)下，活性氧代謝途徑快速響應(yīng)，迅速累積大量·OH和，打破甘薯自有的活性氧代謝平衡，誘導(dǎo)SOD、CAT、APX、POD和PPO等活性氧途徑酶活性快速上升，且SOD的大量活化使得歧化反應(yīng)進程加快，生成更多的H2O2，刺激甘薯細(xì)胞內(nèi)苯丙烷代謝途徑。并且POD可在H2O2的作用下通過氧化交聯(lián)參與SPP和木質(zhì)素的聚合[42]，參與受損甘薯傷口愈合。此外，RHT提高了甘薯愈傷組織中DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力，維持甘薯愈傷組織中活性氧代謝的穩(wěn)定，參與甘薯塊根的愈傷。

另一方面，熱激處理下產(chǎn)生的大量H2O2促進細(xì)胞糖代謝進程，促使胞內(nèi)苯丙烷代謝加速。此過程主要分為兩個部分，首先是在苯丙烷代謝產(chǎn)生酚類單體過程中，熱激處理使甘薯受損組織愈傷時期相關(guān)代謝酶含量較對照組總體顯著上升（P＜0.05），尤以PAL和4CL兩種重要代謝酶為代表，相關(guān)研究表明，PAL和4CL活性越高，表明甘薯受損部位愈傷能力越強[43]，對苯丙烷代謝產(chǎn)生聚酚軟木脂結(jié)構(gòu)域的過程起到有益作用；其次是熱激處理可促進苯丙烷代謝支路中木質(zhì)素的產(chǎn)生。研究結(jié)果表明，對比對照組，RHT顯著促進了苯丙烷代謝中木質(zhì)素含量的增加（P＜0.05）。這一結(jié)果與李昌健[26]和李雪[44]等在馬鈴薯塊莖愈傷中觀察到的結(jié)果相似。可以推測，甘薯在熱激條件下可通過促進胞內(nèi)苯丙烷代謝途徑，進而促進甘薯受傷組織愈傷層的快速形成。

綜上所述，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，采用65 ℃熱激15 min處理與傳統(tǒng)愈傷處理對甘薯塊根進行愈傷，通過觀察塊根傷口處木質(zhì)素和軟木脂沉積，分析活性氧代謝和苯丙烷代謝活性變化，證實了熱激處理對采后甘薯塊根愈傷的促進作用并闡釋其機理，可為采后甘薯塊根的快速愈傷提供理論和方法依據(jù)。但是，本探究還存在一些可延伸研究的部分，例如未對糖代謝過程中脂肪酸代謝及苯丙烷代謝的相關(guān)代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)錄的基因表達(dá)情況進行探究，后續(xù)將進行深入探究，補充完善熱激促進甘薯愈傷的深層機理，以期為減少甘薯實際生產(chǎn)貯運中的損失提供新方法和新思路。

4 結(jié) 論

本研究采用RHT（65 ℃熱激15 min）與傳統(tǒng)窖藏長時間低溫度的熱處理（35 ℃熱處理2 d）對甘薯塊根進行愈傷處理，通過分析活性氧代謝和苯丙烷代謝途徑中相關(guān)酶活性變化和中間產(chǎn)物的累積情況，對比未經(jīng)熱處理的甘薯，發(fā)現(xiàn)RHT對采后甘薯塊根愈傷有顯著促進作用，特別是在第0～2天內(nèi)，能夠明顯刺激活性氧代謝途徑的H2O2和積累，激活傷口周圍組織的SOD活性。RHT能夠使甘薯傷口組織苯丙烷代謝途徑快速響應(yīng)，大量產(chǎn)生并累積兒茶素、蘆丁、綠原酸等多酚物質(zhì)，從而加速木質(zhì)素和愈傷木栓層的形成。