古方三白湯不同溶劑提取物美白作用比較研究

賈俊芳，孟德新，李淑霞，戴曉俠

（1.山東藥品食品職業(yè)學院，山東威海 264210；2.濟南市章丘區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，山東濟南 250200）

古語云“一白遮百丑”，白皙的皮膚一直是愛美人士的追求，在護膚品中，美白祛斑類產品一直廣受關注。但是近年來由于美白化妝品的需求巨大，使得一些不法商人利用大家的愛美之心，牟取暴利。根據國家食品藥品監(jiān)督管理網站通報，可以看出美白祛斑類化妝品成為化妝品違法的重災區(qū)，由于不合格產品導致的皮膚損傷以及身體損傷也常見報道。中藥因其主要來源于植物，溫和安全，近年來成為美容護膚研究的熱門原料。目前對于中藥美白作用的研究越來越多，越來越深入，有文獻報道具有酪氨酸酶抑制活性的中藥有人參、甘草、紅景天、黃芩、當歸、川芎等，其中甘草、人參抑制活性最為明顯[4-14]。三白湯來源于明代的《醫(yī)學入門》，由白芍、白術、白茯苓、甘草組成，水煎，溫服。此方配伍簡潔精當，適于氣血虛寒導致的皮膚粗糙、萎黃、黃褐斑、色素沉著等[15]。但是三白湯作為具有美容作用的傳統(tǒng)方劑，目前有研究證實白芍多糖、茯苓三萜、甘草苷、甘草酸等均具有酪氨酸酶抑制活性，白術具有較好的抗氧化活性[16-21]。但關于方劑三白湯的美白活性研究和現代應用均較少，本文將對不同溶劑的三白湯提取物的體外酪氨酸酶抑制活性進行對比，考察其美白效果，同時篩選最佳提取工藝，為制備安全、高效的天然美白產品提供理論依據。皮膚的顏色取決于皮膚中黑色素的數量，黑色素由人體表皮基底層的黑色素細胞產生。黑色素細胞中的酪氨酸在酪氨酸酸酶的催化下羥化為3,4-二羥基苯丙氨酸，即多巴，進一步氧化作用下形成多巴醌。從多巴醌可通過兩條不同的途徑生成真黑素與褐黑素。由此可以看出，酪氨酸氧化是黑色素合成的起始步驟，酪氨酸酶是黑色素合成中的關鍵限速酶。黑色素的生成和轉運是一個復雜過程，除酪氨酸酶外，還有多巴色素互變酶、過氧化物酶、DHICA氧化酶等，同時黑色素細胞的數量、活性也對黑色素數量有影響[1-2]。根據黑色素生產原理可以發(fā)現，皮膚美白的主要方法為減少黑色素沉積，目前主要的方法有：抑制黑色素形成；還原黑色素，防止光氧化；促進黑色素代謝；防止紫外線進入等。根據文獻分析，顯示研究得最多的是抑制黑色素的生成。美白作用主要的評價方法為生物化學法，在體外考察美白成分對酪氨酸酶活性影響；細胞生物學法，以人黑素細胞、鼠黑素瘤細胞等為模型，考察美容成分對細胞黑色素數量的影響；動物實驗，以豚鼠、小鼠等為模型，應用成分后考察其皮膚黑色素數量變化；人體實驗，應用于皮膚，通過膚色變化考察美白成分作用效果[3]。因此酪氨酸酶抑制實驗可以對活性成分進行初步的祛斑美白功效評價[4]。

1 材料與儀器

藥材：白芍（1907180143，產地補充）、白術（1904150032，產地四川），白茯苓（1906200522，產地遼寧），甘草（1902210312，產地江蘇），均購自安徽亳州藥材市場，經鑒定為真品。

試劑：L-多巴（BR，西安潤澤生物技術有限公司），蘑菇酪氨酸酶（25KU，BR，阿拉丁試劑有限公司），曲酸（BR，山東優(yōu)索化工科技有限公司），熊果苷（BR，山東優(yōu)索化工科技有限公司），磷酸鹽混合物（pH=6.8，AR，天津市大茂化學試劑廠），無水乙醇（AR，國藥集團化學試劑有限公司），純凈水（AR，自制）。

超聲微波清洗器（KQ3200DE，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），紫外可見光分光光度計（TU-1810，北京普析通用儀器有限公司），恒溫水浴鍋（HH-4，鞏義市予華儀器有限責任公司），pH計（PHSJ-4A，上海儀電科學儀器股份有限公司），電子天平（LE204E，奧豪斯），手動單道可調式移液器（100μL、200μL、1000μL，大龍興創(chuàng)實驗儀器），小型多功能粉碎機（500g，廣州是渲龍廚具有限公司），金屬篩（40目，廣州是渲龍廚具有限公司）。

2 方法與結果

2.1 試劑配制

磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=6.8）：將適量磷酸緩沖鹽用純凈水溶解，在250mL容量瓶中按照要求稀釋至刻度，搖勻。

酪氨酸酶溶液配制：將酪氨酸酶用上述配制的磷酸緩沖鹽溶解，配制成濃度為250U/mL的溶液。

L-多巴溶液配制：精密秤定L-多巴適量，加入上述配制好的磷酸緩沖鹽溶液，配制成濃度為5mg/mL的溶液。

2.2 不同溶劑三白湯提取物的制備

精密稱取白芍、白術、白茯苓、甘草各300g，將各藥材采用粉碎機粉碎，過40目篩，白芍、白術、白茯苓、甘草按照2∶2∶2∶1的比例混合均勻。稱取5g混合藥材粉末三份，分別加入50mL純凈水、50mL 50%乙醇、50mL乙醇，40℃超聲提取30min，過濾，將濾液蒸干，加入5mL配制好PBS溶解，備用。將溶解的提取物用磷酸緩沖鹽溶液稀釋成100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL，10mg/mL、5mg/mL、1mg/mL 6個濃度。

2.3 酪氨酸酶抑制活性測定

采用酪氨酸酶多巴速率氧化法檢測，在對照組加入1.8mL配制好磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）和0.2mL酪氨酸酶溶液；空白組加入2mL磷酸鹽緩沖液，三白實驗組加入磷酸鹽緩沖液0.8mL，酪氨酸酶溶液0.2mL和三白提取物溶液1.0mL；三白對照組加入磷酸鹽緩沖液1.0mL和三白提取物溶液1.0mL。以上溶液按要求移至試管，搖勻，置37℃水浴中溫育10min。取出后每個試管中加入L-多巴溶液1.0mL，反應 2min 后于紫外分光光度計（475nm）測定其吸光度（A）值。

按下列公式計算酪氨酸酶的抑制率：

Aa=對照組樣品吸光度；Ab為空白組樣品吸光度，Ac為三白反應組吸光度；Ad為三白對照組吸光度

實驗結果見圖1。

圖1 三白湯不同提取物酪氨酸酶抑制率

從圖1看出，不同溶劑三白湯提取物對酪氨酸酶活性均有不同程度的抑制作用，抑制活性均隨濃度的升高而增強，說明三白提取物對酪氨酸酶的抑制活性呈現濃度依賴性。在同等濃度下，50%乙醇提取物的抑制作用最強，抑制率高達86.19%，抑制活性非常明顯。

3 三白提取物最佳提取工藝考察

3.1 提取方式的考察

精確稱量三白湯粉末5g，加入10倍量的50%乙醇作為提取溶劑，其中一份藥材40℃超聲提取30min，一份藥材加熱回流1h，過濾，將濾液蒸干加配制好的磷酸緩沖鹽溶液溶解后，稀釋成濃度為50mg/mL溶液，按上述酪氨酸酶抑制實驗方法，對比考察不同提取方式提取的三白提取物的酪氨酸酶抑制活性。

實驗表明，提取方式加熱回流法制備的三白湯提取物與超聲法提取的三白提取物對酪氨酸酶抑制活性分別為83.33%和83.13%，二者區(qū)別不大，但超聲提取法操作更方便，同時時間更短，溫度也較低，減少活性成分分解，因此為了保護有效成分，提高提取效率，選擇超聲法作為三白提取物的提取方法。

3.2 提取溫度的考察

精確稱量三份三白湯粉末，加入10倍量的50%乙醇作為提取溶劑，分別在常溫（20～30℃）、40℃、50℃下超聲提取30min，過濾，將提取液蒸干加入配制好的磷酸緩沖鹽溶液溶解后，制備成濃度為50mg/mL溶液，按上述酪氨酸酶抑制實驗方法考察不同提取溫度提取的三白提取物的酪氨酸酶抑制活性變化。

常溫下超聲提取，三白提取物酪氨酸酶抑制率為82.13%，40℃下提取抑制率為83.49%，50℃下提取抑制率為79.57%。實驗結果表明，在低于40℃時，隨著提取溫度的增加，三白提取物對酪氨酸酶的抑制活性逐漸增加，但50℃提取時三白提取物對酪氨酸酶抑制活性降低，因此選擇40℃超聲提取作為三白提取物的提取溫度。

3.3 提取溶劑體積的考察

精確稱量三白湯粉末三份，加入8倍量、10倍量、12倍量的50%乙醇作為提取溶劑，40℃超聲提取30min，過濾，將提取液蒸干加配制好對磷酸緩沖鹽溶液溶解后，制備成濃度為50mg/mL溶液，按上述酪氨酸酶抑制實驗方法，對比考察提取溶劑體積對三白提取物的酪氨酸酶抑制活性的影響。

8倍量體積比提取的三白提取物酪氨酸酶抑制率為80.24%，10倍量提取的抑制率為83.15%，12倍量提取物的抑制率為83.01%。實驗表明，8倍量溶劑提取的提取物酪氨酸酶抑制活性較低，溶劑體積10倍和12倍對提取物酪氨酸酶活性影響不大，為了節(jié)約溶劑，因此選擇10倍量作為三白提取工藝的溶劑體積。

通過上述實驗，以酪氨酸酶活性抑制率為指標，最終確定三白提取物的最佳提取工藝為：精密稱取白芍、白術、白茯苓、甘草適量，將各藥材采用粉碎機粉碎，過40目篩，白芍、白術、白茯苓、甘草按照2∶2∶2∶1的比例混合均勻。藥材按照精確稱定藥材粉末適量，加入10倍量的50%乙醇，40℃超聲法提取30min，制得三白提取物原液。

4 結束語

隨著國家對中醫(yī)藥發(fā)展的整體推動及人們對中醫(yī)藥文化的了解深入，近年來對于中藥美白的研究越來越多，也越來越深入。三白湯作為傳統(tǒng)古方，長期臨床應用證明其具有較好的美白祛斑的功效，同時，三白湯四味藥物均被收錄于《已使用化妝品原料名稱目錄》，安全性得到保障，可以直接作為化妝品原料制備化妝品。雖然現在對于中藥美白作用的研究較多，但對于傳統(tǒng)方劑的美白作用研究較少。因為中藥成分的復雜性和質量的不穩(wěn)定性，使其在現代護膚產品開發(fā)應用時存在很大困難。本文通過體外酪氨酸酶實驗對三白湯提取物的美白活性進行了初步研究，結果表明三白湯50%乙醇提取物、乙醇提取物均有較好的酪氨酸酶抑制活性，同時以酪氨酸酶活性為評價指標，對三白湯提取物的制備條件進行了考察，為三白湯系列美白產品的開發(fā)提供了理論基礎。但是酪氨酸酶抑制實驗只能檢測對酪氨酸酶有較好作用的美白添加劑，而不能反映美白添加劑是否能透皮被吸收，也不能反映與黑色素合成有關的其他機制，因此，還需進一步采用細胞實驗、動物實驗、人體皮膚實驗等進行驗證。同時，三白系列化妝品的開發(fā)還需對三白提取物質量標準進行研究，以保證穩(wěn)定的三白提取物含量的穩(wěn)定性。三白湯作為純天然植物成分，美白效果較好，提取方法簡單易行，三白湯在美白祛斑化妝品應用領域具有廣闊應用前景。