加工方式對魚餅小清蛋白免疫原性和致敏性的影響

周林杰，陸佳達(dá)，施文正，盧 瑛,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室，上海 201306）

食物過敏是指過敏人群對食物過敏原的異常免疫反應(yīng)，嚴(yán)重的食物過敏可能導(dǎo)致過敏性休克，危及生命[1]，是當(dāng)前世界上影響過敏人群健康的重要公共衛(wèi)生問題。相關(guān)調(diào)查顯示，世界上食物過敏人群數(shù)量逐年增長，約有8%的兒童和3%的成年人有不同程度的食物過敏癥狀[2]。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織調(diào)查[3]顯示，魚類及其制品是過敏食物中的一大類，目前只能通過避免食用過敏食品或緩解過敏癥狀來控制。

魚類的主要過敏原是小清蛋白（parvalbumin，PV），其分子質(zhì)量為10～12 kDa，主要存在于魚肌肉的肌漿蛋白中，大部分對魚類及其制品的過敏反應(yīng)是由PV引起的[4]。目前，消減PV的加工方法有多種，如通過美拉德反應(yīng)對PV賴氨酸殘基進(jìn)行糖基化修飾，修飾后PV免疫原性下降[5]。高卿等[6]研究木糖葡萄球菌發(fā)酵對鱸魚PV免疫原性的影響發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵60 h后PV的免疫原性顯著降低。此外，不同加工技術(shù)的組合可以更有效地降低水產(chǎn)品過敏原的致敏性，王麗娟等[7]發(fā)現(xiàn)經(jīng)高壓結(jié)合酶法處理的蝦肉，其主要過敏原原肌球蛋白的免疫原性消減率達(dá)到97%。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)高溫高壓技術(shù)可以顯著降低蝦類過敏原的致敏性，因此高溫高壓技術(shù)與乳酸菌發(fā)酵相結(jié)合可能會(huì)提供一種降低食物致敏性的新途徑。

本研究分別采用加熱、高溫高壓、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）發(fā)酵和發(fā)酵-高溫高壓聯(lián)合處理（簡稱F-HP）制備魚餅，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和傅里葉變換紅外光譜分析不同處理組魚餅中主要過敏原PV的免疫原性和二級結(jié)構(gòu)的變化，通過BALB/c小鼠過敏模型評價(jià)不同加工處理對PV致敏性的影響，以期為食物過敏原的控制與消減以及低致敏性魚制品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、動(dòng)物、材料與試劑

副干酪乳桿菌為本課題組前期從奶豆腐中分離純化。

BALB/c小鼠購自上海捷思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0004，本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法均經(jīng)上海海洋大學(xué)動(dòng)物保護(hù)評審委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)編號(hào)：SHOU-DW-2021-003。

白鰱魚 上海臨港蘆潮港水產(chǎn)市場；MRS（de Man-Rogosa-Sharpe ）培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；預(yù)染色和未染色的蛋白質(zhì)標(biāo)記物，3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）顯色液 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；鼠抗PV單克隆抗體 無錫迪騰敏生物科技有限公司；二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色液 美國Sigma公司；羊抗鼠辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G上海威奧生物科技有限公司；羊抗鼠HRP-IgE抗體美國arigo公司；小鼠血清組胺、細(xì)胞因子（白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5和IL-13）檢測試劑盒上海酶免生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Mini protean 4蛋白質(zhì)電泳儀 美國Bio-Rad公司；AE-8135半干式轉(zhuǎn)膜儀 日本ATTO公司；Powerlook 2100XL-MSB凝膠掃描儀 美國MMAX公司；Synergy2多功能酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；Z36HK高速冷凍離心機(jī)德國Hermle公司；TS-8脫色搖床 江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；MLS-3750高壓滅菌鍋 日本Sanyo公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵菌種的培養(yǎng)

將副干酪乳桿菌接種在MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)至穩(wěn)定期，調(diào)整活菌數(shù)1×108CFU/mL以上，4 ℃、8 000 r/min離心20 min，收集沉淀，將菌體重懸于5 mL生理鹽水中，4 ℃冷藏備用。

1.3.2 不同加工方式制備魚餅

新鮮白鰱魚除去魚鱗、魚鰓和內(nèi)臟，清洗后采肉切塊（3 cm×3 cm×2 cm）。將魚肉粉碎并添加魚肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的氯化鈉和5%的葡萄糖，混勻后平鋪在魚餅?zāi)＞咧?，然后采用不同加工方式制備魚餅。加熱組：100 ℃沸水蒸制15 min；高溫高壓處理組：置于高壓滅菌鍋，121 ℃分別處理10、20、30、40、50 min；發(fā)酵處理組：在魚餅中接種1×108CFU/g副干酪乳桿菌，密封后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵12、24、36、48 h；F-HP處理組：將發(fā)酵12、24、36、48 h的魚餅于高壓滅菌鍋中121 ℃處理20 min；上述魚餅均保存在-20 ℃冰箱中備用。

1.3.3 魚餅中小清蛋白的制備

參考文獻(xiàn)[8]的方法，將分別取5 g不同處理組魚餅，加入30 mL、4 ℃ Tris緩沖液（pH 7.4、0.1 mol/L，含0.5 mmol/L甘氨酸和0.1 mmol/L二硫蘇糖醇，后同），均質(zhì)處理1 min后得到蛋白粗提液。將粗提液于4 ℃冰箱放置12 h后10 000 r/min離心30 min，收集上清液。然后用Tris緩沖液溶解沉淀物，浸提5 h，4 000 r/min離心30 min，收集合并兩次上清液得到魚餅PV粗提液。用0.1 mol/L、pH 7.4（后同）磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）透析24 h得到魚餅PV富集液，冷凍干燥后得到不同處理組PV，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ◆~肉粉碎后按照相同操作制備天然PV。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡分析

參考文獻(xiàn)[9]的方法。分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，標(biāo)準(zhǔn)蛋白上樣量為8 μL，樣品蛋白（加熱組魚餅的PV粗提液和富集液）上樣量為10 μL。樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離后，用半干式轉(zhuǎn)膜儀，200 mA反應(yīng)20 min將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。加入5 g/100 mL脫脂奶粉在37 ℃反應(yīng)1 h，用含吐溫-20的PBS（phosphate buffered salinetween，PBST）洗滌3 次。以PV的特異性單克隆抗體（1∶10 000）為一抗，孵育1 h。洗滌后以羊抗鼠HRP-IgG（1∶2 500）為二抗，孵育1 h。洗滌后加入DAB顯色液顯色，用去離子水洗去多余的顯色液后拍照觀察。

1.3.5 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定PV的免疫原性

參考文獻(xiàn)[10]的方法略作修改。取不同處理組PV和天然PV用50 mmol/L碳酸鹽緩沖溶液（pH 9.6）配制質(zhì)量濃度20 μg/mL溶液，以100 μL/孔加入酶標(biāo)板中，4 ℃反應(yīng)12 h。PBST洗滌3 次后加入5 g/100 mL脫脂奶粉（200 μL/孔），37 ℃孵育2 h。洗滌后以鼠抗PV單克隆抗體（1∶10 000）為一抗（100 μL/孔），37 ℃孵育1 h；洗滌后以羊抗鼠HRP-IgG（1∶5 000）為二抗（100 μL/孔），37 ℃孵育1 h，洗滌后加入TMB顯色液（100 μL/孔）顯色10 min后，加入2 mol/L的硫酸溶液（50 μL/孔）終止顯色，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處光密度（OD450nm）。以不含樣品的50 mmol/L碳酸鹽緩沖溶液作為陰性對照。按下式計(jì)算IgG結(jié)合能力消減率，以表征PV的免疫原性。

式中：ΔOD0為天然PV與陰性對照組OD450nm的差值；ΔOD1為其他處理組與陰性對照組OD450nm的差值。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

參考文獻(xiàn)[11]的方法，加熱組、高溫高壓組（121 ℃處理20 min）、發(fā)酵組（發(fā)酵48 h）和F-HP組（發(fā)酵48 h后121 ℃處理20 min）和天然PV冷凍干燥樣品中加入KBr晶體（質(zhì)量比1∶100）混合壓成薄片，以空氣為背景，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)采集光譜，每個(gè)樣品重復(fù)掃描3 次。利用Peakfit軟件對PV樣品的紅外光譜原始圖進(jìn)行基線校準(zhǔn)、二階導(dǎo)數(shù)處理，根據(jù)吸收峰的積分面積計(jì)算各二級結(jié)構(gòu)相對含量。

1.3.7 BALB/c小鼠過敏模型的建立

參考文獻(xiàn)[12]的方法略作修改，將30 只BALB/c雌性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為5 組（n＝6），以PBS溶液為抗原設(shè)為陰性對照組，即PBS組；以不同處理組PV凍干粉末為抗原設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。

1.3.7.1 致敏小鼠血清特異性IgE抗體水平的測定

第1、21、28天不同處理組小鼠分別腹腔注射100 μg相應(yīng)處理組PV（用PBS配制2 mg/mL PV溶液，然后加入等體積弗氏完全佐劑振蕩乳化），PBS組腹腔注射等體積PBS乳液。腹腔注射24 h后對各組小鼠進(jìn)行尾尖采血，離心（4 000 r/min、20 min）收集血清。按照1.3.5節(jié)方法，以實(shí)驗(yàn)室前期提取純化的鰱魚PV為樣品，采用間接ELISA法分析小鼠血清中IgE抗體水平的變化情況。將PV用50 mmol/L碳酸鹽緩沖溶液（pH 9.6）稀釋至5 μg/mL，一抗采用小鼠血清（1∶1 000），二抗采用羊抗鼠HRPIgE抗體（1∶2 500），測定OD450nm以表征IgE抗體水平。

1.3.7.2 灌胃激發(fā)后小鼠過敏表現(xiàn)評分及血清中組胺和Th2型細(xì)胞因子質(zhì)量濃度的測定

參考文獻(xiàn)[13]的方法并略作修改，第35天各組小鼠均灌胃0.5 mg加熱組（100 ℃沸水蒸制15 min）、高溫高壓組（處理20 min）、發(fā)酵組（發(fā)酵48 h）和F-HP組（發(fā)酵48 h后高溫高壓處理20 min）PV（用PBS配制2 mg/mL PV溶液進(jìn)行灌胃）激發(fā)小鼠。激發(fā)后1 h內(nèi)觀察小鼠過敏表現(xiàn)并評分，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 小鼠過敏表現(xiàn)評分標(biāo)準(zhǔn)[13]Table 1 Criteria for evaluation of allergic symptoms in in mice[13]

激發(fā)24 h后采用放血法處死小鼠，取小鼠心臟部位血液，離心（4 000 r/min、20 min）收集血清，按照1.3.5節(jié)方法小鼠血清中IgE抗體水平（OD450nm），并分別參照相應(yīng)ELISA試劑盒說明書測定致敏小鼠血清中的組胺和輔助型T細(xì)胞2（T helper 2 cell，Th2）型細(xì)胞因子（IL-4、IL-5和IL-13）的質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan多重比較進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 加工方式對魚餅免疫原性的影響

2.1.1 魚餅粗提液和富集液PV的鑒定

加熱組魚餅PV粗提液和富集液的SDS-PAGE圖譜如圖1A所示，Jiang Xingyi等[14]研究報(bào)道PV分子質(zhì)量為10～12 kDa，本研究魚餅PV的主要條帶在10 kDa處附近。免疫印跡結(jié)果如圖1B所示，10 kDa處附近條帶與PV的特異性單克隆抗體有反應(yīng)，故該條帶被鑒定為白鰱魚的PV。

圖1 魚餅中PV粗提液和富集液的SDS-PAGE（A）和免疫印跡結(jié)果（B）Fig. 1 SDS-PAGE pattern (A) and Western blot pattern (B) of PV from fish cakes

2.1.2 加工方式對魚餅中主要過敏原PV免疫原性和二級結(jié)構(gòu)的影響

如圖2所示，高溫高壓和發(fā)酵處理均可以降低魚餅PV的免疫原性，其中高溫高壓處理時(shí)間20 min，副干酪乳桿菌發(fā)酵48 h和F-HP組發(fā)酵48 h后高溫高壓處理20 min的魚餅中PV的IgG結(jié)合能力消減率最高，分別為50.6%、34.7%和68.5%，加熱組消減率僅10.4%。研究發(fā)現(xiàn)，高溫高壓處理主要通過影響蛋白質(zhì)分子的非共價(jià)相互作用如氫鍵和離子鍵等，間接或直接影響過敏蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)[15]。由圖2A可知，高溫高壓處理不同時(shí)間制備的魚餅中PV的IgG結(jié)合能力消減率均高于30%，作用效果顯著，其中處理20 min時(shí)魚餅中PV的IgG結(jié)合能力消減率達(dá)到最大（50.6%）。如圖2B所示，隨發(fā)酵時(shí)間的延長，魚餅中PV的IgG結(jié)合能力消減率逐漸增加，發(fā)酵48 h時(shí)達(dá)到34.7%。F-HP組制備的魚餅中PV的IgG結(jié)合能力變化趨勢與發(fā)酵組類似，發(fā)酵48 h時(shí)為68.5%（圖2C）。Zhu Yidan等[16]采用植物乳桿菌發(fā)酵魚肉，與發(fā)酵0 h相比，發(fā)酵48 h后魚肉中PV的免疫原性降低了39.7%，本研究采用副干酪乳桿菌發(fā)酵魚肉，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，PV免疫原性逐漸降低（圖2B、C）。不同處理組魚餅中，發(fā)酵48 h F-HP組魚餅中PV的免疫原性降低最大。

蛋白質(zhì)紅外光譜酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）的特征振動(dòng)頻率主要取決于其氨基酸殘基的C＝O和N—H之間的氫鍵性質(zhì)，可用于反映蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋（1 650～1 658 cm-1）、β-折疊（1 610～1 640 cm-1）、β-轉(zhuǎn)角（1 660～1 700 cm-1）及無規(guī)卷曲（1 640～1 650 cm-1）等結(jié)構(gòu)相對含量[17]。由圖2D可知，過敏原天然PV的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋相對含量最高，β-折疊相對含量最少，分別為43.9%、9.0%。楊汝晴等[18]研究磷酸化對鰱魚PV免疫原性的影響也發(fā)現(xiàn)，天然狀態(tài)下PV的α-螺旋相對含量最高，β-折疊相對含量最少。加熱組魚肉PV二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊相對含量與天然PV相比沒有明顯變化，這可能是加熱處理對魚肉PV免疫原性影響很小的原因[18]。與天然PV相比，高溫高壓處理后魚肉PV的α-螺旋相對含量降低了10.7%，而β-折疊相對含量增加了7.8%，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對含量均有增加。有研究表明高溫高壓會(huì)導(dǎo)致PV的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的變化從而掩蓋其抗原表位[20]。如圖2D所示，發(fā)酵處理后，發(fā)酵組PV的α-螺旋相對含量較天然PV降低了13.3%，而β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對含量均有增加，其中β-折疊相對含量增加了5.1%。肖葉等[21]利用植物乳桿菌及其不同成分提取物處理蝦類原肌球蛋白，發(fā)現(xiàn)原肌球蛋白的α-螺旋相對含量明顯減少，β-折疊相對含量顯著增加，原肌球蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化影響了其免疫原性。因此推測副干酪乳桿菌發(fā)酵過程中的發(fā)酵產(chǎn)物對PV的表位有掩蓋作用[22]，從而降低了魚餅中PV的免疫原性。與加熱組相比，其他加工方式中F-HP處理后PV二級結(jié)構(gòu)變化最大。與天然PV相比，F(xiàn)-HP處理后α-螺旋相對含量降低了17.3%，β-折疊相對含量增加了14.8%。

綜上可知，加熱、高溫高壓、發(fā)酵和F-HP處理對PV二級結(jié)構(gòu)影響主要為α-螺旋解旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊，PV結(jié)構(gòu)的折疊化導(dǎo)致暴露的抗原表位被掩蓋，影響了PV與抗體結(jié)合的能力，從而降低了PV蛋白的免疫原性。而單一的加熱、高溫高壓和發(fā)酵處理對α-螺旋相對含量降低效果不如F-HP處理，PV的折疊化程度較低，因而相較于發(fā)酵48 h F-HP處理，高溫高壓和僅進(jìn)行發(fā)酵處理PV的免疫原性消減率較低。

圖2 加工方式對魚餅中PV免疫原性和二級結(jié)構(gòu)的影響Fig. 2 Effects of processing methods on the immunogenicity and secondary structure of PV from fish cakes

2.2 加工方式對魚餅中主要過敏原PV致敏性的影響

采用BALB/c小鼠構(gòu)建過敏動(dòng)物模型，是評價(jià)過敏蛋白致敏性最直接的方法之一[23]。因此，本研究以PBS抗原作為陰性對照，各加工處理組魚餅中PV凍干樣品抗原作為實(shí)驗(yàn)組，構(gòu)建BALB/c小鼠過敏模型，灌胃激發(fā)小鼠后1 h內(nèi)觀察小鼠過敏癥狀，發(fā)現(xiàn)過敏原刺激后小鼠出現(xiàn)抽搐、活動(dòng)減弱等一系列癥狀[24]。各組小鼠的過敏反應(yīng)評分結(jié)果如圖3所示，加熱組蛋白免疫的小鼠表現(xiàn)出不同程度的過敏癥狀，50%的小鼠出現(xiàn)了刺激后無活動(dòng)的癥狀，1/3的小鼠出現(xiàn)呼吸困難或抽搐等癥狀。PBS組2/3的小鼠無過敏癥狀。高溫高壓組小鼠2/3出現(xiàn)腹瀉或活動(dòng)減少的癥狀，50%的發(fā)酵組小鼠也出現(xiàn)類似現(xiàn)象，而F-HP組2/3的小鼠過敏癥狀整體表現(xiàn)出輕微的癥狀。從過敏癥狀評分結(jié)果來看，不同加工處理后魚餅PV導(dǎo)致的小鼠過敏癥狀都有不同程度降低，其中F-HP組小鼠整體過敏癥狀最輕。

圖3 小鼠模型的過敏表現(xiàn)評分（n＝6）Fig. 3 Symptom scores of allergen-induced anaphylactic reactions in mouse model (n = 6)

血清中IgE抗體水平是評價(jià)過敏原致敏性的重要指標(biāo)[25]。本研究測定了小鼠過敏模型構(gòu)建過程小鼠血清中IgE水平，由圖4A可見，PBS組免疫小鼠血清IgE抗體水平無明顯變化，而加熱組IgE抗體水平隨免疫時(shí)間延長逐漸增加。結(jié)合上述加熱組過敏癥狀評分結(jié)果可知，BALB/c小鼠過敏模型構(gòu)建成功。如圖4B所示，第35天灌胃不同處理組PV激發(fā)后，加熱組小鼠血清中IgE抗體水平（0.766）最高；而高溫高壓組、發(fā)酵組和F-HP組的IgE抗體水平均顯著高于PBS對照組，但顯著低于加熱組（P＜0.05）；其中F-HP組IgE抗體水平（0.349）最低，比加熱組降低了54.4%。由此可知，相比于單一加工處理，F(xiàn)-HP組魚餅中PV致敏性降低最為顯著（P＜0.05）。

圖4 BLAB/c小鼠血清中IgE抗體水平Fig. 4 Serum IgE antibody levels in BALB/c mice

組胺是引起全身過敏癥狀的主要物質(zhì)，小鼠血清中組胺質(zhì)量濃度可以反映BALB/c小鼠過敏反應(yīng)的嚴(yán)重程度[26]。如圖5所示，高溫高壓組、發(fā)酵組和F-HP組小鼠血清組胺質(zhì)量濃度顯著低于加熱組（P＜0.05），均較加熱組降低了40%以上，其中F-HP組降低了63.6%，略高于PBS組。上述結(jié)果表明，加熱處理后魚肉PV的致敏性強(qiáng)烈，高溫高壓、發(fā)酵和F-HP處理都可以顯著降低魚餅中PV的致敏性，且F-HP處理對PV致敏性影響最大，降低效果最佳。以上結(jié)果與小鼠血清IgE抗體水平相互印證。

圖5 BLAB/c小鼠血清中組胺質(zhì)量濃度Fig. 5 Histamine levels in serum of BLAB/c mice

為進(jìn)一步探究不同加工處理消減PV致敏性的機(jī)制，本研究分析了不同處理組PV激發(fā)致敏后小鼠血清中IL-4、IL-5和IL-13質(zhì)量濃度。如圖6所示，加熱組IL-4、IL-5和IL-13質(zhì)量濃度均最高，而高溫高壓組、發(fā)酵組和F-HP組均出現(xiàn)了不同程度降低，其中小鼠血清中IL-5質(zhì)量濃度下降最為顯著，分別較加熱組降低了51.6%、48.6%、47.7%（圖6B）；與加熱組相比，F(xiàn)-HP組IL-13質(zhì)量濃度下降了34.8%（圖6C）。Th2型細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13都是促過敏細(xì)胞因子，能夠增強(qiáng)機(jī)體致敏反應(yīng)[27]。Luo Chen等[28]報(bào)道小鼠經(jīng)魚類PV的脂肪乳化消化產(chǎn)物免疫后，血清中細(xì)胞因子IL-4和IL-13的釋放量顯著增加。本研究結(jié)果顯示，與加熱組相比，其他加工處理組魚餅中PV免疫的小鼠血清中的促過敏細(xì)胞因子（IL-4、IL-5和IL-13）的分泌量均降低，其中F-HP組小鼠的細(xì)胞因子質(zhì)量濃度降低效果最好。

圖6 BALB/c小鼠血清中細(xì)胞因子質(zhì)量濃度Fig. 6 Serum cytokine levels in BALB/c mice

BALB/c小鼠過敏模型是評價(jià)食物潛在致敏性最直接的方法之一。通過BALB/c小鼠過敏模型，研究發(fā)現(xiàn)，與加熱組相比，其他加工處理組PV激發(fā)致敏后小鼠的過敏癥狀明顯減弱（圖3），小鼠血清中組胺質(zhì)量濃度和Th2型細(xì)胞因子（IL-4、IL-5和IL-13）的質(zhì)量濃度（圖5、6）顯著降低（P＜0.05），小鼠血清中IgE抗體水平均顯著降低（圖4）（P＜0.05），其中F-HP組的小鼠的過敏反應(yīng)減輕最顯著（P＜0.05）。van der Ventel等[29]將鯉魚PV腹腔注射BALB/c小鼠進(jìn)行致敏實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)小鼠血清中特異性抗體IgE水平和Th2型細(xì)胞因子（IL-4和IL-5）質(zhì)量濃度顯著升高。根據(jù)相關(guān)研究[30]可知，當(dāng)過敏原刺激機(jī)體后，Th2細(xì)胞被抗原激活后，釋放IL-4、IL-5和IL-13等淋巴因子，進(jìn)而促進(jìn)IgE產(chǎn)生。而IgE-抗原復(fù)合物與肥大細(xì)胞表面受體結(jié)合后被激活，然后發(fā)生脫顆?，F(xiàn)象，釋放多種炎癥介質(zhì)如組胺，激活后的肥大細(xì)胞還會(huì)合成和釋放細(xì)胞因子如IL-13，這些因子會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)Th2型過敏反應(yīng)。因此推測可能是不同加工方式破壞了魚餅中PV的二級結(jié)構(gòu)，掩蓋其抗原表位，導(dǎo)致加工處理組小鼠的Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答效果減輕，進(jìn)而抑制了其過敏反應(yīng)，其中聯(lián)合加工處理組的降低效果最佳。本研究結(jié)果顯示，與加熱組相比，其他加工方式制備的魚餅中的PV致敏性均顯著降低，其中F-HP處理對魚類主要過敏原PV的致敏性影響最為顯著。

3 結(jié) 論

本研究通過體外免疫學(xué)和紅外分析結(jié)合致敏動(dòng)物模型兩種方法，研究了4種加工處理方式對魚餅主要過敏原PV的免疫原性、二級結(jié)構(gòu)和致敏性的影響作用，發(fā)現(xiàn)與加熱組相比，其他處理組中F-HP處理對過敏原PV的二級結(jié)構(gòu)、免疫原性和致敏性影響最為顯著。此外發(fā)現(xiàn)加工處理可能會(huì)破壞PV的二級結(jié)構(gòu)，致其α-螺旋解旋為β-折疊，PV結(jié)構(gòu)的折疊化導(dǎo)致暴露的抗原表位被掩蓋，減輕Th2型細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而降低過敏反應(yīng)。本研究為今后開發(fā)低致敏性水產(chǎn)制品和過敏原的消減控制技術(shù)提供了科學(xué)依據(jù)。