艷山姜果實(shí)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

謝澤碧，洪影雯，梁子寧，盧 瑩，羅 敏，韋麗翠

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530001）

艷山姜［Alpinia zerumbet（Pers.）Burtt.et Smith］別名有假砂仁、草豆蔻、大良姜、土砂仁等［1，2］，習(xí)慣藥用部位是其成熟干燥的果實(shí)，性溫，味辛、澀，歸于肺、大腸、脾和胃經(jīng)［3］，功效有溫中、行氣、燥濕、止痛、截瘧等［4］，可以用來治療胃脘脹痛、胸腹脹滿、脾胃虛弱、腸鳴泄瀉、瘧疾等疾病［5］。多分布在中國(guó)東南部及西南部地區(qū)，習(xí)慣生長(zhǎng)在海拔100～1 000 m的溪邊叢林及草叢、闊葉林中［6，7］。目前，從艷山姜中分離出來的化學(xué)成分多達(dá)200余種，主要為揮發(fā)油、黃酮、甾體類和有機(jī)酸類等組分［8-13］。

目前，對(duì)艷山姜的研究主要集中在葉、根、莖的性狀［14］、多糖提?。?5］及揮發(fā)油等方面［16-19］，鮮見果實(shí)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面的報(bào)道。此外，還有報(bào)道稱艷山姜果實(shí)主要的藥理活性成分為揮發(fā)油，但究竟為蒎烯、乙酸龍腦酯還是黃酮類等化合物起作用還是綜合成分起作用并不明確，因此本研究對(duì)艷山姜進(jìn)行觀察鑒別、常規(guī)性檢查、浸出物含量測(cè)定以及揮發(fā)油含量的測(cè)定，以期為艷山姜果實(shí)在臨床用藥中能做到安全、有效、可控，以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試藥及試劑藥材采自廣西壯族自治區(qū)（以下簡(jiǎn)稱廣西）多個(gè)產(chǎn)地（表1），共11個(gè)批次，分別編號(hào)為YSJ-1至YSJ-11，其中YSJ-3為對(duì)照藥材。經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室韋松基教授鑒定為姜科植物艷山姜的成熟果實(shí)。

表1 艷山姜果實(shí)采集信息

乙酸龍腦酯、乙酸乙酯、甲醇、無水乙醇等均為分析純，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 主要儀器ZF-20C型暗箱三用紫外分析儀（上海精密儀器儀表有限公司）；EclipseE200MV型尼康生物顯微鏡（南京橫橋儀器有限公司）；GC7890A型氣相色譜儀、MS5975C型質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent科技公司）；揮發(fā)油提取器、中藥粉碎機(jī)等。

1.2 方法

1.2.1 藥材性狀鑒別艷山姜成熟果實(shí)為蒴果（圖1），具明顯粗毛，呈類球形，長(zhǎng)1.0～2.5 cm，直徑1.0～2.5 cm，有12～18條隆起；頂端常有宿存花被，底部有果梗；果皮棕色或黃棕色，皮薄、較軟，一層白色隔膜把果皮和種子分隔開成3瓣，每瓣有3～8顆種子；種子易散落、呈不規(guī)則多邊體，直徑0.3～0.5 cm，表面有白色的薄膜，撥開薄膜呈黑色、表面光滑、較硬，斷面有油性，氣微芳香、味微辛。

圖1 艷山姜果實(shí)

1.2.2 橫切片顯微鑒別艷山姜果實(shí)橫切片呈圓形（圖2），表面有許多毛茸，多為非腺毛，紅棕色為主，基本薄壁組織中有較多的油細(xì)胞（圖3），其胞腔具棕黃色油滴，其他薄壁細(xì)胞內(nèi)可見較小的草酸鈣方晶和淀粉粒；維管束分散排列在果皮薄壁組織中，20～25個(gè)維管束呈同心環(huán)狀，整個(gè)切片具2～3個(gè)同心環(huán)。由圖2可知，果實(shí)為3心皮，3個(gè)子房室，中軸胎座，每室3～8顆種子不等。

圖2 艷山姜果實(shí)橫切片

圖3 艷山姜果實(shí)顯微結(jié)構(gòu)

1.2.3 粉末顯微鑒別艷山姜果實(shí)粉末顯微特征見圖4。樣品粉末呈棕色或棕黃色，纖維較多、單個(gè)或成束、頂端較鈍，長(zhǎng)750～405 μm。非腺毛眾多，單細(xì)胞、多細(xì)胞均有散在，長(zhǎng)約80～390 μm。石細(xì)胞較多，單個(gè)或成團(tuán)，呈多邊形，長(zhǎng)約35～350 μm，寬約20～235 μm?？梢妰?nèi)、外果皮，且外果皮上具非腺毛的短痕。淀粉粒較少，常呈單粒或復(fù)粒，多為類圓形，大小約0.5～25.0 μm。草酸鈣方晶較少，長(zhǎng)約0.5～15.0 μm，寬約0.5～10.0 μm。螺紋導(dǎo)管較少，直徑約1.1～3.5 μm。

圖4 艷山姜果實(shí)粉末顯微特征

1.2.4 不同批次艷山姜藥材揮發(fā)油含量測(cè)定稱取艷山姜果實(shí)50 g，利用中藥粉碎機(jī)適當(dāng)粉碎至種子破裂，在圓底燒瓶中裝入粉碎后的艷山姜果實(shí)和500 mL蒸餾水，連接揮發(fā)油提取器。從冷凝管上部添加蒸餾水直到?jīng)]過揮發(fā)油提取器的刻度部分，保持混合液微沸狀態(tài)5～6 h，直至油量停止增加，則停止加溫，待稍冷卻后收集揮發(fā)油。參考《中國(guó)藥典（四部）》揮發(fā)油測(cè)定法［20］，測(cè)定11批藥材的揮發(fā)油含量。

1.2.5 艷山姜揮發(fā)油對(duì)照品溶液制備用分析天平分別精密稱取乙酸龍腦酯5 μL、3.00 g作對(duì)照品，對(duì)應(yīng)加入無水乙醇0.5、10.0 mL，制成10 μL∕mL的對(duì)照品溶液①和0.3 g∕mL對(duì)照品溶液②。

1.2.6 艷山姜揮發(fā)油供試品溶液制備精密稱取11批藥材粉末各1 g，分別加入甲醇5.0 mL，超聲處理10 min后進(jìn)行提取、過濾，取上清液置于2 mL容量瓶，制成供試品溶液①。分別量取11批藥材揮發(fā)油100 μL，用乙酸乙酯稀釋，定容至10 mL容量瓶中，即得供試品溶液②。

1.2.7 GC-MS儀器聯(lián)用

1）色譜條件。HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30.00 m×0.25 mm×0.25 μm），程序升溫：初始溫度50℃，以5℃∕min升溫至120℃，保持2 min，以6℃∕min升溫至260℃。運(yùn)行時(shí)間為43 min。柱流量：1 mL∕min。柱溫100℃，進(jìn)樣口溫度250℃，檢測(cè)器（FID）溫度250℃，分流比為10∶1。

2）溶液制備。參照“1.2.6”對(duì)照品溶液②、供試品溶液②方法制備。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層鑒別

參考2015年版中國(guó)藥典（四部）通則（0502）薄層色譜法，用移液槍吸取對(duì)照品溶液①、供試品溶液①各6 μL，分別點(diǎn)于同一塊硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-氯仿-乙酸乙酯（13-2-2）作展開劑。取出晾干后，在365 nm處觀察（圖5），結(jié)果表明，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)顯色清晰集中。

圖5 11批艷山姜果實(shí)粉末薄層色譜

2.2 檢查

2.2.1 水分參考《中國(guó)藥典（四部）》（通則0832）方法進(jìn)行水分測(cè)定［20］，11批艷山姜藥材水分為6.93%～15.72%（表2），多數(shù)在11%以下，初步擬定艷山姜果實(shí)藥材水分不得超過15.0%。

2.2.2 總灰分、酸不溶性灰分參考《中國(guó)藥典（四部）》（通則2302）方法進(jìn)行總灰分和酸不溶性灰分測(cè)定［20］，11批艷山姜藥材總灰分范圍為5.35%～6.80%，均在7.0%以下，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用考慮，初步擬定總灰分不得超過8.0%。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)酸不溶性灰分為0.93%～1.81%，大部分在1.5%以下，初步擬定酸不溶性灰分不得超過1.9%（表2）。

2.2.3 醇溶性浸出物參考《中國(guó)藥典（四部）》（通則2201）方法進(jìn)行醇溶性浸出物測(cè)定［20］，11批次艷山姜藥材的浸出物含量為5.65%～12.17%（表2），均在5.5%以上，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用考慮，初步擬定醇溶性浸出物不得低于5.0%。

表2 11批艷山姜藥材的檢查項(xiàng)測(cè)定結(jié)果（n=3）（單位：%）

2.2.4 膨脹度參考《中國(guó)藥典（四部）》（通則2101）的膨脹度測(cè)定法［20］，以無水乙醇做溶劑，3個(gè)批次艷山姜藥材的膨脹度為2.89～3.74 mL∕g（表3），結(jié)合實(shí)際應(yīng)用考慮，初步擬定艷山姜藥材膨脹度不得低于2.80 mL∕g。

表3 艷山姜膨脹度測(cè)定結(jié)果（n=3）

2.3 揮發(fā)油含量測(cè)定與分析

2.3.1 含量測(cè)定參考《中國(guó)藥典（四部）》（通則2204）揮發(fā)油測(cè)定法［20］，測(cè)定11批藥材的揮發(fā)油含量（表4）。11批艷山姜藥材平均揮發(fā)油含量范圍為0.85%～1.32%，均在0.80%以上；大部分在1.00%以上（包括1.00%）；11處產(chǎn)地艷山姜藥材揮發(fā)油的平均含量為1.04%；因此，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用考慮，擬定揮發(fā)油含量不得少于0.80%。

表4 11批艷山姜藥材揮發(fā)油含量 （單位：%）

2.3.2 GC-MS聯(lián)用分析對(duì)11批藥材使用GC-MS儀進(jìn)行分析，通過色譜峰面積歸一化法，定量分析揮發(fā)油中的11個(gè)含量較高、相對(duì)百分含量靠前的化學(xué)成分（表5）。

表5 不同產(chǎn)地艷山姜果實(shí)揮發(fā)油的主要化學(xué)成分及相對(duì)含量

經(jīng)GC-MS儀器聯(lián)用，測(cè)定11批艷山姜果實(shí)揮發(fā)油，結(jié)果表明，β-蒎烯成分相對(duì)含量最高，其次是檜烯和桉葉油醇等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，β-蒎烯藥理作用有消炎抗菌、抗氧化、抗癌、抗痙攣、抗抽搐等作用［20］；水芹烯具有殺弧菌、鎮(zhèn)痛消炎、抑菌等功效［21，22］；α-蒎烯具有潤(rùn)肺下氣、化痰止咳、消炎抗菌等功效［23-25］，即3種主要化學(xué)成分與艷山姜果實(shí)的功效主治具有一定相關(guān)性。

由測(cè)定分析可知，艷山姜果實(shí)揮發(fā)油中乙酸龍腦酯含量低，故根據(jù)文獻(xiàn)［26］，艷山姜與其他姜科植物不同，薄層鑒別中以其作為定性指標(biāo)的選擇還需進(jìn)一步考察。

3 小結(jié)與討論

通過對(duì)廣西多地的艷山姜果實(shí)藥材進(jìn)行性狀、顯微鑒別和薄層色譜鑒別，發(fā)現(xiàn)其鑒別特征均明顯、穩(wěn)定，可作為艷山姜果實(shí)藥材的鑒別依據(jù)。

前期預(yù)試驗(yàn)考察了多種展開系統(tǒng)、點(diǎn)樣方式、多種顯色劑、藥材取樣量、多種吸附劑及環(huán)境溫濕度，得出了穩(wěn)定且可靠的薄層鑒別方法。在本研究的薄層色譜試驗(yàn)中，以環(huán)己烷-氯仿-乙酸乙酯（13-2-2）為展開劑，在波長(zhǎng)365 nm處觀察，發(fā)現(xiàn)色譜分離度好、斑點(diǎn)清晰，斑點(diǎn)色彩層次分明。對(duì)11批艷山姜藥材水分、灰分及浸出物等進(jìn)行測(cè)定，依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，建議本品含水量限度不超過15.0%；總灰分限度不超過8.0%；酸不溶性灰分限度不超過1.9%；醇溶性浸出物限度不少于5.0%；膨脹度不低于2.80 mL∕g。

不同產(chǎn)地艷山姜藥材揮發(fā)油含量有較大差異，廣西11處產(chǎn)地艷山姜果實(shí)藥材揮發(fā)油的平均含量為1.04%。因不同的生產(chǎn)地和不同的采收時(shí)間藥材揮發(fā)油含量不同，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用考慮，建議按干燥品計(jì)算，揮發(fā)油含量不低于0.80%。文獻(xiàn)報(bào)道艷山姜揮發(fā)油具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)血脂、抗氧化作用［27］，可以作為艷山姜果實(shí)基于生物效應(yīng)組分的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)之一。由GC-MS儀器聯(lián)用分析可知，艷山姜果實(shí)揮發(fā)油主要由β-蒎烯、檜烯、桉葉油醇、蒎烯等化學(xué)成分組成，乙酸龍腦酯含量較低，在前期薄層鑒別中以其作為定性指標(biāo)的選擇還需進(jìn)一步考察。

綜上，本研究方法簡(jiǎn)便易行、復(fù)現(xiàn)性較好、特征明顯、無干擾、耐用性強(qiáng)，可以作為艷山姜果實(shí)藥材的鑒別方法，有利于其臨床用藥的安全、有效、可控，并為提升艷山姜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。