發(fā)菜鹽脅迫響應(yīng)基因蔗糖合成酶S1的克隆及原核表達

李永寧，陳雪峰,2*，劉歡，孟廣燕，王科堂

1(陜西科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安，710021)2(陜西科技大學(xué) 陜西省農(nóng)產(chǎn)品加工研究院，陜西 西安，710021)

發(fā)菜(Nostocflagelliforme)是一種富含營養(yǎng)成分又具有荒漠化防治等生態(tài)作用的念珠狀藍藻[1]。野生發(fā)菜在干旱、半干旱地區(qū)分布居多[2]，長期面臨低溫、干旱、土壤鹽漬化等非生物脅迫[3]，生命力極強。發(fā)菜面臨惡劣環(huán)境仍能維持自身生長，一方面在于與環(huán)境脅迫相關(guān)的基因選擇性表達產(chǎn)生抵御能力[4-5]，另一方面發(fā)菜細胞分泌的多糖物質(zhì)發(fā)揮著重要作用[6]。發(fā)菜多糖是發(fā)菜藻體在生長過程中分泌的黏性長鏈多糖[7]，可使發(fā)菜在各種極端環(huán)境下具有更好的適應(yīng)性。同時，大量研究表明發(fā)菜多糖亦具有良好的抗炎抑菌效果[8]以及免疫活性[9-10]，是一種極具開發(fā)潛力的功能性資源[11]。鹽脅迫下發(fā)菜會積累胞外多糖用于緩解外界不利條件[12]，因此，研究發(fā)菜鹽脅迫響應(yīng)基因，既可以提高發(fā)菜多糖的產(chǎn)量，充分發(fā)揮發(fā)菜的資源價值，又可以提高發(fā)菜耐鹽性，提升其環(huán)境適應(yīng)能力。

蔗糖合成酶參與蔗糖代謝等多項生命活動，除去分解蔗糖，還具有參與細胞分化、提高植物抗逆性等多種生物學(xué)功能[13]。植物通過消耗蔗糖獲取生長養(yǎng)分，面臨逆境脅迫時，會積累蔗糖以抵御外界不利環(huán)境[14]。因此，開展蔗糖合成酶基因的分子信息及其在模式細胞中表達情況的研究，對明確生物逆境響應(yīng)的分子機制具有重要意義。

王貴春[15]將發(fā)菜在0.3 mol/L鹽濃度下培養(yǎng)，以正常組發(fā)菜作對照，發(fā)現(xiàn)一定鹽濃度培養(yǎng)下的發(fā)菜胞外多糖質(zhì)量分數(shù)增加了50.3%。趙秀霞[16]利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-Seq)，對正常培養(yǎng)及鹽脅迫(0.3 mol/L NaCl)培養(yǎng)的發(fā)菜細胞進行了轉(zhuǎn)錄組分析，得到了與發(fā)菜多糖合成相關(guān)基因(糖基轉(zhuǎn)移酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、多糖聚合酶等)的轉(zhuǎn)錄水平均發(fā)生顯著變化的結(jié)論。蔡國強等[17]將發(fā)菜中的GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因進行克隆及表達，論證了發(fā)菜合成多糖以響應(yīng)鹽脅迫受到相關(guān)基因調(diào)控的觀點。CUI等[18]將前期發(fā)現(xiàn)的耐鹽基因drnf1在集胞藻PCC 6803和擬南芥兩種模式植株中異源表達，印證了drnf1基因可以在更高水平上上調(diào)相關(guān)耐鹽基因的表達來提高耐鹽性的觀點。本研究通過PCR技術(shù)、基因重組等分子生物學(xué)手段克隆蔗糖合成酶S1基因，利用相應(yīng)軟件直觀表征目的蛋白氨基酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的種類和功能，構(gòu)建重組表達載體，誘導(dǎo)目的基因表達出預(yù)期大小的蛋白質(zhì)并優(yōu)化表達條件，為發(fā)菜響應(yīng)鹽脅迫相關(guān)基因、基因簇、作用位點及其響應(yīng)機制的研究奠定一定的基礎(chǔ)，為從基因水平提高發(fā)菜多糖產(chǎn)量提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)菜細胞由本實驗室用液體BG-11培養(yǎng)基培養(yǎng)[19]。DH5α、BL21感受態(tài)細胞及各種試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；pETsumo載體，武漢金開瑞生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MGC-250P Blue pard光照培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Mastercycler nexus PCR儀，德國Eppendorf公司；YCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀，艾科儀器設(shè)備公司；Genosens 1860電子成像分析系統(tǒng)，山東博科儀器公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 目的基因TA克隆及序列測定

利用試劑盒提取發(fā)菜基因組DNA，質(zhì)量檢測合格后-20 ℃保存待用。

在分析鹽脅迫下發(fā)菜轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合NCBI信息庫中所收錄的發(fā)菜基因組GeneBank信息，比對功能注釋和代謝通路，篩選鹽脅迫響應(yīng)基因蔗糖合成酶SS61.1：WP_100899461.1(S1)。利用同源重組的方法，加入NotI酶切位點及其前后部分同源片段設(shè)計引物，上游引物序列為S1F：5′-GGTGGTGGATCCGAATTCCGGACTATGTATGAACTGGTTC-AGGCCGTGTTTAACGGTGA-3′，下游引物序列為S1R：5′-CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTAGCCACCTT-TATGTTTCTCAAGAATTTTTTCGGCACG-3′。按95 ℃，5 min，95 ℃，30 s，55 ℃，1.5 min，72 ℃，1 min，30個循環(huán)，72 ℃，7 min的程序進行PCR反應(yīng)。電泳條帶與Marker比對，驗證目的基因大小，后將產(chǎn)物回收，連接線性化載體pETsumo，轉(zhuǎn)化DH5α，篩選陽性克隆子培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒后測序驗證。

1.3.2 序列分析

將測序結(jié)果上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST比對，測序序列與蔗糖合成酶S1序列一致，即表達載體構(gòu)建成功。依據(jù)核苷酸序列推譯氨基酸序列，分析目的蛋白的生化性質(zhì)。在得到目的蛋白氨基酸種類及含量等基礎(chǔ)信息后，分析物種間同源性。同時，在ExPASy-ProtScale中依據(jù)疏水性標(biāo)度判別蛋白質(zhì)的親/疏水性，在TM-HMM中分析目的蛋白有無跨膜區(qū)及所含跨膜區(qū)的個數(shù)，在NetPhos 3.1 Server中得到目的蛋白的磷酸化位點及個數(shù)，便于開展細胞調(diào)節(jié)通路等方面研究，結(jié)合DNAMAN和SPOMA預(yù)測信息，推理目的蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

1.3.3 蔗糖合成酶基因S1原核表達及表達條件優(yōu)化

將構(gòu)建成功的含蔗糖合成酶S1表達載體的BL21菌液(1%)轉(zhuǎn)接到15 mL含卡那霉素(kanamycin，Kan)抗性的無菌LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下過夜培養(yǎng)，活化菌種。抽提重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化具有高效表達能力的大腸桿菌BL21細胞，誘導(dǎo)蔗糖合成酶S1蛋白表達，SDS-PAGE檢測表達量。

在目的蛋白小量表達驗證成功的基礎(chǔ)上，對誘導(dǎo)表達的溫度、誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)時間、加入誘導(dǎo)劑時菌液OD600值、加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)的終濃度進行優(yōu)化，確定蔗糖合成酶S1的最佳表達條件。

1.3.3.1 IPTG終濃度優(yōu)化

活化后的菌種(1%)轉(zhuǎn)接到含Kan抗性的LB中培養(yǎng)，當(dāng)OD600值達到0.6時，加入IPTG使其終濃度分別為0.05、0.1、0.4、1.0 mmol/L，設(shè)置空白對照組，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取菌液制樣進行SDS-PAGE，確定誘導(dǎo)劑IPTG最佳終濃度。

1.3.3.2 添加誘導(dǎo)劑時的OD600值優(yōu)化

按1.3.3.1培養(yǎng)菌種，當(dāng)OD600值分別達到0.4、0.6、0.8、1.0時，加入IPTG(0.05 mmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取菌液制樣，SDS-PAGE電泳確定加入誘導(dǎo)劑時所對應(yīng)的最佳OD600值。

1.3.3.3 添加誘導(dǎo)劑后誘導(dǎo)時間優(yōu)化

按1.3.3.1培養(yǎng)菌種，當(dāng)OD600值達到0.8時，加入IPTG(0.05 mmol/L)，分別繼續(xù)培養(yǎng)2、4、6、8、12 h，取菌液制樣，SDS-PAGE電泳確定加入誘導(dǎo)劑后最佳誘導(dǎo)時間。

1.3.3.4 誘導(dǎo)溫度優(yōu)化

按1.3.3.1培養(yǎng)菌種，當(dāng)OD600值達到0.8時，加入IPTG(0.05 mmol/L)，分別在16、20、25、30、37 ℃溫度梯度下繼續(xù)培養(yǎng)4 h[20]，取菌液制樣，SDS-PAGE電泳確定最佳誘導(dǎo)溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因 TA克隆

提取發(fā)菜基因組DNA，OD260/OD280值為1.83，電泳條帶清晰，無雜帶(圖1)，說明DNA質(zhì)量高，可進行后續(xù)實驗。蔗糖合成酶S1基因體外擴增在2 400 bp位置出現(xiàn)特異性條帶，符合預(yù)期(圖2)。構(gòu)建蔗糖合成酶S1基因表達載體pETsumo-S1，轉(zhuǎn)化DH5α，挑陽性克隆擴大培養(yǎng)。菌液PCR結(jié)果可見2 900 bp左右條帶清晰(圖3)，結(jié)果正確(目的基因片段2 409 bp+克隆位點500 bp)，初步驗證表達載體構(gòu)建成功。

M-Marker 15 000+2 000；1～2-發(fā)菜DNA圖1 發(fā)菜基因組DNAFig.1 DNA from N.flagelliforme

M-Marker 15 000+2 000；1-蔗糖合成酶S1基因圖2 蔗糖合成酶S1基因PCR擴增Fig.2 PCR amplification of sucrose synthase S1 gene

M-Marker 5 000；1-蔗糖合成酶S1基因菌液PCR鑒定；2-pETsumo空載體PCR圖3 蔗糖合成酶S1陽性重組菌菌液PCRFig.3 PCR of sucrose synthase S1 positive recombinant bacteria

2.2 目的蛋白序列分析

2.2.1 核苷酸及氨基酸序列

蔗糖合成酶S1基因純化回收與線性化載體pETsumo成功連接后，使用載體通用引物對重組質(zhì)粒雙向測序，結(jié)果表明克隆得到的目的片段大小為2 409 bp(圖4)。分析可知蔗糖合成酶S1蛋白分子式為C4223H6460N1114O1205S23，分子質(zhì)量大小為92.85 kDa，編碼802個氨基酸。該蛋白中含量最高的氨基酸為亮氨酸(Leu)(11.8%)，谷氨酸(Glu)(8.5%)次之。蔗糖合成酶S1蛋白的理論等電點為5.52，不穩(wěn)定系數(shù)>40，達到40.84，故蔗糖合成酶S1蛋白為不穩(wěn)定蛋白。

將蔗糖合成酶S1基因核苷酸序列Blast進行同源性比對(圖5)，可見該基因保守性較高，與念珠藻(NostoccommuneHK-02)的同源度為93.16%，與念珠藻(Nostocsp. ATCC 53789)的同源度為90.24%，與念珠藻(Nostocsp. C057)的同源度為90.23%，與念珠藻(Nostocsp. TCL240-02)的同源度為89.99%，與念珠藻(NostocedaphicumCCNP1411)的相似度為89.05%。

由氨基酸序列比對分析結(jié)果(圖6)可知，蔗糖合成酶S1蛋白保守性高，與念珠藻(Nostocsp. C3-bin3)的同源度為95.14%，與念珠藻(Nostocsp. FACHB-892)的同源度為94.01%，與念珠藻(Nostocsp. HG1)的同源度為93.52%，與念珠藻(Nostocsp. FACHB-888)的同源度為93.15%，與念珠藻(Nostocsp. NZL)的同源度為91.02%。

2.2.2 蔗糖合成酶S1基因分析及性能預(yù)測

ExPASy-ProtScale檢測目的蛋白的疏水性，由圖7可知，表明蔗糖合成酶S1蛋白的多肽鏈中，第271位的纈氨酸正值最大，即疏水性最強，第534位的天冬酰胺負值最大，即親水性最強。以零值為界上下對比，該蛋白所含的親水性區(qū)間相對疏水區(qū)間更多，可知S1蛋白為親水性蛋白。

圖5 蔗糖合成酶S1基因核酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of sucrose synthase S1 gene sequence

圖6 蔗糖合成酶S1基因氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of sucrose synthase S1 gene amino acid sequence

圖7 蔗糖合成酶S1(SS61.1)疏水性分析Fig.7 Hydrophilic and hydrophobic analysis of sucrose synthase S1 (SS61.1)

TM-HMM 程序分析目的蛋白跨膜區(qū)，結(jié)果表明蔗糖合成酶S1蛋白無跨膜區(qū)。

NetPhos 3.1分析蔗糖合成酶S1蛋白磷酸化位點，其中包含37個Ser磷酸化位點、13個Thr磷酸化位點以及8個Tyr磷酸化位點。

DNAMAN和SOPMA分析預(yù)測蔗糖合成酶S1蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明該蛋白含3種二級結(jié)構(gòu)，包括235個α螺旋氨基酸(28.30%)，107個β折疊氨基酸(13.34%)，460個隨機卷曲氨基酸(57.35%)。綜合分析結(jié)果預(yù)測蔗糖合成酶S1蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要是α螺旋和隨機卷曲。

2.3 蔗糖合成酶S1基因在大腸桿菌中的表達

將構(gòu)建成功的pETsumo-S1重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，挑選陽性菌接種到含Kan的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，后轉(zhuǎn)接(1%)到新鮮LB中至OD600值達到0.6，加入IPTG(終濃度0.1 mmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)。取適量菌液離心棄去上清液，加入電泳緩沖液重懸菌體，于沸水中煮制，SDS-PAGE電泳檢測樣品。電泳條帶顯示約109 kDa處有預(yù)期大小的外源蛋白表達(圖8)，其中蔗糖合成酶S1蛋白分子質(zhì)量為92.85 kDa，His SUMOtag標(biāo)簽為16 kDa，說明S1基因成功誘導(dǎo)表達出目的蛋白。

M-Marker 14.4～116 kDa；1-大腸桿菌蛋白對照；2-0.1 mmol/L誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)S1-pETsumo重組蛋白表達圖8 蔗糖合成酶S1蛋白誘導(dǎo)表達電泳圖Fig.8 Electrophoresis of sucrose synthase S1 protein induction and expression

2.4 蔗糖合成酶S1在大腸桿菌中的表達條件優(yōu)化

分別對誘導(dǎo)蛋白表達時添加誘導(dǎo)劑的終濃度、添加誘導(dǎo)劑時的OD600值、添加誘導(dǎo)劑后誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)溫度進行單因素優(yōu)化，最終得到蔗糖合成酶S1蛋白的最佳誘導(dǎo)條件為當(dāng)OD600值為0.8時，添加終濃度為0.05 mmol/L的誘導(dǎo)劑，37 ℃、200 r/min條件下誘導(dǎo)6 h。

2.4.1 誘導(dǎo)劑IPTG終濃度優(yōu)化

電泳圖(圖9)泳道1～5分別對應(yīng)誘導(dǎo)劑IPTG濃度0、0.05、0.1、0.4、1.0 mmol/L，由圖9可知在不同終濃度IPTG作用下，蔗糖合成酶S1重組蛋白均有表達，其中0.05 mmol/L終濃度下表達量最高，說明在控制單因素條件下，IPTG終濃度0.05 mmol/L為最適誘導(dǎo)濃度。

M-Marker 14.4～116 kDa；1-不添加誘導(dǎo)劑；2～5-IPTG終濃度分別為0.05、0.1、0.4、1 mmol/L圖9 蔗糖合成酶S1重組蛋白誘導(dǎo)表達時IPTG終濃度優(yōu)化Fig.9 Optimization of IPTG final concentration of sucrose synthase S1 recombinant protein

2.4.2 添加誘導(dǎo)劑時的OD600值

電泳圖(圖10)泳道1～5分別對應(yīng)加誘導(dǎo)劑時OD600值為0.8、0.6、0.4、0.2及不加IPTG，由圖10可知菌液生長狀態(tài)不同，即對應(yīng)不同梯度的OD600值時，加入IPTG(0.05 mmol/L)，蔗糖合成酶S1重組蛋白表達量各不相同，OD600值對應(yīng)0.8時，電泳條帶顏色最深，目的蛋白表達量最高，說明在控制單因素條件下，目的蛋白在OD600值為0.8時加入誘導(dǎo)劑更能有效表達。

M-Marker 14.4～116 kDa；1～4-添加誘導(dǎo)劑時OD600值分別為0.8、0.6、0.4、0.2；5-不添加誘導(dǎo)劑圖10 蔗糖合成酶S1重組蛋白OD600值優(yōu)化Fig.10 Optimization of sucrose synthase S1 recombinant protein OD600

2.4.3 添加誘導(dǎo)劑后誘導(dǎo)時間

電泳圖(圖11)泳道1～5分別對應(yīng)添加誘導(dǎo)劑后誘導(dǎo)12、8、6、4、2 h，由圖11可知蔗糖合成酶S1重組蛋白在不同的誘導(dǎo)時長下表達量有所差異，誘導(dǎo)6 h時目的蛋白表達量最大，說明在控制單因素條件下，IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)6 h最佳。

M-Marker 14.4～116 kDa；1～5-添加誘導(dǎo)劑后分別誘導(dǎo)12、8、6、4、2 h圖11 蔗糖合成酶S1重組蛋白誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)時間優(yōu)化Fig.11 Optimization of induction time of sucrose synthase S1 recombinant protein inducer

2.4.4 誘導(dǎo)溫度

電泳圖(圖12)泳道1～5分別對應(yīng)添加誘導(dǎo)劑后誘導(dǎo)溫度為16、20、25、30、37 ℃，由圖12可知蔗糖合成酶S1重組蛋白均有表達，誘導(dǎo)溫度為37 ℃時，目的蛋白表達量最高，說明在控制單因素條件下，誘導(dǎo)劑IPTG在37 ℃下誘導(dǎo)效果最佳。

M-Marker 14.4～116 kDa；1～5-添加誘導(dǎo)劑后誘導(dǎo)溫度分別為16、20、25、30、37 ℃圖12 蔗糖合成酶S1重組蛋白誘導(dǎo)溫度優(yōu)化Fig.12 Optimization of induction temperature for sucrose synthase S1 recombinant protein

3 結(jié)論與討論

現(xiàn)階段，發(fā)菜鹽脅迫響應(yīng)基因的研究相對分散，尚未形成完整的分子體系，而高鹽脅迫可促進發(fā)菜多糖的合成，基因分子信息的豐富對于日后從基因水平提高發(fā)菜多糖產(chǎn)量具有重要意義。因此，本研究在篩選鹽脅迫響應(yīng)基因蔗糖合成酶S1的基礎(chǔ)上，采用分子生物學(xué)方法克隆出長度為2 409 bp的目的基因片段，純化回收目的片段與pETsumo質(zhì)粒連接構(gòu)建表達載體pETsumo-S1，并原核表達出分子質(zhì)量為92.85 kDa的目的蛋白，優(yōu)化該蛋白最佳表達條件為菌液在OD600值為0.8時添加終濃度為0.05 mmol/L的誘導(dǎo)劑，37 ℃、200 r/min條件下誘導(dǎo)6 h。這為明確發(fā)菜響應(yīng)鹽脅迫與發(fā)菜多糖生物合成間的內(nèi)在聯(lián)系，系統(tǒng)揭示發(fā)菜響應(yīng)鹽脅迫的內(nèi)在分子調(diào)控機制提供理論基礎(chǔ)。

然而，闡明發(fā)菜響應(yīng)鹽脅迫的調(diào)控機理涉及眾多基因、基因簇的研究，理論體系龐大，需要篩選并明確生物信息及功能活性的基因數(shù)目眾多，并且目前表達目的蛋白采用的大腸桿菌宿主細胞與發(fā)菜的親緣關(guān)系較遠，屬于異源表達，對于蛋白功能的驗證不足以確保其在藍藻中有同樣的表現(xiàn)。本研究對蔗糖合成酶S1基因氨基酸序列的Blast同源比對分析結(jié)果顯示，其與多個念珠藻菌株的同源度達到90%以上，可以以此為思路確定模式表達菌株展開今后研究。在模式藍藻細胞中構(gòu)建表達通路，直至將重組表達載體導(dǎo)入發(fā)菜藻體細胞表達并進行功能驗證能夠為相關(guān)調(diào)節(jié)機制的研究提供更權(quán)威的依據(jù)。