植物乳桿菌KSFY04通過調(diào)節(jié)核因子κB信號(hào)通路干預(yù)小鼠血栓形成的效果

趙 欣，劉 佳，易若琨,2，騫 宇，楊貞耐

（1.重慶第二師范學(xué)院 重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400067；2.北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048）

我國新疆地區(qū)幅員遼闊，畜牧業(yè)發(fā)達(dá)，擁有大量優(yōu)質(zhì)牧場。同時(shí)，新疆地區(qū)少數(shù)民族眾多，各少數(shù)民族都有自己較為獨(dú)特的飲食習(xí)慣，但是大部分均有食用乳制品的習(xí)慣。牧民家庭制作的自然發(fā)酵酸乳是最常食用的乳制品之一[1]。因?yàn)樾陆贁?shù)民族牧民有食用自然發(fā)酵酸乳的習(xí)慣，這些自然發(fā)酵乳制品中的微生物經(jīng)過上千年的自然馴化，已經(jīng)適應(yīng)了新疆的生存環(huán)境并且具有不同的發(fā)酵特性及益生功能，極具開發(fā)利用價(jià)值[2-3]。

經(jīng)濟(jì)發(fā)展促進(jìn)了我國國民生活水平的提高，也使居民飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，大量不健康食品的攝入易造成心腦血管疾病等多種慢性疾病的發(fā)病率增加，嚴(yán)重威脅中老年人的身體健康[4]。心腦血管疾病具有突發(fā)性特點(diǎn)，發(fā)病突然、及時(shí)救治困難，嚴(yán)重威脅患者的生命[5]。內(nèi)源性或外源性損傷引起的血液流動(dòng)異常是引發(fā)心腦血管疾病的重要因素，進(jìn)而加劇機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)[6]。而炎癥也是誘發(fā)血栓形成的一個(gè)重要因素，同時(shí)血栓形成又會(huì)進(jìn)一步加劇炎癥[7]。血栓會(huì)對機(jī)體器官造成一定損傷，隨著后續(xù)炎癥和血栓程度的加劇，機(jī)體器官損傷程度隨之加劇[8]。嚴(yán)重的血栓會(huì)導(dǎo)致復(fù)雜炎癥，使肝臟、腎臟等多器官發(fā)生功能障礙和組織壞死[9]。炎癥狀態(tài)下，大量促炎因子使血液處于高凝狀態(tài)，引起血栓形成；同時(shí)血栓又會(huì)加劇機(jī)體炎癥的發(fā)生和發(fā)展，炎癥和血栓的交互作用形成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，造成心腦血管等器官和組織的嚴(yán)重?fù)p傷[10]。

角叉菜膠能夠引發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，大量炎癥因子會(huì)快速進(jìn)入血液循環(huán)，從而引發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷或死亡，并最終導(dǎo)致血栓的形成。鼠尾血管是單循環(huán)血管，發(fā)生血栓后無法通過側(cè)支循環(huán)進(jìn)行血液循環(huán)，鼠尾組織將逐漸缺血，造成組織壞死[11]。因此，本研究采用角叉菜膠建立小鼠尾血栓，觀察植物乳桿菌KSFY04（Lactobacillus plantarumKSFY04，LP-KSFY04）對血栓形成的減輕作用。LP-KSFY04是本團(tuán)隊(duì)從新疆喀什地區(qū)維吾爾族家庭自產(chǎn)自然發(fā)酵酸乳中分離鑒定出的一株乳酸菌，本實(shí)驗(yàn)通過動(dòng)物模型研究LP-KSFY04通過NF-κB通路調(diào)節(jié)炎癥減輕血栓形成的作用，以抗血栓藥物雙嘧達(dá)莫作為陽性對照，比較評價(jià)LP-KSFY04對心腦血管疾病和組織器官損傷的潛在功能性作用，以期為LP-KSFY04作為益生菌的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LP-KSFY04分離鑒定于新疆喀什地區(qū)維吾爾族家庭自產(chǎn)自然發(fā)酵酸牛乳，菌種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，專利保藏號(hào)為CGMCC No. 15657。

SPF級(jí)6 周齡雄性昆明小鼠，體質(zhì)量（23±2）g，購于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（渝）2018-0003。本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：2021050005B。

雙嘧達(dá)莫 亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6和IL-1β檢測試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；TRIzol試劑 美國Invitrogen公司；SYBR Green PCR Master Mix、定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）引物美國Thermo Fisher Scientific公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PUN-2048A半自動(dòng)血凝儀 北京普朗有限公司；BX43顯微鏡 日本奧林巴斯公司；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀、StoponePlus定量PCR儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

小鼠飼養(yǎng)在溫度（20±1）℃、相對濕度30%～40%環(huán)境下，自由采食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。50 只昆明小鼠隨機(jī)分為5 組，每組10 只，分別為正常組、模型組、藥物陽性對照組、LP-KSFY04低劑量處理（LP-KSFY04-L）組和LP-KSFY04高劑量處理（LP-KSFY04-H）組。正常組小鼠按0.01 mL/（gmb·d）腹腔注射生理鹽水，其余各組小鼠按照0.01 mL/（gmb·d）腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的角叉菜膠溶液[12]；同時(shí)，藥物陽性對照組小鼠按20 mg/（kgmb·d）灌胃雙嘧達(dá)莫溶液，LP-KSFY04-L組和LP-KSFY04-H組小鼠按108CFU/（kgmb·d）和 109CFU/（kgmb·d）的劑量灌胃LP-KSFY04菌懸液，持續(xù)10 d。灌胃結(jié)束后小鼠斷頸處死，記錄各組小鼠尾部黑尾（血栓）長度，同時(shí)心臟取血和取內(nèi)臟待測。

1.3.2 凝血指標(biāo)檢測

將收集到的小鼠心臟血液采用半自動(dòng)血凝儀測定活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）水平和凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）。

1.3.3 血清和組織炎癥細(xì)胞因子水平測定

將收集到的小鼠心臟血液在1 500 r/min、4 ℃離心10 min，取上層血清待用。同時(shí)稱取0.1 g腎臟和肝臟組織分別加入0.9 mL生理鹽水，4 000 r/min、4 ℃均質(zhì)10 min，離心后收集上清液待用。按檢測試劑盒說明書方法測定血清和組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

1.3.4 組織病理學(xué)變化觀察

解剖小鼠后，將小鼠腎臟、肝臟和尾部組織用10%福爾馬林溶液固定。脫水48 h后將組織樣品包埋在石蠟中，切片，并用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，用光學(xué)顯微鏡觀察組織病理學(xué)變化[13]。

1.3.5 小鼠尾靜脈組織炎癥及血栓形成相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平檢測

稱取0.1 g小鼠尾靜脈組織，加入0.9 mL生理鹽水，勻漿，再加入1.0 mL RNAzol提取小鼠尾靜脈組織RNA，使用超微分光光度法在260 nm和280 nm波長處測定吸光度，計(jì)算RNA純度和濃度，調(diào)整RNA質(zhì)量濃度為1 μg/μL。然后通過反轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，配制含1 μL cDNA的反應(yīng)體系，其余試劑包括SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、無菌蒸餾水7 μL和上、下游引物各1 μL。qPCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃、60 s，95 ℃、15 s，40個(gè)循環(huán)；55 ℃、30 s，72 ℃、35 s，95 ℃、30 s，55 ℃、35 s。選擇GAPDH作為內(nèi)參，按2-ΔΔCt法計(jì)算NF-κB p65、IL-6、TNF-α、細(xì)胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）和選擇素E（E-selectin）基因相對表達(dá)量[14]。引物序列如表1所示。

表1 本實(shí)驗(yàn)中使用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this experiment

1.3.6 小鼠糞便中微生物mRNA表達(dá)的測定

稱取1.0 g小鼠糞便，根據(jù)1.3.5節(jié)方法測定小鼠糞便中厚壁菌門、擬桿菌門、乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬細(xì)菌的mRNA表達(dá)水平，將小鼠糞便中總菌的mRNA表達(dá)水平設(shè)定為1，分析小鼠糞便中以上幾類微生物的豐度[15]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次平行測定，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。同時(shí)采用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 LP-KSFY04對血栓小鼠黑尾長度的影響

如圖1A所示，除正常組，腹腔注射角叉菜膠后各組小鼠尾尖處出現(xiàn)黑尾，即出現(xiàn)尾血栓。如圖1B所示，模型組小鼠黑尾長度最長，為（8.43±0.52）cm，顯著長于其余各組（P＜0.05）。LP-KSFY04-H組和雙嘧達(dá)莫組小鼠黑尾長度分別為（3.02±0.44）cm和（2.35±0.47）cm，二者無顯著差異（P＞0.05），均顯著短于較LP-KSFY04-L組（（5.89±0.58）cm）和模型組（P＜0.05）。

圖1 LP-KSFY04對血栓小鼠黑尾長度的影響Fig. 1 Effect of LP-KSFY04 on the length of black tail in thrombus mice

2.2 LP-KSFY04對血栓小鼠凝血4 項(xiàng)指標(biāo)的影響

如圖2所示，與正常組相比，模型組血栓小鼠的APTT顯著縮短，TT、PT和FIB質(zhì)量濃度分別顯著延長和升高（P＜0.05）；LP-KSFY04-H組APTT（（129.6±5.5）s）顯著長于LP-KSFY04-L組和模型組，但顯著短于正常組（P＜0.05）；LP-KSFY04-H組TT（（85.9±5.0）s）、FIB質(zhì)量濃度（（65.7±4.4）g/L）和PT（（11.2±1.0）s）分別顯著短于和低于LP-KSFY04-L組（P＜0.05）和模型組，但顯著高于正常組（P＜0.05）。LP-KSFY04-H組APTT、TT、FIB質(zhì)量濃度和PT均與雙嘧達(dá)莫組接近，且無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 LP-KSFY04對血栓小鼠凝血4 項(xiàng)指標(biāo)的影響Fig. 2 Effect of LP-KSFY04 on four blood coagulation indexes in mice with thrombosis

2.3 LP-KSFY04對血栓小鼠炎癥細(xì)胞因子水平的影響

如圖3～5所示，與正常組相比，模型組小鼠血清、腎組織和肝組織的TNF-α、IL-6和IL-1β水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，雙嘧達(dá)莫、LP-KSFY04-H和LP-KSFY04-L組小鼠血清、腎組織和肝組織的TNF-α、IL-6和IL-1β水平均顯著降低（P＜0.05）。其中LP-KSFY04-H組TNF-α、IL-6和IL-1β水平與藥物雙嘧達(dá)莫組之間無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 LP-KSFY04對血栓小鼠血清TNF-α（A）、IL-6（B）和IL-1β水平（C）的影響Fig. 3 Effect of LP-KSFY04 on serum levels of TNF-α (A), IL-6 (B)and IL-1β (C) in mice with thrombosis

圖4 LP-KSFY04對血栓小鼠腎組織TNF-α（A）、IL-6（B）和IL-1β水平（C）的影響Fig. 4 Effect of LP-KSFY04 on the levels of TNF-α (A), IL-6 (B) and IL-1β (C) in renal tissue of mice with thrombosis

圖5 LP-KSFY04對血栓小鼠肝組織TNF-α（A）、IL-6（B）和IL-1β水平（C）的影響Fig. 5 Effect of LP-KSFY04 on the levels of TNF-α (A), IL-6 (B) and IL-1β (C) in liver tissue of mice with thrombosis

圖6 小鼠尾部（A）、腎臟（B）和肝臟（C）組織的HE染色切片F(xiàn)ig. 6 HE stained sections of tail (A), kidney (B) and liver (C) tissues of mice

2.4 LP-KSFY04對血栓小鼠尾組織、腎臟組織和肝臟組織病理學(xué)變化的影響

如圖6A所示，正常組小鼠尾靜脈血管形態(tài)完整且圓潤、血管壁形態(tài)光滑，模型組小鼠尾靜脈血管壁中有明顯的炎性滲出且出現(xiàn)白細(xì)胞浸潤，同時(shí)血管周圍有出血情況，血管內(nèi)有血栓形成。LP-KSFY04和雙嘧達(dá)莫均能夠減輕小鼠尾靜脈血管的病變，且LP-KSFY04-H和雙嘧達(dá)莫的效果接近，均優(yōu)于LP-KSFY04-L。對腎臟組織觀察也發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腎臟組織出現(xiàn)病變，腎小球形態(tài)不規(guī)則，部分甚至出現(xiàn)破裂，組織間炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象嚴(yán)重；正常組小鼠腎臟組織和細(xì)胞完整，LP-KSFY04-H和雙嘧達(dá)莫都能夠減輕血栓造成的腎組織炎性病變，使腎臟組織形態(tài)接近正常組；同時(shí)LP-KSFY04-L也能一定程度減輕血栓小鼠腎組織的病變（圖6B）。如圖6C所示，正常組小鼠肝臟組織完好、細(xì)胞大小均勻、中央靜脈圓潤、肝小葉和肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞邊界清晰；模型組小鼠肝組織中央靜脈形狀不規(guī)則，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞邊界出現(xiàn)混亂，部分肝細(xì)胞的細(xì)胞核破裂；LP-KSFY04-H和雙嘧達(dá)莫能顯著抑制血栓造成的肝細(xì)胞損傷，兩者效果接近，均優(yōu)于LP-KSFY04-L。

2.5 LP-KSFY04對血栓小鼠尾靜脈組織中炎癥及血栓形成相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

如圖7所示，與正常組相比，模型組小鼠尾靜脈組織的NF-κB p65、ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、IL-6和TNF-αmRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，LP-KSFY04能夠顯著下調(diào)血栓小鼠尾靜脈組織中NF-κB p65、ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、IL-6和TNF-α表達(dá)，且LP-KSFY04-H效果更好，與雙嘧達(dá)莫組無顯著差異（P＞0.05）。

圖7 LP-KSFY04對血栓小鼠尾靜脈組織中炎癥及血栓形成相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響Fig. 7 Effect of LP-KSFY04 on mRNA expression of cytokines related to inflammation and thrombosis in tail vein of mice with thrombosis

2.6 LP-KSFY04對血栓小鼠糞便中微生物水平的影響

如圖8所示，正常組小鼠糞便中的厚壁菌門微生物的mRNA相對表達(dá)水平（即相對豐度）顯著低于其他各組（P＜0.05），而擬桿菌門、乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬的mRNA相對表達(dá)水平顯著高于其他各組（P＜0.05）。LP-KSFY04能夠使模型組血栓小鼠糞便中的厚壁菌門相對表達(dá)水平降低，擬桿菌門、乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬的相對表達(dá)水平增強(qiáng)，且LP-KSFY04-H和雙嘧達(dá)莫效果相似。此外，LP-KSFY04-H組的乳酸桿菌屬相對表達(dá)水平顯著高于正常組（P＜0.05）。

圖8 LP-KSFY04對血栓小鼠糞便中的厚壁菌門（A）、擬桿菌門（B）、乳酸桿菌屬（C）和雙歧桿菌屬（D）mRNA相對表達(dá)的影響Fig. 8 Effect of LP-KSFY04 on relative abundance of Firmicutes (A),Bacteroidetes (B), Lactobacillus (C), and Bifidobacteria (D) in feces of mice with thrombosis

3 討 論

角叉菜膠可在實(shí)驗(yàn)小鼠尾部形成與機(jī)體全身炎癥關(guān)聯(lián)的血栓，導(dǎo)致小鼠尾部出現(xiàn)混合性血栓充填，進(jìn)而引起小鼠尾部發(fā)生組織缺血性壞死，能肉眼可見血栓引起的小鼠黑尾。因此，小鼠黑尾長度是直觀判斷實(shí)驗(yàn)性血栓程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)[16]。本研究也證明了角叉菜膠可導(dǎo)致小鼠尾部血栓，形成明顯黑尾，LP-KSFY04能夠縮短血栓小鼠黑尾長度，且高劑量LP-KSFY04效果更優(yōu)，能達(dá)到與抗血栓藥物雙嘧達(dá)莫同樣的效果。

凝血4 項(xiàng)（PT、APTT、TT、FIB）是臨床檢測凝血系統(tǒng)異常的常規(guī)方法，能夠較為準(zhǔn)確地檢測出血液性疾病[17]。血栓形成過程中大量消耗凝血因子，致使PT延長，而凝血因子的大幅度缺失又會(huì)造成APTT縮短；同時(shí)凝血酶發(fā)揮作用可以使FIB持續(xù)轉(zhuǎn)化為血栓主要成分纖維蛋白，這個(gè)過程將導(dǎo)致血液長期保持在高凝狀態(tài)下，一旦血液纖維蛋白含量異常，機(jī)體纖溶增強(qiáng)，同時(shí)纖維蛋白降解產(chǎn)物也會(huì)增多，從而使TT延長[18-21]。本研究中雙嘧達(dá)莫和LP-KSFY04能夠調(diào)控凝血4 項(xiàng)指標(biāo)，表明雙嘧達(dá)莫和LP-KSFY04具有抑制血栓形成的作用。

腎臟是機(jī)體的重要排毒器官，腎臟出現(xiàn)病變后，機(jī)體中各類毒素就難以排出體外，長時(shí)間在體內(nèi)積累，對人體危害極大。機(jī)體出現(xiàn)血栓后腎臟代謝受到影響，進(jìn)而腎臟排毒功能也會(huì)受損，嚴(yán)重的情況下由于持續(xù)加強(qiáng)的炎癥反應(yīng)還會(huì)導(dǎo)致腎衰竭等惡性病變[22]。肝臟負(fù)責(zé)產(chǎn)生機(jī)體內(nèi)幾乎所有凝血因子，在人體凝血和抗凝動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，肝功能被破壞后往往伴隨著血液促凝與抗凝的失衡，因此血栓的形成與肝臟密切相關(guān)[23]。本研究通過病理學(xué)觀察也發(fā)現(xiàn)小鼠尾部發(fā)生血栓后，腎臟和肝臟組織也出現(xiàn)炎性病變，再次證明了小鼠的尾血栓會(huì)累及腎臟和肝臟發(fā)生病變，而藥物雙嘧達(dá)莫和LP-KSFY04均能夠有效緩解這些病變，且高劑量LP-KSFY04與雙嘧達(dá)莫作用相當(dāng)。

炎癥與血栓之間具有相互促進(jìn)的關(guān)系，炎癥與血栓的持續(xù)加劇會(huì)導(dǎo)致更為嚴(yán)重的器官損傷，進(jìn)而危及生命[20]。機(jī)體出現(xiàn)炎癥后通過Toll樣受體導(dǎo)致單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等被激活，從而生產(chǎn)大量炎癥因子，如TNF-α、IL-6[24]。TNF-α是機(jī)體免疫-炎癥信號(hào)通路中的重要因子，也是血栓與炎癥之間的重要介質(zhì)。TNF-α是細(xì)胞中炎癥反應(yīng)的重要始動(dòng)因子，NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶等信號(hào)通路均受到TNF-α受體調(diào)節(jié)，從而大量釋放IL-6、IL-β等炎癥細(xì)胞因子；同時(shí)這些炎癥細(xì)胞因子又再次加強(qiáng)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞活化，使血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷加重，直接或間接促使血栓的形成[25-26]。特別是，IL-1β通過TNF-α調(diào)節(jié)從內(nèi)皮細(xì)胞中大量釋放，并在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血小板聚集過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是導(dǎo)致血栓的重要因子[27]。NF-κB、TNF-α和IL-1β等炎癥細(xì)胞因子還能使血管內(nèi)皮細(xì)胞中的血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)降低，促使血液抗凝活性降低，增加血栓風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)還可以增強(qiáng)血管收縮相關(guān)因子表達(dá)，從而通過血管的持續(xù)收縮引發(fā)血栓[28]。因此，控制體內(nèi)NF-κB、TNF-α和IL-1β細(xì)胞因子的水平，一方面能夠控制機(jī)體炎癥程度；另一方面也能調(diào)節(jié)血栓相關(guān)因子的表達(dá)，從而起到干預(yù)血栓形成的作用。在本研究中藥物雙嘧達(dá)莫和LP-KSFY04均對以上炎癥細(xì)胞因子起到了干預(yù)作用，因此具有血栓形成抑制作用。

研究顯示NF-κB是血栓形成過程中炎癥相關(guān)機(jī)制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，NF-κB能夠在內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、炎癥反應(yīng)中起到促進(jìn)和調(diào)節(jié)作用，NF-κB通過這些調(diào)節(jié)作用使機(jī)體中的凝血-纖溶狀態(tài)失衡，導(dǎo)致血栓的形成[29]。ICAM-1在細(xì)胞之間和細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏附具有明顯的調(diào)節(jié)作用[30]。VCAM-1對血小板的黏附聚集具有調(diào)節(jié)作用，過度表達(dá)會(huì)加劇血栓部位的炎癥[31]。E-selectin對內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥損傷和通透性具有調(diào)控作用，還可以控制流動(dòng)血液中總的白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附[32]。NF-κB在炎癥刺激狀態(tài)下可以促進(jìn)ICAM-1、VCAM-1和E-selectin等黏附因子表達(dá)加強(qiáng)，進(jìn)一步放大血栓危害和加劇血栓[33]。本研究中血栓導(dǎo)致小鼠尾部出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，以NF-κB通路為中心，ICAM-1、VCAM-1和E-selectin表達(dá)水平均較正常狀態(tài)顯著升高。雙嘧達(dá)莫和LP-KSFY04均能發(fā)揮調(diào)控NF-κB、ICAM-1、VCAM-1和E-selectin表達(dá)的作用，表明LP-KSFY04可能具有良好的血栓形成抑制作用。

血栓形成是心腦血管疾病的重要促因，在機(jī)體出現(xiàn)病變后，腸道菌群細(xì)胞壁中的有害成分進(jìn)入血液循環(huán)后誘發(fā)內(nèi)毒素血癥，造成機(jī)體慢性炎癥，此過程是血栓發(fā)病機(jī)制中的重要一環(huán)。腸道菌群失調(diào)也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)炎癥，炎癥進(jìn)一步導(dǎo)致血液中凝血因子異常增加，原有的纖溶酶原不足以抵抗凝血因子異常增加造成凝血和溶栓失調(diào)，使血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)大大增加[34]。人體腸道內(nèi)絕大部分細(xì)菌由厚壁菌門和擬桿菌門微生物組成，厚壁菌門與擬桿菌門豐度的比值與血液黏稠度密切相關(guān)，厚壁菌門豐度的增加可能會(huì)導(dǎo)致血栓形成[35]。乳酸菌和雙歧桿菌已被證實(shí)具有多種保健作用，對機(jī)體的正常代謝具有積極作用，能夠緩解炎癥造成的體內(nèi)毒素積累和血液流動(dòng)速度緩慢，從而降低血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)[36]。另外健康的腸道菌群可通過調(diào)節(jié)血小板功能及改變凝血功能等多種機(jī)制來降低血栓風(fēng)險(xiǎn)[37]。本研究也證實(shí)LP-KSFY04能夠增加血栓小鼠腸道中擬桿菌門、乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬豐度，同時(shí)減少厚壁菌門豐度，從而通過調(diào)控腸道微生物，抑制機(jī)體炎癥，促進(jìn)血液流通正常，發(fā)揮抗血栓作用。

雙嘧達(dá)莫的副作用包括頭痛、眩暈、惡心、嘔吐、腹瀉等不良反應(yīng)，而LP-KSFY04作為食品中分離出的乳酸菌，無副作用，具有更好的應(yīng)用前景。從韓國泡菜中分離出的短乳桿菌J-38被證實(shí)具有體外抑制血小板聚集的作用，具有潛在的抗血栓作用[38]。此外，肥胖也是血栓形成的誘因之一，有研究證實(shí)從四川泡菜中分離出的發(fā)酵乳桿菌CQPC05具有良好的減脂減肥效果，通過減脂減肥也能一定程度降低血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)[39]。但是現(xiàn)有研究還缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來準(zhǔn)確驗(yàn)證益生菌對血栓形成的干預(yù)作用，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究植物乳桿菌LP-KSFY04對小鼠血栓形成的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LP-KSFY04能夠有效降低血栓小鼠的黑尾程度和改善凝血4 項(xiàng)指標(biāo)，一方面通過調(diào)控血清、腎臟和肝臟組織中的炎癥細(xì)胞因子，發(fā)揮抑炎作用；另一方面，通過調(diào)控NF-κB通路ICAM-1、VCAM-1和E-selectin等黏附因子表達(dá)，減輕血栓程度。同時(shí)，本研究結(jié)果進(jìn)一步表明LP-KSFY04還通過改善小鼠腸道微生物健康，從而降低炎癥程度，發(fā)揮血栓形成抑制作用。綜上，LP-KSFY04具有較好的實(shí)驗(yàn)性抗血栓作用，但目前缺乏臨床試驗(yàn)的結(jié)果，還需要加強(qiáng)研究。