聚維酮碘對豚鼠耳毒性的實驗觀察

廖輝煌金雪玲夏云燕李朝霞陳靜熊園平余蓉涂翔羅五根

1南昌大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（南昌 330000）

2中山大學附屬第七醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（深圳 518107）

慢性化膿性中耳炎是耳科學最常見疾病，其常見的癥狀是反復耳流膿與聽力下降，影響患者的工作與生活，鼓室成形術是目前主要治療方法。鼓室成形術術后患者有1%-11%的概率發(fā)生術區(qū)感染[1]，其原因可能是與術前外耳和中耳未充分消毒及術中用生理鹽水沖洗術腔有關。目前，尚未有報道術前可用于中耳黏膜的消毒液。酒精和碘酒對皮膚黏膜有較大的刺激性，如遇面神經(jīng)裸露的患者，在中耳腔使用有致面癱的風險。在更早的研究中，已經(jīng)證明消毒劑氯己定，芐索氯銨和苯扎氯銨對豚鼠的內(nèi)耳具有耳毒性[2-4]。

聚維酮碘（Povidone Iodine,PVP-I）溶液是一種高效廣譜的殺菌消毒劑，目前已廣泛應用外科手術中皮膚與黏膜的消毒。但有關聚維酮碘能否用于中耳腔黏膜消毒及進入中耳后對中耳黏膜及內(nèi)耳毛細胞有無影響尚不清楚。目前，國內(nèi)外有少量關于聚維酮碘對中耳腔和耳蝸毒性的研究，部分動物實驗結果與臨床實驗結論并不完全一致。本實驗通過鼓室內(nèi)注入聚維酮碘溶液后從聽力學、中-內(nèi)耳解剖、免疫熒光染色及HE染色方面驗證聚維酮碘是否會對內(nèi)耳造成損害，探索聚維酮碘能否用于鼓室成形術中外耳道皮膚與中耳黏膜的消毒及中耳炎合并真菌感染的耳浴治療。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取26只正常體重成年豚鼠，由湖南太平生物科技有限公司提供（許可證號：SCXK（湘）2020-0005），雌雄不限。入選條件：ABR反應闕＜40dB nHL

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與給藥

隨機分成4組，一次生理鹽水給藥組（Once saline,OS）4只；一次聚維酮碘給藥組（Once PVP-I,OP）9只；連續(xù)生理鹽水給藥組（Continuous saline,CS）4只；連續(xù)聚維酮碘給藥組Continuous PVP-I,CP）9只。

1.2.2 動物造模

用電子分析天平稱取聚維酮碘粉末5.0g置容量瓶中，加生理鹽水定容至100ml，裝入棕色瓶中避光保存。一次給藥組：雙耳經(jīng)鼓室注射藥液0.2ml生理鹽水或聚維酮碘溶液，作用10min后吸出；連續(xù)給藥組：雙耳經(jīng)鼓室注射藥液0.2ml生理鹽水或聚維酮碘溶液，作用10min后吸出，一天一次，連續(xù)7天（圖1）。

圖1 中耳腔給藥場景Fig.1 Scenario of drug delivery in the middle ear scene

1.2.3 聽性腦干反應（ABR）測試

左下腹腔按40mg/kg體重注射，2%戊巴比妥鈉溶液麻醉，記錄電極置于耳后,參考電極置于顱頂,接地電極置于鼻尖，利用誘發(fā)電位系統(tǒng)檢測記錄ABR反應閾（圖2）。以短聲作為刺激聲，以能分辨出可重復III波的最低刺激強度判斷閾值。

圖2 ABR檢測場景Fig.2 ABR detection scene

1.2.4 中耳黏膜觀察

動物在過量麻醉狀態(tài)下,快速斷頭取兩側(cè)聽泡。由2位研究人員在顯微鏡下通過評分系統(tǒng)[5]（表1）對中耳腔充血、水腫,黏膜增厚和粘連程度進行評分。最后計算各項總平均分，最低4分，最高20分，分值越高，表示總體損傷越嚴重。

表1 中耳損傷嚴重程度的定義Table 1 Definitions for Severity of Middle Ear Damage

1.2.5 耳蝸基底膜免疫熒光染色

（1）剝離基底膜后用0.01M PBS洗三遍，每次10min；（2）PBST(0.25%Triton-PBS)浸泡 30 min；（3）5%BSA(PBST稀釋)室溫下封閉30min；（4）棄除BSA（5）滴加 PBST稀釋的一抗（1:200）及鬼筆環(huán)肽（1:200），4℃過夜保存 16h；（6）PBS漂洗 3次，每次10min；(7)滴加Alexa488標記的羊抗兔二抗，37℃避光孵育1h；(8)PBS漂洗3次，每次5min；（9）熒光防淬滅劑封片，免疫熒光顯微鏡下觀察，分別截取每組每個樣本耳蝸各回同等部位三排外毛細胞，在視野下記錄正常形態(tài)的細胞個數(shù)。

1.2.6 HE染色方法

取樣本置載玻片上，經(jīng)蘇木素染色，鹽酸乙醇分化，氨水反藍，伊紅染色，酒精脫水，二甲苯透明，封片后光鏡下閱片。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應用SPSS25軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，結果用t檢驗和Dunnett檢驗進行統(tǒng)計分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ABR檢測結果

實驗前，所有組豚鼠聽力全部正常，均在15-20dB nHL范圍（圖3a）。實驗后，OS和CS有1耳聽力稍有下降，變化范圍不超過10dB nHL（圖3b，c），差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；OP組有2耳聽力無下降，其余16耳有10-65dB nHL聽力下降（圖3d），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CP組有14耳全聾，90dB nHL未能引出III波（圖3e），其余4耳亦有嚴重聽力損失，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同時我們計算出四組間實驗后與實驗前聽力的差值發(fā)現(xiàn)，CP組聽力差值最大，OP組聽力差值次之，OS和CS組聽力差值接近于0。對比四組間聽力差值發(fā)現(xiàn)，除OS組與CS組聽力差值間差異無統(tǒng)計學意義外（P＞0.05），余各組間聽力差值間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），因此CP組聽力下降最明顯，OP組次之，OS和CS組聽力改變最不明顯。統(tǒng)計結果見表2。

表2 ABR 閾值（±s,n=56）（dB nHL）Table 2 ABR Thereshold（±s,n=56）（dB nHL）

表2 ABR 閾值（±s,n=56）（dB nHL）Table 2 ABR Thereshold（±s,n=56）（dB nHL）

Note：a,OS vs OP P＜0.05;b,OS vs CP P＜0.05;c,OP vs CS P＜0.05;d,OP vs CP P＜0.05;e,CS vs CP P＜0.05

Group OS OP CS CP Ear 8 18 8 18 Before administration 18.12±2.58 16.94±2.50 15.62±1.76 17.22±2.55 After administration 18.75±3.53 45.55±25.08 16.25±2.31 76.94±21.36 Difference between before and after administration 0.63±1.77a,b 28.61±24.60c,d 0.63±1.77e 59.72±22.3 T 1.00 4.93 1.00 11.34 P*P＞0.05*P＜0.05*P＞0.05*P＜0.05

圖3 a:正常豚鼠閾值在15-20dB nHL之間；b:OS組給藥后有1耳閾值從15dB nHL上升到20dB nHL；c:CS組給藥后有1耳閾值從20dB nHL上升到25 dB nHL；d:OP組給藥后閾值從15dB nHL上升到60 dB nHL；e:CP組給藥后閾值從15dBnHL上升到90dB nHL以上，未能引出有效的III波。Fig.3 a:The threshold of normal guinea pigs was between 15-20dB nHL;b:The threshold of 1 ear in the OS group increased from 15dB nHL to 20dB nHL after administration;c:The threshold of 1 ear in the CS group increased from 20dB nHL to 25 dB nHL after administration 2;d The threshold of OP group increased from 15dB nHL to 60 dB nHL after administration;e:The threshold of CP group increased from 15dB nHL to more than 90dB nHL after administration，and failed to elicit effective wave III after administration.

2.2 中耳、內(nèi)耳解剖結果

OS組與正常解剖結構無明顯差異，蝸殼表面覆有一層透明的黏膜，黏膜表面有1-2根微細血管，未出現(xiàn)黏膜充血、增厚、血腫、粘連現(xiàn)象（4a圖）；CS組偶見黏膜增厚和充血，無血腫和粘連形成；OP組以黏膜充血和血腫為主要變化，表現(xiàn)為蝸殼周圍黏膜充血的血管增多，中耳腔周圍出現(xiàn)不規(guī)則血腫，擴張的血管與之相連，無黏膜增厚和粘連現(xiàn)象（圖4b）；CP組損傷最嚴重，聚維碘酮滲入耳蝸后大多數(shù)整體呈褐色，蝸尖顏色最深，呈深褐色，整個中耳腔增厚的黏膜面積大于90%，血腫及充血面積大于50%，滲出物填滿整個中耳腔（圖4c），中耳腔、前庭池及骨螺旋板上有大量淡黃色絮狀滲出物（圖4d），其余組中耳腔及內(nèi)耳未見絮狀滲出物。中耳腔評分見表3。

圖4 a：OS組中耳腔黏膜無充血、增厚、血腫、粘連現(xiàn)象；b：OP組充血的血管（黑箭頭）與血腫（紅箭頭）相連；c：CP組中耳腔黏膜增厚（黃箭頭）、充血（紅箭頭），血腫（綠箭頭），滲出物（黑箭頭）；d：CP組前庭池和骨螺旋板上大量黃色滲出物（黃色箭頭）。Fig.4 a:OS group middle ear mucosa without hyperemia,thickening,hematoma,or adhesion;b:OP group congested blood vessels(black arrow)connected to hematoma(red arrow);c:CP group middle ear mucosa increased thick(yellow arrow),hyperemia(red arrow),hematoma(green arrow),exudate(black arrow);d:CP group a large amount of yellow exudate on the vestibular cistern and bone spiral plate(yellow arrow).

表3 中耳腔評分Table 3 Middle ear cavity score

2.3 HE染色結果

將CP組中耳腔及內(nèi)耳滲出物在載玻片上涂片，經(jīng)常規(guī)HE染色后可見大量炎癥細胞滲出（圖5）。

圖5 a CP組中耳腔滲出物HE染色；b：CP組內(nèi)耳滲出物HE染色（10×40）。Fig.5 a:HE staining of exudate from middle ear cavity in CP group 2;b:HE staining of exudate from inner ear in CP group(10×40).

2.4 耳蝸基底膜免疫熒光染色觀察結果

OS組和CS組（圖6、圖7）和OP組（圖8）耳蝸基底膜各回三排外毛細胞排列整齊，細胞形態(tài)清晰可辨認，細胞無腫脹，外毛細胞無丟失，三組間不存在明顯差別；CP組（圖9）各回外毛細胞均有不同程度丟失，以第一排丟失最常見，部分細胞腫大、結構模糊。所有組內(nèi)毛細胞均未出現(xiàn)丟失。四組各回三排外毛細胞計數(shù)結果如表4所示，研究發(fā)現(xiàn)各回中CP組毛細胞計數(shù)顯著低于其他三組（P＜0.05）,其他三組間毛細胞計數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。

圖6 OS組的三排外毛細胞排列整齊，細胞無腫脹、無缺失，纖毛呈V或W狀排列；OHC:外毛細胞，IHC：內(nèi)毛細胞；abcd依次為毛細胞第1、2、3、4回,×400Fig.6 In OS group,three rows of outer hair cells were arranged neatly,without swelling or deletion,and cilia were arranged in V or W shape;OHC:outer hair cells,IHC:inner hair cells;abcd is the first,second,third,and fourth circle of the basilar membrane,×400

圖7 CS組與OS組細胞形態(tài)無差異，×400Fig.7 There was no difference in cell morphology between CS group and OS group,×400

圖8 OP組基底膜毛細胞排列整齊均無丟失，形態(tài)正常，×400Fig.8 In OP group,basilar membrane hair cells were arranged neatly without loss,and their morphology was normal,×400

圖9 CP組各回外毛細胞均有不同程度丟失（白圈），部分細胞腫大、結構模糊（黑圈），×400。Fig.9 CP group outer hair cells were lost to varying degrees in each round(white circles),and some cells were swollen and blurred in structure(black circles),×400.

表4 四組動物耳蝸各回三排外毛細胞統(tǒng)計比較（個/高倍鏡，±s）Table 4 Statistical comparison of four rows of outer hair cells from cochlear each turn in three groups of animals（number/scope，±s）

表4 四組動物耳蝸各回三排外毛細胞統(tǒng)計比較（個/高倍鏡，±s）Table 4 Statistical comparison of four rows of outer hair cells from cochlear each turn in three groups of animals（number/scope，±s）

Note：b,OS vs CP P＜0.05;d,OP vs CP P＜0.05;e,CS vs CPP＜0.05.

Group OS OP CS CP Ear 8 18 8 18 1st turn 109.62±3.70b 109.33±4.67d 113.00±3.29e 84.11±25.06 2nd turn 107.87±3.09b 110.50±4.50d 110.50±3.50e 87.00±17.62 3rd turn 109.25±3.10b 109.77±5.03d 114.25±3.57e 91.50±22.44 4th turn 07.62±4.40b 110.50±4.38d 114.12±3.56e 90.77±13.52

3 討論

聚維酮碘是一種抗菌譜廣、效率高、起效迅速、安全性高、理化性質(zhì)穩(wěn)定的常用消毒劑，按化學物質(zhì)急性毒性分級標準屬實際無毒性，使用后10-30秒便能達到滿意效果，在臨床上常用于手術區(qū)域消毒、換藥、含漱、浸泡、術腔沖洗等方面。聚維酮碘系聚乙烯吡咯酮和碘的絡合物，聚乙烯吡咯烷酮作為載體，有助于增強碘的溶解度，在接觸到皮膚、黏膜后,緩慢釋放出游離碘,游離碘可使微生物機體的蛋白質(zhì)變性乃至凝固,導致死亡,而達到消毒殺菌的作用。目前市售碘伏有效碘含量為0.005g/ml，百分濃度為0.5%，多用于皮膚表面消毒；聚維酮碘溶液有效碘為0.05g/ml，百分濃度為5%。由此可見，后者的有效碘含量是前者的10倍，所以后者多用于手術創(chuàng)口的消毒[6-8]。

聚維酮碘對皮膚黏膜刺激小，可用于黏膜的消毒，但對中耳和內(nèi)耳損害的研究，臨床研究結論與部分動物實驗結果與并不完全一致。周詳、李永等人[7,9]使用5%聚維酮碘治療中耳炎合并真菌感染后通過檢測純音聽閾檢查發(fā)現(xiàn)患者未出現(xiàn)聽力下降。Jaya C等[10]給慢性化膿性中耳炎患者使用5%聚維酮碘滴耳液滴耳，研究結束時未見明顯不良反應。Piromchai[11]報道了一位36歲的女性，她將大約三滴10%聚維酮碘滴入她的左耳道，她立即感到劇痛和眩暈，純音聽閾檢測提示左耳重度感音神經(jīng)性耳聾，磁共振成像顯示左側(cè)前庭輕度強化。因此，即使單次使用聚維酮碘也可能導致嚴重的聽力損失和平衡失調(diào)。

在動物實驗中研究聚維酮碘溶液研究對內(nèi)耳是否有損害，不同實驗者的研究結果不同。Yagiz R等[12]通以豚鼠為實驗對象在鼓室內(nèi)注入0.1ml的10%聚維酮碘溶液，之后在第10天和第30天進行TEOAE檢測和耳鏡檢查。結果表現(xiàn)為TEOAE不能引出，6耳中發(fā)現(xiàn)2耳外耳道輕度水腫，4耳外耳道重度水腫。待外耳道皮膚消腫后行鼓室圖檢測仍然可以得到“A型”鼓室圖；而所有生理鹽水組耳的TEOAE反應、耳鏡檢查、鼓室圖檢測沒有改變，實驗結果表明聚維碘酮對豚鼠有耳蝸毒性作用；?zkiri?等[13]應用畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射研究不同濃度聚維酮碘溶液對大鼠中耳腔的耳毒性作用發(fā)現(xiàn)7.5%和10%聚維酮碘組在第1天和第10天表現(xiàn)出明顯的耳毒性作用，而5%聚維酮碘組在第10天沒有引起這種毒性作用，根據(jù)實驗結果提出大鼠鼓膜局部給藥可引起明顯的耳毒性作用；Ichibangase T等[14]通過通過測定圓窗膜復合動作電位發(fā)現(xiàn)，使用10%濃度的溶液在24小時和7天時輕度聽力損失，但使用5%的溶液在第7天時沒有聽力損失，并提出術中用生理鹽水沖洗中耳腔可使該產(chǎn)品的耳毒性作用降至最低。Perez等[15]在耳內(nèi)應用10%聚維酮碘溶液5天后檢測前庭誘發(fā)電位和聽性腦干反應發(fā)現(xiàn)兩者實驗前后沒有明顯的變化，因此認為在對鼓膜穿孔的耳朵進行消毒時，聚維酮碘可能比其他藥物更好。以上實驗僅觀察了實驗后的人或動物聽力學及電生理的改變，并未從細胞形態(tài)學上進行研究。本實驗通過實驗研究觀察耳蝸毛細胞的變化情況，從形態(tài)學方面提供了最直接的證據(jù)來驗證聚維酮碘對內(nèi)耳的毒性。

我們推測聚維酮碘溶液致聾可能有以下原因：1.骨迷路和膜迷路之間充滿細胞外液樣的外淋巴液，呈高鈉低鉀狀態(tài)，局部使用的聚維酮碘經(jīng)圓窗膜滲入到內(nèi)耳后解離出來的I-擾亂了外淋巴液成分而致聾，且作用時間越久，致聾的可能性越大；2.聚維碘酮溶液進入中耳及內(nèi)耳后產(chǎn)生炎癥反應致聾，根據(jù)滲出物HE染色結果可以加以證實；3.I-在起消毒殺菌的作用時也對毛細胞產(chǎn)生了殺傷作用，我們通過免疫熒光染色可看出，CP組造成了外毛細胞丟失；而OP組可能由于作用時間短，來不及滲入到內(nèi)耳而未造成損害；4.聚維酮碘溶液的濃度可能與聽力損失的嚴重程度有關。另外有研究報道[16]聚維碘酮碘可能具有致突變作用，當?shù)庾饔糜诿毎械哪承┑鞍踪|(zhì)因子，如DNA或核糖體，然后這些因子可通過遺傳密碼中的堿基替換突變而被殺死。

OP組雖無毛細胞丟失，但此時內(nèi)耳微環(huán)境可能發(fā)生了改變，毛細胞處于部分死亡而未溶解狀態(tài)，功能已經(jīng)受到影響，因為ABR閾值提高但仍有殘余聽力。CP組均是造成外毛細胞的丟失，這可能是由于內(nèi)毛細胞對毒性的抵抗力較外毛細胞強，而不同排的外毛細胞受到的損傷程度相同[17]。此時內(nèi)耳微環(huán)境發(fā)生明顯改變，產(chǎn)生了大量炎癥滲出物，大量毛細胞死亡，部分毛細胞溶解，在基底膜上出現(xiàn)缺失，而此時的ABR處于高閾值狀態(tài)。

從解剖學上講，與嚙齒類動物相比，人類的圓窗很少暴露于中耳腔，并且圓窗膜的厚度明顯更大且具有更多的膠原纖維。另外，臨床上使用的滴耳液通常是在局部炎癥的環(huán)境中進行的，而動物實驗研究通常是在健康的耳朵中進行的，急性炎癥可增加圓窗膜的通透性，而慢性炎癥由于組織纖維化而顯示出相反的效果[18]，這可能是不同實驗結果不一致的原因之一。

實驗從聽力學、中-內(nèi)耳解剖、免疫熒光染色及HE染色方面驗證了5%聚維酮碘溶液是具有耳毒性的。本實驗屬于動物實驗，下一步實驗將設置不同的藥物濃度梯度，探索最佳的藥濃度，即可有效消毒殺菌又不對聽力產(chǎn)生損害。同時，需大量臨床試驗和更有力度的檢測方法研究聚維酮碘的耳毒性，但基于目前的動物實驗結果，我們建議在耳科手術術前消毒時應當避免聚維酮碘溶液進入中耳以免產(chǎn)生損害。在手術消毒時我們可以用稍擠干的聚維酮碘棉片對外耳道及中耳黏膜進行填塞或擦洗，可降低聚維酮碘溶液經(jīng)圓窗膜滲入到內(nèi)耳的可能性。如不慎流入中耳腔應立即用生理鹽水沖洗干凈。另外，在中耳炎鼓膜穿孔合并外耳道真菌感染時也不建議使用聚維酮碘溶液進行耳浴治療，可局部填塞聚維酮碘紗條。