HPLC法同時測定不同產(chǎn)地菝葜中5種成分的含量

時向利，朱 倩

（1.江蘇康緣醫(yī)藥商業(yè)有限公司質(zhì)量部，江蘇連云港 222000；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司質(zhì)量部，江蘇連云港 222000）

菝葜為百合科植物菝葜Smilax chinaL.的干燥根莖，具有利濕去濁、祛風(fēng)除痹、解毒散瘀之功效，用于小便淋濁、帶下量多、風(fēng)濕痹痛、疔瘡癰腫[1]，臨床上用于慢性盆腔炎、附件炎等疾病的治療[2-3]。菝葜中主要含有黃酮類、有機(jī)酸類和皂苷類化學(xué)成分[4-5]，具有抗炎、抗腫瘤的作用[5-7]。2020年版《中國藥典》菝葜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未收載含量測定項，難以全面控制菝葜的質(zhì)量，菝葜含量測定方面的文獻(xiàn)報道主要有白藜蘆醇和黃酮類成分的含量測定[8-9]，本文以菝葜中活性成分綠原酸、落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇和異黃杞苷為對象，建立同時測定菝葜中綠原酸、落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇和異黃杞苷5種成分含量的方法，研究不同產(chǎn)地菝葜中5種成分的含量，可用于控制菝葜的質(zhì)量。

1 儀器和試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀，DAD檢測器；梅特勒MS105DU型電子分析天平；德意生040S型超聲波清洗機(jī)。

綠原酸（批號110753-202018，含量以96.1%計）、落新婦苷（批號111798-201805，含量以93.6%計）、黃杞苷（批號111906-201102，含量以93.7%計）和白藜蘆醇（批號111535-201703，含量以99.4%計），中國食品藥品檢定研究院；異黃杞苷（批號20210615，純度≥98%），購自北京謹(jǐn)明生物科技有限公司。乙腈和磷酸為色譜純，水為娃哈哈純凈水，甲醇為分析純。

22批菝葜藥材產(chǎn)地信息如下：S1，S2：安徽亳州；S3：安徽潛山；S4：安徽霍山；S5：安徽宣城；S6，S7：湖南岳陽；S8：湖南株洲；S9：湖南韶山；S10：湖南邵陽；S11：云南大理；S12：云南普洱；S13：云南昆明；S14：貴州遵義；S15：貴州興義；S16：貴州遵義；S17：四川綿陽；S18：四川德陽；S19：湖北宜昌；S20：湖北蘄春；S21：江西贛州；S22：江西南昌。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（4.6×150mm，3.5μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液；梯度洗脫，0～8min：6%→10%乙腈；8～35min：10%→35%乙腈；柱溫35 ℃；流速1.0mL/min；檢測波長303nm；進(jìn)樣量為10μL。見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.2 溶液配制

混合對照品溶液：取綠原酸、落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇和異黃杞苷對照品，精密稱定，用甲醇溶解制備為混合對照品溶液，濃度分別為100μg/mL、500μg/mL、100μg/mL、60μg/mL 和25μg/mL。

供試品溶液：取菝葜藥材粉末約1.5g，精密稱定，移至帶塞的三角瓶中，精密量取甲醇50mL加入三角瓶中，稱重，超聲提取50min，放冷后再稱重，用甲醇補(bǔ)重，搖勻，放置，取適量上清液離心，即得。

2.3 精密度試驗

取混合對照品溶液進(jìn)行進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6針。色譜圖中綠原酸、落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇和異黃杞苷的峰面積RSD分別為0.65%、0.71%、0.92%、0.69%和1.03%。

2.4 線性關(guān)系的考察

精密稱取落新婦苷11.75mg，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶內(nèi)，加甲醇使溶解后稀釋至刻度，作為落新婦苷母液。分別精密稱取綠原酸、黃杞苷、白藜蘆醇和異黃杞苷對照品13.00mg、11.69mg、12.49mg和6.61mg，轉(zhuǎn)移至同一50mL容量瓶內(nèi)，加落新婦苷母液制成X1溶液，將X1溶液用甲醇逐倍稀釋得X2、X3、X4、X5、X6和X7溶液，分別進(jìn)樣測定。用各指標(biāo)成分的峰面積對濃度（μg/mL）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果如下：綠原酸回歸方程Y=24.5598X+10.7828，r=0.9999，范圍3.90～249.86μg/mL；落新婦苷：回歸方程Y=9.1233X- 1.4909，r=1.0000，范圍17.19～1100.20μg/mL；黃 杞 苷：回 歸 方 程Y=15.7221X+0.4547，r=1.0000， 范 圍 3.42～219.00μg/mL ； 白藜蘆醇：回歸方程Y=16.0187X-1.1474，r=0.9997，范 圍3.88～248.40μg/mL；異 黃 杞 苷：回 歸 方 程Y=8.3343X+1.0147，r=0.9999， 范 圍 2.07～132.24μg/mL。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取編號為S1的菝葜藥材粉末，制備一份供試品溶液，室溫條件下放置0h、4h、8h、12h和16h時，進(jìn)樣分析。計算5個時間點(diǎn)所得圖譜中綠原酸、落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇和異黃杞苷峰面積的RSD，結(jié)果分別為1.58%、1.22%、1.37%、1.94%和1.16%。

2.6 重復(fù)性試驗

取編號為S1的菝葜藥材粉末6份，制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計算每份樣品中綠原酸、落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇和異黃杞苷的含量和6份樣品的平均含量。6份供試品中，5個指標(biāo)成分的平均含量分別 為 4.72mg/g、16.39mg/g、5.24mg/g、2.81mg/g和1.06mg/g，RSD分別為1.56%、1.19%、1.74%、1.82%和2.09%。

2.7 回收率試驗

取編號為S1的菝葜藥材粉末6份，每份取約0.75g，精密稱定，分別加入混合對照品母液2.0mL，制備供試品溶液，進(jìn)樣分析。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率結(jié)果（n=6）

2.8 樣品測定

取表1中22批菝葜藥材粉末進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

表2 22批菝葜中5個指標(biāo)成分的含量（單位：mg/g，n=2）

續(xù)表

從表2可知，5種指標(biāo)成分的含量分別為0.52～6.89mg/g、0.63～34.18mg/g、0.27～7.16mg/g、0.84～4.32mg/g 和0.087～1.78mg/g。從5種成分的均一程度來分析，均一性最好的為安徽產(chǎn)地的5批菝葜藥材，其他產(chǎn)地的藥材差異較大。

3 結(jié)論

采用全波長掃描方式，采集綠原酸、落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇和異黃杞苷在190～400nm的吸收光譜，根據(jù)5種成分的紫外吸收曲線選擇303nm作為含量測定的檢測波長。在進(jìn)行色譜柱優(yōu)選時，粒徑為5μm的色譜柱所得色譜圖中需測定的指標(biāo)成分分離效果差，達(dá)不到定量分析的要求，粒徑為3.5μm的色譜柱所得色譜圖中5個指標(biāo)成分的分離度均能達(dá)到定量要求。

本文建立了HPLC方法同時測定不同產(chǎn)地菝葜中綠原酸、落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇和異黃杞苷的含量，并進(jìn)行了完整的方法學(xué)驗證。從測定的22批菝葜藥材中綠原酸、落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇和異黃杞苷的含量結(jié)果可知，白藜蘆醇含量差異最小，含量最高與最低差異約為5倍，落新婦苷含量差異最大，含量差異高達(dá)五十多倍，可能與生長環(huán)境、土壤和采收季節(jié)等多種因素有關(guān)。菝葜藥材存在良莠不齊的現(xiàn)象，應(yīng)引起重視。