1007例新生兒聽力篩查及耳聾基因測序結(jié)果分析

黃衛(wèi)彤 劉錦嵩 王宗杰 廖旺 張峰，4 朱茂靈 鄢盛愷*

1南寧市婦幼保健院（南寧 530011）

2遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科（遵義 563003）

3遵義醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院（遵義 563006）

4中國科學院北京基因組學研究所（北京 100101）

聽力損失(hearing loss，HL)，即耳聾，是一種常見的導致聽覺敏感度下降的疾病，嚴重降低患者的生存質(zhì)量。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新數(shù)據(jù)，世界上約有4.3億人患有HL，包括3400萬兒童，超過世界人口的5%；預計到2050年，患有各種程度HL的人數(shù)將達25億人，至少7億人需要聽力康復治療[1]。HL的發(fā)病主要受到遺傳和環(huán)境兩方面因素的影響，其中與遺傳因素相關(guān)的HL占60%，根據(jù)臨床表現(xiàn)，遺傳性HL（hereditary hearing loss，HHL）患者中70%為非綜合征型HL（Nonsyndromic hearing loss，NSHL），30% 為綜合征型 HL（Syndromic hearing loss，SHL）[2]。耳聾的基因組異質(zhì)性很高，廣泛的研究表明，HHL的耳聾基因突變頻率在不同地區(qū)和不同民族之間差異很大，為了進一步分析南寧市新生兒耳聾基因突變情況以及耳聾基因突變與HL的關(guān)聯(lián)性，本研究針對GJB2、SLC26A4和GJB3采用靶向捕獲高通量測序方法對1007例聽力初篩未通過的新生兒進行測序分析，以評估新生兒聽力篩查的準確性，為耳聾致病基因聯(lián)合新生兒聽力篩查的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

隨機選取出生于2016年1月-2018年12月經(jīng)南寧市新生兒疾病篩查中心17000名新生兒聽力初篩未通過的1007例新生兒為研究對象，并收集其足跟血樣本進行耳聾相關(guān)基因靶向捕獲高通量測序（包括GJB2、GJB3、SLC26A4），通過廣西全民健康信息平臺查看這些新生兒的基本信息、聽力復篩和確診結(jié)果。本研究由南寧市婦幼保健院倫理委員會批準許可，所有參與該研究的新生兒家屬都簽署了知情同意書。

1.2 新生兒聽力篩查方法

聽力初篩采用RESONANCE?R14O篩查型耳聲發(fā)射儀（意大利產(chǎn)）進行耳聲發(fā)射（Otoacoustic emission，OAE）檢測，在新生兒出生后48～72h或出院前完成，初篩未通過者在出生后的42天內(nèi)完成復篩，復篩采用OAE和自動聽性腦干誘發(fā)電位反應（Automatic auditory brainstem response，AABR）組合檢測，測試環(huán)境噪聲均低于30dB(A)，AABR以在正常聽力級30～35dBnHL能引出V波為通過，一律雙耳復篩，仍未通過者則在出生后3～6個月時進行HL確診檢查。確診檢查采用聽性腦干反應（Auditory brainstem response，ABR）閾值做聽力損失分級：平均聽閾31-50dBnHL為輕度，51-70dBnHL為中度，平均聽閾71-90dBnHL為重度，≥90dBnHL為極重度。

1.3 標本采集和DNA準備

由護士采集新生兒靜脈血或足跟血，制成3個血斑濾紙并晾干，保存于-20度冰箱，留待檢測。用血片打孔器將血斑打孔得到6mm直徑的干燥血斑，經(jīng)萃取后，用DNA提取試劑（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA。

1.4 標本采集和DNA準備

根據(jù)Illumina MiniSeq平臺的操作流程將提取的gDNA用于文庫的構(gòu)建和測序，測序流程可簡單概括為：樣本gDNA濃度的檢測、文庫給構(gòu)建，對目的片段進行富集擴增以及純化、文庫的定量和質(zhì)檢、上機測序以及數(shù)據(jù)過濾。儀器包括PCR儀（ABI 2720 PCR），熒光定量PCR儀（ABI 7500）、測序儀（Illumina MiniSeq），配套試劑有PCR反應試劑（TAKARA Multiplex PCR Assay Kit ver.2）、文庫定量試劑盒（KAPA Library Quantification Kit Illumina platforms）。

1.5 統(tǒng)計分析

等位基因頻率，關(guān)聯(lián)分析，H-W遺傳平衡效驗采用PLINK 1.9[3]程序包進行分析，P＞0.05符合HW遺傳平衡，關(guān)聯(lián)分析用比值比(odd ratio，OR)表示，P＜0.01為具有統(tǒng)計學意義；其他數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進行分析，突變等位基因頻率和突變攜帶率以百分率（%）表示。

1.6 突變生物信息分析

運用BWA（Burrows Wheeler Aligner）軟件與人類基因組hg19進行比對單核苷酸多態(tài)性（SNPs）和插入缺失（indel）。通過Picard和GATK等軟件進行鑒定并采用snpEff軟件和dbSNP、千人基因組數(shù)據(jù)庫、HGMD、ClinVar等數(shù)據(jù)庫進行基因注釋和功能預測。根據(jù)《遺傳變異分類標準與指南》，將突變的臨床意義定義為“致病的”、“可能致病的”、“意義不明確的(VUS)”、“可能良性的”和“良性的”[4]。

1.7 蛋白結(jié)構(gòu)預測

運用RaptorX在線服務器[5]預測候選基因表達出的三維蛋白結(jié)構(gòu)，用PyMOL對RaptorX預測的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進行圖像處理。候選突變基因表達的氨基酸序列參考NCBI數(shù)據(jù)庫，比較突變型和野生型蛋白的二級結(jié)構(gòu)及功能變化。

2 結(jié)果

2.1 新生兒聽力篩查情況

初篩未通過的1007例新生兒在出生后的42天內(nèi)完成復篩，其中181例（17.97%，181/1007）未通過復篩，這些新生兒在出生后3～6個月內(nèi)完成HL確診檢查，78例（0.46%，78/17000）確診HL，其中單耳輕度24例，中度2例，重度4例，極重度4例，雙耳輕度29例，中度2例，重度3例，極重度2例，其余8例左耳和右耳的嚴重程度不同。78例確診HL患兒滿6個月后進行藥物治療3例，佩戴助聽器4例，其余71例進行了包括聽力補償、聽覺言語康復、行為康復治療以及教育等相關(guān)項目等干預。

2.2 耳聾基因測序結(jié)果

針對GJB2、GJB3、SLC26A4測序共檢測出709個突變等位基因，突變情況及等位基因頻率見圖1。聽力初篩未通過的新生兒中有355例（35.25%，355/1007）攜帶至少一種突變等位基因，237例檢出12種“致病的”或“可能致病的”突變位點，其中58例（24.48%，58/237）確診HL；78例檢出新錯義突變位點（c.217C＞A、c.316T＞G、c.676G＞T、c.739T＞C），其中2例攜帶GJB2c.217C＞A確診HL，13例聽力確診正常者檢出11種非編碼區(qū)多態(tài)突變。GJB2、GJB3、SLC26A4基因的突變攜帶率分別為1.75%（297/17000）、0.66%（113/17000）、0.36%（61/17000），等位基因頻率分別為25.07%（505/2014）、6.51%（131/2014）、3.33%（67/2014）。78例確診HL的新生兒中，檢出GJB2、GJB3、SLC26A4基因突變的占比分別為83.33%（65/78）、12.82%（10/78）、2.56%（2/78），其中檢出GJB2基因復合雜合突變9例，純合突變38例，均為致病突變，單雜合突變12例，為致病或可能致病突變，GJB3基因單雜合突變3例，多基因突變7例，另有9例（11.34%，9/78）未檢測到基因突變。檢出GJB2基因突變的確診新生兒，輕度聽力損失占68.93%、中度占8.74%、重度占11.65%、極重度占10.68%，檢出GJB3基因突變的確診新生兒，輕度聽力損失占58.33%、中度占8.33%、重度占33.33%、無極重度，檢出SLC26A4基因突變的兩例均為輕度聽力損失。

圖1 耳聾相關(guān)基因突變情況及等位基因頻率,“致病的”或“可能致病的”突變顯示為紅色柱。Fig.1 Deafness-related gene mutation and allele frequency,"pathogenic"or"possibly pathogenic"mutation is shown as red columns.

2.3 突變位點與HL的關(guān)系

以確診HL且突變陽性的新生兒為病例組、未確診HL且突變陽性的新生兒為對照組。分析本研究檢出的耳聾相關(guān)基因突變位點與HL之間的關(guān)聯(lián)，選取突變例數(shù)達到統(tǒng)計學標準的候選突變位點GJB2:c.109G＞A（8.99%）、c.79G＞A（4.82%）、c.608T＞C（2.53%）、c.341A＞G（3.77%），GJB3:c.357C＞T（3.92%）進行分析；哈迪-溫伯格遺傳平衡檢驗和基因型與表型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表1、2。結(jié)果顯示除c.109G＞A（c2=23.907；P＜0.001）外，其他候選位點的等位基因頻率在病例組和對照組中均符合HW遺傳平衡；除 c.608T＞C（Z=1.407；P＞0.05）外，其他候選位點的突變基因型與表型的關(guān)聯(lián)具有統(tǒng)計學意義。

表1 哈迪-溫伯格遺傳平衡檢驗結(jié)果Table 1 Hardy-Weinberg's equilibrium test result

表2 表型-基因型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果Table 2 Results of phenotype-genotype association analysis

2.4 蛋白預測結(jié)果

結(jié)果顯示（圖2），c.109G＞A和c.79G＞A對應的氨基酸序列改變分別為GJB2p.Val37Ile、GJB2p.Val27Ile，兩個位點都是由纈氨酸（Val）置換為異亮氨酸（Ile），這兩個種氨基酸都為非極性，兩種預測的突變型蛋白氫鍵連接、α-螺旋、β-折疊與其野生型相比均沒有差異，因為GJB3:c.357C＞T屬于同義突變，GJB2：c.341A＞G屬于非外顯子突變，故不能生成相應的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。

圖2 候選突變基因野生型和突變型預測三維蛋白結(jié)構(gòu)對比圖,黃色虛線表示氫鍵，氨基酸殘基上藍色表示氫鍵受體，紅色表示氫鍵供體；蛋白二級結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-折疊、無規(guī)卷曲分別以綠色、紫色、粉色著色；Val：纈氨酸、Ile：異亮氨酸。Fig.2 Comparison diagram of three-dimensional protein structure predicted by wild-type and mutant of candidate mutant genes.The yellow dotted line represents the hydrogen bond,the hydrogen bond receptors and donors on amino acid residues were colored as blue and red respectively;α-Helix,β-Sheet,and random coil were colored as green,purple,and pink respectively.Val:valine,Ile:isoleucine.

3 討論

近年來，許多基因位點的變異被證實與HL有關(guān)，截至2021年8月，已報道了約124個耳聾基因，存在約192個突變位點[6]，據(jù)報道，新生兒中HL的患病率約為1.8/1000，到5歲時，這一比率將達到約2.7/1000[7]，因此，HL的早期篩查和干預對于改善患兒語言、溝通和認知發(fā)展至關(guān)重要。新生兒普遍聽力篩查在我國已經(jīng)實施了20多年，這將確診HL的平均年齡從24-30個月下降到2-3個月，然而，目前的新生兒普遍聽力篩查方案對巨細胞病毒誘導的HL、氨基糖苷類抗生素誘導的HL和遲發(fā)性或進行性HL的診斷等存在局限性，因此將耳聾基因的檢測介入新生兒普遍聽力篩查計劃能有效彌補傳統(tǒng)聽力篩查的局限性。

GJB2、SLC26A4和GJB3基因是我國最常見的熱點耳聾基因，占HHL的70%～80%，其中GJB2基因占55%[8]。本研究確定了356例新生兒耳聾易感基因突變情況，由于檢測方法和研究對象的差異，突變檢出率高于其他研究，其中GJB2基因（占63.19%）的突變攜帶率（1.75%）最高，c.109G＞A等位基因頻率（8.987%）最高，其結(jié)果病例組不符合H-W遺傳平衡是由于突變頻率在病例組中比較高，GJB3、SLC26A4基因突變攜帶率較低，但略高于本地其他研究[9-10]。與我國南方其他地區(qū)相比，本研究GJB2和SLC26A4的基因突變攜帶率均低于成都市（2.20%、1.27%）、東莞市（4.16%、5.22%）、深圳市（1.98%），GJB3基因突變攜帶率與這三個地區(qū)的差異不大[11-13]。值得注意的是，355例耳聾基因陽性新生兒中有40.28%（143/355）的壯族人，有研究報道廣西地區(qū)漢族GJB2、GJB3和SLC26A4的突變攜帶率均高于壯族[14]，這或許是本研究突變攜帶率較低的原因，另外，本研究有51例（65.38%，51/78）確診HL者攜帶c.109G＞A，其中32例為壯族新生兒，由于壯族樣本量少，尚不能確定壯族成分對研究結(jié)果的影響。

GJB2基因的變異會影響間隙連接蛋白-26的表達，目前推測縫隙連接蛋白-26的缺失可能損害K+離子的循環(huán)，高濃度K+抑制谷氨酸的攝取，最終導致毛細胞凋亡[15]。GJB2c.109G＞A是否致聾存在爭議，孫菲菲[16]在耳聾患者家系中明確c.109G＞A會引起輕度的聽力損傷，劉清明等[17]發(fā)現(xiàn)攜帶c.109G＞A伴c.235delC的復合雜合突變者在3年的聽力密切隨訪未通過，而c.109G＞A純合突變者均通過。針對蛋白預測結(jié)果與本研究統(tǒng)計結(jié)果不符的情況，我們認為原因如下，在線服務器根據(jù)人工智能從現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中尋找相似度最高的蛋白結(jié)構(gòu)為模板擬合出的三維模型，并不能完全反映出蛋白表達的實際情況，c.109G＞A和c.79G＞A突變的確診HL新生兒中有13.06%的新生兒為GJB2復合雜合突變，甚至有7.25%為多基因突變，可能由多基因、多位點的復雜突變導致的HL，僅用單個位點的突變預測出的蛋白模型難以驗證與表型的關(guān)聯(lián)。

本研究的不足:1）作為針對新生兒的隨機篩查研究，我們的病例組樣本不夠大，還應增加樣本量，另外，應該對所有進行聽力初篩的新生兒進行耳聾基因測序。2）我們僅對3個耳聾相關(guān)基因進行測序，這些基因的覆蓋范圍很小，故存在一定程度的漏診，突變陰性的患者是否攜帶其他致病突變?nèi)匀晃粗罄m(xù)的研究需盡量采用全外顯子組測序以鑒定其他罕見的耳聾基因。3）我們無法收集到新生兒父母及其他親屬的樣本，故不能構(gòu)建核心家系，從遺傳的角度進行研究分析。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)GJB2c.109G＞A是廣西南寧市新生兒攜帶率最高的耳聾基因突變。獨立進行聽力篩查和耳聾基因測序篩查存在一定的缺陷，結(jié)合兩種篩查方法是臨床早期干預NSHL的有效策略。目前的結(jié)果對廣西地區(qū)耳聾基因篩選方案的建立應該是有價值的。