六味能消制劑中土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯含量測(cè)定研究及工藝探討

焦興蘋 馬青青 楊鳳梅

青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院/國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥(藏藥)，青海 西寧 810016;質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/青海省中藏藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016

六味能消制劑(六味能消丸、六味能消膠囊及六味能消片，以下同)是由藏木香、干姜、訶子、大黃、寒水石、堿花等六味藥材制成的復(fù)方制劑[1]。主要功效為：助消化，消腫，理風(fēng)和胃，用于食物中毒癥、積食不化、胃疼痛、胸腹腫脹、大便干燥、難產(chǎn)、胞衣脫落難等癥[2]。

藏木香味甘、苦、辛，藏醫(yī)理論認(rèn)為其可助消化，清風(fēng)熱、隆血熱、培根熱，治療疫癘、胃脘疾病與培根赤巴癥等[3]；中醫(yī)認(rèn)為其具有健脾和胃，行氣止痛的功效，用于治療胸肋、腕腹脹痛，嘔吐瀉痢，胸肋挫痛等癥[4]。藏木香中土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯具有多種藥理活性[5-6]，如土木香內(nèi)酯與異土木香內(nèi)酯均有殺蟲作用，分離純化的異土木香內(nèi)酯對(duì)四氯化碳致大鼠的肝損傷具有保護(hù)作用[7]。

藏木香在六味能消制劑的功能與主治中起關(guān)鍵作用，本研究采用氣相色譜法對(duì)A、B、C、D 4個(gè)廠家生產(chǎn)的六味能消制劑中藏木香所含揮發(fā)性成分土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的總含量進(jìn)行了測(cè)定，并制定合理限度，從而考察該制劑中藏木香是否規(guī)范投料以及各廠家生產(chǎn)工藝中溫度參數(shù)是否合理。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Sartorius SQP電子天平(德國(guó)賽多利斯)；7890B型氣相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；Milli-Q advantage A10超純水系統(tǒng)(Merck millipore)。

1.2 試藥 藏木香對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品鑒定研究院，批號(hào)：121630-201001)、土木香內(nèi)酯對(duì)照品(中國(guó)食品藥品鑒定研究院，批號(hào)：110760-201811；純度：99.4%)、異土木香內(nèi)酯對(duì)照品(中國(guó)食品藥品鑒定研究院，批號(hào)：110761-201510；純度：98.8%)中國(guó)食品藥品鑒定研究院；甲醇(AR，西隴化工股份有限公司)。

1.3樣品 六味能消丸(膠囊、片)共29批，涉及青海省、甘肅省、西藏自治區(qū)的4個(gè)生產(chǎn)廠家4種規(guī)格，該樣品均為市售樣品。詳細(xì)信息見表1。

表1 樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯總含量測(cè)定

2.1.1 溶液的制備

2.1.1.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取土木香內(nèi)酯對(duì)照品10.83 mg、異土木香內(nèi)酯對(duì)照品10.47 mg分別置25 mL具塞容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得土木香內(nèi)酯(濃度：0.43060 mg·mL-1)、異土木香內(nèi)酯(濃度：0.41377 mg·mL-1)對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取各儲(chǔ)備液1.5 mL置于50 mL具塞容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得(該混合對(duì)照品溶液含土木香內(nèi)酯12.9180μg·mL-1，異土木香內(nèi)酯為12.4131μg·mL-1)。

2.1.1.2 樣品溶液 取六味能消丸(膠囊、片)粉末1.0 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(220 V 35 kHZ)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.1.3 陰性樣品溶液 參照六味能消膠囊處方，按比例稱取除藏木香外其余各藥材，制成缺藏木香陰性樣品，并依照“2.1.1.3”方法制備，即得缺藏木香陰性對(duì)照溶液。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent HP-5毛細(xì)管柱(柱長(zhǎng)30 m,內(nèi)徑0.32 mm)；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；分流比：5∶1；檢測(cè)器(FID)溫度：280 ℃；流量控制模式：恒流模式；氮?dú)?載氣)：40 mL·min-1；氫氣：40 mL·min-1；空氣：400 mL·min-1；流量：1.5 m·min-1；柱溫：程序升溫，初始溫度為165 ℃，保持25 min，以90 ℃/min的速率升溫至240 ℃，保持5 min。

2.1.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、樣品溶液與陰性樣品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，樣品溶液色譜中在與土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯混合對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性樣品溶液無干擾，各成分色譜圖如圖1所示。

1.土木香內(nèi)酯；2.異土木香內(nèi)酯圖1 混合對(duì)照品溶液(A)、樣品溶液(B)、陰性樣品溶液(C)GC圖

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取土木香內(nèi)酯(0.43060 mg ·mL-1)、異土木香內(nèi)酯(0.41377 mg ·mL-1)的對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、3 mL，分別混至5個(gè)50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得各系列濃度的混標(biāo)溶液。分別精密吸取各系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液1μL，注入氣相色譜儀，測(cè)定，以混合對(duì)照品濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯的回歸方程分別為y=2.8704x+0.6924，相關(guān)系數(shù)r=0.9981，y=2.996x+0.4569，相關(guān)系數(shù)r=0.9991；土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯進(jìn)樣量分別在4.31～25.83 μg·mL-1、4.14～24.83 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取土木香內(nèi)酯(12.9180 μg·mL-1)、異土木香內(nèi)酯(12.4134 μg·mL-1)的混合對(duì)照品溶液1 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯峰面積RSD分別為0.79%、0.62%，結(jié)果表明土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取六味能消膠囊(企業(yè)C批號(hào)190701)粉末1.0 g，按“2.1.1.2”項(xiàng)下方法制備，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h注入氣相色譜，記錄峰面積，結(jié)果土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯峰面積RSD分別為0.91%、1.00%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取六味能消膠囊(企業(yè)C批號(hào)190701)粉末1.0 g，共6份，按“2.1.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算含量，結(jié)果土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯的總含量RSD為0.88%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的六味能消膠囊(企業(yè)C 批號(hào)190701)粉末6份，每份約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入土木香內(nèi)酯(3.8754 μg ·mL-1)、異土木香內(nèi)酯(5.3790 μg·mL-1)的混合對(duì)照品溶液25 mL，按“2.1.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。測(cè)得土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯平均回收率分別為101.72%、102.85%，RSD分別為0.98%、1.51%。

2.3 樣品測(cè)定 將4家企業(yè)29批不同批次的樣品，照“2.1.1.2”方法制備成供試品溶液。按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)藏木香在各劑型處方中的占比計(jì)算土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯的總含量。結(jié)果見表2。其中丸劑共有15批，測(cè)定結(jié)果最大值為0.87 mg/g，最小值為0.06 mg/g，平均值為0.24 mg/g，中位值為0.11 mg/g；膠囊劑共有10批，測(cè)定結(jié)果最大值為1.07 mg/粒，最小值為0.17 mg/粒，平均值為0.38 mg/粒，中位值為0.25 mg/粒；片劑共有4批，測(cè)定結(jié)果最大值為1.08 mg/粒，最小值為0.69 mg/粒，平均值為0.94 mg/粒，中位值為1.00 mg/粒。

表2 土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯總含量測(cè)定結(jié)果 (n=2)

3 結(jié)果分析及討論

3.1 結(jié)果分析 測(cè)定結(jié)果表明，六味能消制劑不同生產(chǎn)企業(yè)間、相同生產(chǎn)企業(yè)不同批次間土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯總含量均存在一定差異(利用SPSS軟件繪圖，如圖2所示)。藏木香屬于揮發(fā)性藥材，其中含有萜類揮發(fā)性成分較多，這些成分對(duì)溫度較為敏感，含量受原料質(zhì)量、儲(chǔ)藏、生產(chǎn)工藝的影響較大，企業(yè)C、企業(yè)D生產(chǎn)工藝各流程溫度均控制在較低水平，并且加熱時(shí)間短，土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯含量結(jié)果均在較高水平；企業(yè)A、企業(yè)B生產(chǎn)工藝中投料原藥材滅菌溫度高于100 ℃，并且加熱時(shí)較長(zhǎng)，導(dǎo)致土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的轉(zhuǎn)移率進(jìn)一步下降，造成含量結(jié)果均處于較低水平。

圖2 六味能消制劑各生產(chǎn)企業(yè)土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯總含量箱式圖

3.2 色譜條件考察 筆者參考《中國(guó)藥典》2020年版一部中土木香項(xiàng)下含量測(cè)定方法及相關(guān)文獻(xiàn)，考察了甲醇、乙酸乙酯等溶劑的提取效果，結(jié)果顯示甲醇提取率較其他溶劑高，因此采用甲醇作為提取溶劑[8]。分別采用DB-5，DB-17，HP-5色譜柱考察分離效果，結(jié)果HP-5毛細(xì)管柱分離效果好，溶劑峰影響較小，故本實(shí)驗(yàn)采用HP-5色譜柱。

3.3 討論 目前六味能消制劑標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，僅有六味能消膠囊具藏木香的定性考察。定量控制手段的缺乏，使得各標(biāo)準(zhǔn)無法客觀反映藏木香藥材的整體質(zhì)量，造成部分企業(yè)或?yàn)樽非罄麧?rùn)以次充好、或工藝條件設(shè)置不合理等情況，導(dǎo)致了六味能消制劑中土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯含量較低，影響了六味能消制劑的質(zhì)量和療效。本文建立了GC法測(cè)定土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯含量，該測(cè)定方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，可以用于考察六味能消制劑的質(zhì)量，為完善六味能消制劑標(biāo)準(zhǔn)和設(shè)置工藝參數(shù)提供依據(jù)。同時(shí)建議企業(yè)生產(chǎn)企業(yè)加強(qiáng)揮發(fā)性藥材的原料管理和控制，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，完善和提高民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，促進(jìn)民族藥的快速發(fā)展。