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      超高效合相色譜法測定纈沙坦原料藥中R-纈沙坦

      2022-12-30 11:52:28丁建營劉發(fā)貴劉思光李鐵健張貴民
      分析測試技術與儀器 2022年4期
      關鍵詞:峰形柱溫背壓

      丁建營,劉發(fā)貴,王 花,劉思光,李鐵健,張貴民

      (國家手性制藥工程技術研究中心,山東 臨沂 273400)

      纈沙坦(valsartan)是一種口服有效的特異性血管緊張素Ⅱ(AT1)受體拮抗劑,臨床用于治療輕、中度原發(fā)性高血壓[1-3]. 纈沙坦含有一個手性中心,存在一對對映異構體,其結構如圖1所示. 由于R-纈沙坦藥物活性遠低于S-纈沙坦,為了減少用藥所導致的不良反應率,故纈沙坦原料中需控制R-纈沙坦的含量. 目前已報道的測定R-纈沙坦的方法普遍為高效液相色譜法[4-7],其分析檢測時間較長,流動相大多為易揮發(fā)和氣味難聞的正己烷、異丙醇等溶劑,具有一定毒性,長期接觸對人體具有一定危害.現(xiàn)行的2020年版《中華人民共和國藥典》纈沙坦原料標準中R-纈沙坦的檢測方法采用α-酸性蛋白柱(AGP)[8]. 該色譜柱對使用和保存均有較為嚴格的要求,例如需要冷藏,使用柱溫要求20~30 ℃,堿性條件下色譜柱壽命下降明顯,間接地提高了檢測成本. 超高效合相色譜法(UPCC)作為一種新型色譜分離技術,使用二氧化碳為流動相,相比傳統(tǒng)高效液相分析技術,具有速度快且有機溶劑使用量少、重現(xiàn)性好、綠色環(huán)保的優(yōu)點[9-13],對手性化合物、熱不穩(wěn)定化合物、脂質、聚合物、高疏水性和/或強極性化合物的混合物具有很好的分離效果[14]. 本文采用UPCC建立了纈沙坦原料藥中R-纈沙坦的檢測方法,探討UPCC法的主要影響因素. 該方法使用要求較為寬松的多糖鍵和型手性柱(IC-3)為色譜柱,避免較多AGP色譜柱的一些局限性,為纈沙坦質量標準研究提供進一步參考,也為UPCC在藥品質量控制領域的應用提供借鑒.

      圖1 S-纈沙坦和R-纈沙坦結構圖Fig. 1 Chemical structure formulas of S-valsartan and Rvalsartan

      1 試驗部分

      1. 1 儀器

      Waters超高效合相色譜儀(美國沃特世公司),配備Empower 3化學工作站、合相管理器、柱溫箱、PDA檢測器;XPR10型百萬分之一電子分析天平(Mettler Toledo公司);CHIRALPAK IC-3色 譜 柱(100 mm×3.0 mm,3 μm);CHIRALCEL OJ色譜柱(4.6 mm×250 mm,10 μm);CHIRALCEL IB色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm).

      1. 2 試劑

      纈沙坦對照品(批號:100651-202006,純度:100%,中國食品藥品檢定研究院),纈沙坦原料(批號:200501、220101、220201,山東新時代藥業(yè)有限公司),R-纈沙坦對照品(批號:100836-201802,純度:100%,中國食品藥品檢定研究院),乙醇胺(TCI,批號:PWAWN-MO),三氟乙酸(TCI,批號:7XK60),甲醇(Merck,色譜純).

      1. 3 色譜條件

      色譜柱CHIRALPAK IC-3,流動相為甲醇(含0.5%乙醇胺)∶二氧化碳(體積比為20∶80);動態(tài)背壓(ABPR)13.79 MPa;流速1.0 mL/min;檢測器為電二極管陣列檢測器(PDA),掃描范圍:200~400 nm;柱溫40 ℃;進樣量:10 μL.

      1. 4 溶液配制

      對照儲備液:稱取R-纈沙坦對照品約5 mg,置于10 mL量瓶中,使用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得. 對照溶液:精密量取對照品儲備液1 mL,置于10 mL量瓶中,稀釋至刻度,搖勻,即得.

      供試品儲備液:稱取纈沙坦約100 mg,置于10 mL量瓶中,使用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得. 供試品溶液:精密量取供試品儲備液1 mL,置于2 mL量瓶中,稀釋至刻度,搖勻,即得.

      測試溶液:精密量取供試品儲備液2.5 mL和對照儲備液0.5 mL,置于5 mL量瓶中,使用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得.

      2 結果與討論

      2. 1 方法開發(fā)

      2. 1. 1 色譜柱的篩選

      參考S-纈沙坦和R-纈沙坦的化學性質,并結合UPCC儀器的特點,篩選了CHIRALCEL OJ、CHIRALCEL IB和CHIRALPAK IC-3色譜柱,試驗發(fā)現(xiàn)前兩款色譜柱無法將其分離,CHIRALPAK IC-3色譜柱有分離趨勢. 后經(jīng)調(diào)整流動相和柱溫,S-纈沙坦和R-纈沙坦實現(xiàn)基線分離,結果如圖2(a)~(e)所示.

      2. 1. 2 ABPR和柱溫的優(yōu)化

      ABPR是控制超臨界CO2性能的重要參數(shù),超臨界流體的密度和粘度會隨背壓的增加而增加,對合相色譜來說,選擇合適的背壓對分離度、峰形均有較大的影響. 隨著溫度和壓強的變化,密度為100%的CO2的質量濃度波動范圍為0.2~1.1 g/mL,而待測成分的溶解性取決于CO2的密度,因此提高CO2的壓強或者降低柱溫能夠增加待測成分在CO2中的溶解性. 考察了10.34、13.79、20.69 MPa背壓下的測試結果,發(fā)現(xiàn)背壓為10.34、20.69 MPa時,S-纈沙坦和R-纈沙坦峰形和分離度較差. 考察了色譜柱柱溫為35、40 ℃時的測試結果,如圖2(g)(h)所示. 由圖2(g)(h)可見,降低柱溫,纈沙坦及其對映異構體的保留時間提前. 升高柱溫,保留時間延后且基線噪音減小. 經(jīng)篩選,背壓13.79 MPa、柱溫為40 ℃時,纈沙坦與其異構體的峰形和分離度較好.

      圖2 方法開發(fā)色譜圖(a)(b)CHIRALCEL OJ色譜柱(4.6 mm×250 mm,10 μm),(c)(d)CHIRALCEL IB色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),(e)CHIRALCEL IC-3色譜柱(100 mm×3.0 mm,3 μm),流動相:乙醇(內(nèi)含0.2%三乙胺)溶液,(f)CHIRALCEL IC-3色譜柱(100 mm×3.0 mm,3 μm),流動相:乙醇(內(nèi)含0.2%三氟乙酸)溶液,(g)CHIRALCEL IC-3色譜柱(100 mm×3.0 mm,3 μm),流動相:甲醇(內(nèi)含0.5%乙醇胺)溶液,柱溫 40 ℃,(h)CHIRALCEL IC-3色譜柱(100 mm×3.0 mm,3 μm),流動相:甲醇(內(nèi)含0.5%乙醇胺)溶液,柱溫 35 ℃Fig. 2 UPCC chromatograms of developmental method

      2. 1. 3 流速的選擇

      合相色譜中,流速的變化會影響色譜保留時間和峰形,考察了流速0.9、1.0、1.5、2.0、3.0 mL/min,發(fā)現(xiàn)增大流速可使保留時間提前,峰形變窄,分離度降低,降低流速則反之. 試驗結果表明,流速為1.0 mL/min時可獲得較好的峰形和分離度.

      2. 1. 4 流動相的選擇

      分離極性化合物時,溫度和壓強固然很重要,但是流動相的組成更為重要. UPCC流動相中的分子間相互作用力強烈依賴于流體密度,并且因其主要流動相為超臨界CO2,極性過低,通常需加入有機溶劑作為改性劑改善峰形、保留時間和分離度. 常用的改性劑有甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、乙酸乙酯等[15]. 其次,向改性劑中加入酸性或堿性添加劑,這些添加劑能夠附著于固定相的活性位點,用于增加固定相極性,增強極性溶劑的峰形[16]. 流動相經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn),改性劑為甲醇,添加劑為乙醇胺時,纈沙坦與其對映異構體的峰形和分離趨勢較好,如圖2(e)~(h)所示.

      2. 2 方法學驗證

      2. 2. 1 專屬性

      按1. 3項下方法分別配制空白溶劑、對照溶液、供試品溶液和測試溶液,進樣分析. 結果顯示,空白溶劑對兩者檢測無干擾,測試溶液中S-纈沙坦和R-纈沙坦的分離度為2.038,如圖3所示.

      圖3 專屬性色譜圖(a)空白溶劑,(b)對照溶劑,(c)供試品,(d)測試溶液Fig. 3 UPCC chromatograms of specificity

      2. 2. 2 檢測限和定量限

      取1. 3項下S-纈沙坦和R-纈沙坦對照品儲備液,使用甲醇逐步稀釋,得到兩者信噪比約為3的檢測限溶液,信噪比約為10的定量限溶液. 結果表明,R-纈沙坦和S-纈沙坦的檢測限分別為3.357、6.803 μg/mL,定量限分別為10.072、20.408 μg/mL.

      2. 2. 3 溶液穩(wěn)定性

      按1. 3項下方法配制對照溶液、供試品溶液和測試溶液,每間隔1 h進樣一次,連續(xù)考察12 h,對照溶液中R-纈沙坦峰面積相對標準偏差(RSD)為3.0%. 供試品溶液和測試溶液中S-纈沙坦峰面積RSD分別為7.1%和4.4%,R-纈沙坦峰面積RSD分別為8.0%和5.9%. 供試品溶液和測試溶液中無雜質個數(shù)的增加.

      2. 2. 4 線性關系

      取1. 3項下R-纈沙坦和S-纈沙坦對照儲備液,采用甲醇配制成濃度梯度的混合線性溶液,依法測定. 峰面積(Y)為縱坐標,質量濃度(X)為橫坐標,繪制線性回歸曲線.R-纈沙坦在10.072~100.720 μg/mL質量濃度范圍內(nèi),線性方程為Y=428.910 5X?1.059 8,r為0.998 0(n=7).S-纈 沙 坦 在20.408~102.040 μg/mL質量濃度 范 圍 內(nèi),Y=443.936 8X?0.619 5,r為0.999 2(n=7).

      2. 2. 5 回收率

      按1. 3項下方法配制供試品儲備液和R-纈沙坦的對照儲備液,精密量取對照品儲備液0.4、0.5、0.6 mL,分別加入供試品儲備液2.5 mL,置于5 mL量瓶中加甲醇溶液定容即得80%、100%、120%的準確度溶液,每個濃度平行配制三份. 試驗結果表明,R-纈沙坦回收率在99.40%~106.93%之間,平均回收率為104.35%,RSD為3.4%(n=9),結果如表1所列.

      表1 R-纈沙坦回收率Table 1 Recoveries of R-valsartan

      2. 2. 6 耐用性

      分別考察標準條件,流速為(1.0±0.1) mL/min和背壓為(13.79±0.69) MPa時,R-纈沙坦測定結果的變化,測試溶液含量的RSD為4.8%,表明此法耐用性良好.

      2. 2. 7 樣品檢測

      按1. 3項下方法制備供試品溶液,按1. 2項下條件測定,結果纈沙坦原料(200501、220101、220201)中R-纈沙坦的質量分數(shù)分別為0.36%、0.31%、0.35%.

      3 結論

      超高效合相色譜是不同于氣相色譜、液相色譜的另外一種分離技術,是超高效液相色譜法與超臨界流體色譜法的結合體,其流動相為液體和超臨界氣體的混合物. 對于液相色譜和氣相色譜來說,合相色譜是一種可提供獨特工作流程、應用和環(huán)境影響效益的補充性可靠色譜平臺.

      成功使用超高效合相色譜的關鍵是使化合物的性質與它的技術性質相匹配,以及改性劑和添加劑在優(yōu)化分離中的重要作用.S-纈沙坦和R-纈沙坦要想得到良好分離,其極性需介于固定性和流動相之間,CO2作為流動相與正己烷的極性有點相似,在CO2中添加了甲醇為改性劑,其密度特性就隨之變化,其變成取決于所用的共溶劑種類的二次保留機制. 其次,向改性劑中加入乙醇胺為添加劑,增加了固定相的極性. 之后通過柱溫、流速等調(diào)整使其發(fā)生微妙的性質差異,從而得以分離. 本文首次建立了超高效合相色譜測定纈沙坦原料中R-纈沙坦的檢測方法,經(jīng)過系統(tǒng)驗證,表明本方法簡便、重復性高、準確度好,相比傳統(tǒng)高效液相色譜法檢測纈沙坦原料中R-纈沙坦的時間短,極大地提高了檢測效率,并且有機試劑的使用少,不僅降低了成本,還減小了對實驗人員的毒性危害.

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