補腎安胎沖劑對復發(fā)性流產(chǎn)小鼠胎盤滋養(yǎng)細胞miR-187、VEGF、VEGF-R2表達的影響

梁雪寶，王肖莉，張意林，劉敏，侯阿美，儲繼軍

1.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031

復發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指妊娠28周前與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3次及以上的自然流產(chǎn)。有研究顯示，連續(xù)發(fā)生2次流產(chǎn)者再次流產(chǎn)概率明顯升高，應予重視[1]。調(diào)查顯示，全球約1%～5%的育齡期女性患有RSA，給人類生殖健康造成重大威脅[2]。遺傳、解剖、血栓形成、免疫反應等為RSA的常見因素，但仍有50%～60%患者病因不明[3

]。

研究表明，母胎界面血管生成障礙與RSA發(fā)生關系密切，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在其中扮演重要角色[4]。微小RNAs（miRNAs）為一類內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，可通過調(diào)控VEGF表達影響母胎界面血管生成，從而參與RSA形成[5-6]。補腎安胎沖劑為安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，前期研究表明，補腎安胎沖劑可升高RSA小鼠蛻膜組織VEGF及其受體表達，促進血管生成[7-9]。前期對miRNAs進行篩查發(fā)現(xiàn)，miR-187可靶向調(diào)控VEGF基因。本研究在前期研究基礎上，通過體外實驗觀察補腎安胎沖劑含藥血清對RSA小鼠胎盤滋養(yǎng)細胞miR-187/VEGF通路的影響，探討補腎安胎沖劑治療RSA的分子機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雌性CBA/J小鼠18只，6～7周齡，體質(zhì)量（19±2）g，北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2019-0008。雄性DBA/2、BALB/c小鼠各5只，6～7周齡，體質(zhì)量（19±2）g；SPF級雄性SD大鼠20只，6～7周齡，體質(zhì)量（200±10）g，上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2017-0005。實驗動物均于安徽省中醫(yī)院動物實驗中心進行標準飼養(yǎng)。

1.2 藥物

補腎安胎沖劑（菟絲子10 g，桑寄生10 g，續(xù)斷10 g，熟地黃10 g，炙黃芪20 g，麩炒白術10 g，黨參10 g，黃芩10 g，白芍10 g，苧麻根10 g，墨旱蓮15 g），由安徽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院制劑室提供，批號BZ20080017。

1.3 主要試劑與儀器

Trizol（貨號15596018），美國Life Technogy；PrimeScripTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（貨號RR047A），日 本TaKaRa；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus（貨號E096-01B），蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司；DEPC水（貨號D1007），上海捷瑞生物；VEGF抗體（貨號bs-1313R），北京博奧森；血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGF-R2）抗體（貨號ab39256），英國Abcam；GAPDH抗體、羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG（貨號分別為TA-08、ZB-2305、ZB-2301），北京中杉金橋；ECL超敏發(fā)光試劑盒（貨號340958），美國Thermo；Lipofectamine 2000（貨號11668-019），美國Invitrogen；雙熒光素酶試劑盒（貨號E1910），北京普洛麥格；VEGF-WT（野生型）、VEGF-MU（突變型）質(zhì)粒，上海漢恒生物科技有限公司合成；miR-187模擬物及無義miR-187、miR-187 inhibitor及空白miR-187 inhibitor，上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成。熒光定量PCR儀（型號PIKOREAL 96），美國Thermo Scientific公司；EPS300電泳儀（型號EPS300）、VE-180電泳槽（型號VE-180），上海天能科技有限公司；流式細胞儀（型號CytoFLEX），貝克曼庫爾特有限公司。

2 實驗方法

2.1 造模

參照Clark等[10]方法，將18只雌性CBA/J小鼠分別與5只DBA/2雄鼠和5只BALB/c雄鼠合籠飼養(yǎng)，建立RSA小鼠模型和正常妊娠小鼠，每組9只。次日清晨檢查雌鼠陰道，見陰栓者，計為妊娠第0天，無則繼續(xù)合籠飼養(yǎng)。妊娠15 d后，腹腔注射10%異戊巴比妥鈉（100 mg/kg）麻醉孕鼠，頸椎脫臼處死，取出完整子宮，分離胎盤組織，置于-80℃冰箱保存。

2.2 細胞分離、培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

取胎盤組織剪碎，用胰蛋白酶和DNaseⅠ消化，PBS重懸，采用Percoll密度梯度分離液分離，收集滋養(yǎng)細胞層，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按Lipofectamine 2000說明書，將miR-187 inhibitor或空白miR-187 inhibitor轉(zhuǎn)染至胎盤滋養(yǎng)細胞。

2.3 含藥血清制備

將20只大鼠隨機分為含藥血清組與空白血清組，每組10只。含藥血清組以補腎安胎沖劑11.7 g/（kg·d）灌胃（按體表面積計算，相當于成人等效劑量的3倍），空白血清組予蒸餾水灌胃，灌胃體積0.2 mL/10 g，2次/d，連續(xù)7 d。末次給藥2 h后，腹主動脈取血，3 000 r/min離心20 min，取上層血清，滅活，除菌，-80℃冰箱保存。

2.4 含藥血清濃度和作用時間篩選

將RSA模型小鼠胎盤滋養(yǎng)細胞以1.0×105個/mL接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細胞分為對照組及1.25%、2.5%、5%、10%、20%、40%含藥血清組，每組3個復孔。對照組加入20%空白血清，其余各組分別加入相應濃度補腎安胎沖劑含藥血清，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72 h，每孔加入10μL CCK8孵育4 h。設置空白組調(diào)零，于酶標儀波長450 nm處測量各孔吸光度（OD值），計算細胞活力。細胞活力=（實驗組OD值-空白組OD值）÷（對照組OD值-空白組OD值）。

2.5 細胞分組及給藥

將細胞分為正常對照組（正常妊娠小鼠胎盤滋養(yǎng)細胞+20%空白血清）、模型組（RSA小鼠胎盤滋養(yǎng)細胞+20%空白血清）、補腎安胎沖劑組（RSA小鼠胎盤滋養(yǎng)細胞+20%含藥血清）、miR-187 inhibitor NC組（RSA小鼠胎盤滋養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)染空白miR-187 inhibitor+20%空白血清）、miR-187 inhibitor組（RSA小鼠胎盤滋養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)染miR-187 inhibitor+20%空白血清）、聯(lián)合組（RSA小鼠胎盤滋養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)染miR-187 inhibitor+20%含藥血清），每組9個復孔。將細胞接種至96孔板，按“2.2”項下方法轉(zhuǎn)染后，加入相應血清，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

2.6 RT-qPCR檢測

收集各組細胞，采用Trizol法提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，進行PCR。反應條件：95℃預變性1 min；95℃、20 s，60℃、1 min，共40個循環(huán)。miR-187以U6為內(nèi)參，VEGF、VEGF-R2以β-actin為 內(nèi) 參，2-ΔΔCt法 計 算mRNA表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.7 Western blot檢測

收集各組細胞，每105個細胞加入RIPA裂解液600μL，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心10 min。收集上清液，加入5×上樣緩沖液，沸水浴加熱10 min，冷卻至室溫，上樣，凝膠電泳，恒流轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，Western洗滌液中漂洗5 min，加5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。滴加VEGF和VEGF-R2一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，PBST洗膜3次，加入二抗（1∶20 000），室溫孵育2 h，PBST洗滌，ECL法顯影。Image J軟件對條帶進行分析。

2.8 雙熒光素酶實驗

取對數(shù)生長期胎盤滋養(yǎng)細胞，以105個/孔接種至12孔板，將VEGF-WT（野生型）及VEGF-MU（突變型）質(zhì)粒與miR-187模擬物或無義miR-187共轉(zhuǎn)染至胎盤滋養(yǎng)細胞，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，參照Promega雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

2.9 相關性分析

根據(jù)各組胎盤滋養(yǎng)細胞miR-187、VEGF、VEGF-R2 mRNA相對表達量，采用SPSS26.0軟件進行Spearman相關性分析。P＜0.05說明兩變量具有相關性，r＞0為正相關，r＜0為負相關。

2.1 0統(tǒng)計學方法

采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行分析。結(jié)果符合正態(tài)分布用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較，方差齊用LSD檢驗，方差不齊用Tamhane檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 補腎安胎沖劑含藥血清濃度和作用時間篩選結(jié)果

隨著含藥血清濃度增加，細胞活力升高，當含藥血清濃度為20%、作用48 h時，細胞活力最高。故選用20%含藥血清、培養(yǎng)48 h進行后續(xù)實驗。見圖1。

圖1 補腎安胎沖劑含藥血清濃度和作用時間篩選

3.2 補腎安胎沖劑對胎盤滋養(yǎng)細胞miR-187、血管內(nèi)皮生長因子、血管內(nèi)皮生長因子受體2 mRNA表達的影響

與正常對照組比較，模型組細胞miR-187表達顯著升高（P＜0.05），VEGF、VEGF-R2 mRNA表達顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，補腎安胎沖劑組細胞miR-187表達顯著降低（P＜0.05），VEGF、VEGF-R2 mRNA表達顯著升高（P＜0.05）；與miR-187 inhibitor NC組比較，miR-187 inhibitor組細胞miR-187表達顯著降低（P＜0.05），VEGF、VEGF-R2 mRNA表達顯著升高（P＜0.05）；與補腎安胎沖劑組及miR-187 inhibitor組比較，聯(lián)合組細胞miR-187表達顯著降低（P＜0.05），VEGF、VEGF-R2 mRNA表達顯著升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組胎盤滋養(yǎng)細胞miR-187、VEGF、VEGF-R2 mRNA表達比較（±s）

表2 各組胎盤滋養(yǎng)細胞miR-187、VEGF、VEGF-R2 mRNA表達比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與miR-187 inhibitor NC組比較，△P＜0.05；與補腎安胎沖劑組比較，▽P＜0.05；與miR-187 inhibitor組比較，□P＜0.05

組別正常對照組模型組補腎安胎沖劑組miR-187 inhibitor NC組miR-187 inhibitor組聯(lián)合組n 9 9 9 9 9 9 miR-187 1.00±0.06 1.31±0.09*1.11±0.02#1.31±0.12 0.91±0.06△0.73±0.05▽□VEGF 1.00±0.07 0.44±0.06*0.59±0.02#0.45±0.03 0.51±0.02△0.67±0.06▽□VEGF-R2 1.00±0.07 0.45±0.05*0.60±0.01#0.44±0.03 0.52±0.00△0.70±0.03▽□

3.3 補腎安胎沖劑對胎盤滋養(yǎng)細胞血管內(nèi)皮生長因子、血管內(nèi)皮生長因子受體2蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組細胞VEGF、VEGF-R2蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，補腎安胎沖劑組細胞VEGF、VEGF-R2蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與miR-187 inhibitor NC組比較，miR-187 inhibitor組細胞VEGF、VEGF-R2蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與補腎安胎沖劑組及miR-187 inhibitor組比較，聯(lián)合組細胞VEGF、VEGF-R2蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。見圖2、表3。

圖2 各組胎盤滋養(yǎng)細胞VEGF、VEGF-R2蛋白免疫印跡

表3 各組胎盤滋養(yǎng)細胞VEGF、VEGF-R2蛋白表達比較（±s）

表3 各組胎盤滋養(yǎng)細胞VEGF、VEGF-R2蛋白表達比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與miR-187 inhibitor NC組比較，△P＜0.05；與補腎安胎沖劑組比較，▽P＜0.05；與miR-187 inhibitor組比較，□P＜0.05

組別正常對照組模型組補腎安胎沖劑組miR-187 inhibitor NC組miR-187 inhibitor組聯(lián)合組n9 9 9 9 9 9 VEGF 0.67±0.05 0.19±0.04*0.43±0.06#0.19±0.04 0.29±0.07△0.53±0.08▽□VEGF-R2 0.77±0.04 0.27±0.02*0.54±0.01#0.28±0.02 0.40±0.02△0.61±0.02▽□

3.4 miR-187與血管內(nèi)皮生長因子靶向關系

雙熒光素酶實驗結(jié)果表明，miR-187能夠與VEGF靶向結(jié)合。與無義miRNA組比較，miR-187模擬物能夠使VEGF-WT熒光素酶表達顯著下調(diào)（P＜0.001）；而突變后，與無義miRNA組比較，miR-187模擬物對VEGF-MU熒光素酶表達無明顯影響（P＞0.05）。見圖3。

圖3 miR-187與VEGF結(jié)合活性比較（±s，n=9）

3.5 相關性分析

Spearman相關性分析結(jié)果顯示，miR-187表達與VEGF、VEGF-R2 mRNA表達呈負相關（P＜0.01），r分別為-0.67、-0.69。見圖4。

圖4 miR-187與VEGF、VEGF-R2相關性分析

4 討論

母胎界面血管重構(gòu)在RSA發(fā)生發(fā)展中占重要地位。受精后第3周，絨毛血管開始生成，胎盤循環(huán)建立，循環(huán)灌注充足是維持胚胎正常發(fā)育的重要因素，若胎盤形成過程中血管增生失衡、血供不足，則可導致胚胎停止發(fā)育而流產(chǎn)[11]。促進母胎界面血管重構(gòu)的關鍵在于血管新生，而血管新生是由促血管生成和抑血管生成因子調(diào)控的復雜過程，在這個過程中，VEGF作為最主要的促血管生成因子發(fā)揮重要作用[4]。其通過與跨膜受體VEGF-R1、VEGF-R2等結(jié)合，增加血管通透性、促血管內(nèi)皮細胞遷移、增殖等[12]。Vidyadhari等[13]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF基因多態(tài)性與南印度人RSA發(fā)生風險增加存在密切聯(lián)系。Bagheri等[14]研究表明，與健康非妊娠者及健康妊娠者相比，RSA患者體內(nèi)VEGF-A和VEGF-C表達明顯降低，且與年齡、體質(zhì)量指數(shù)及流產(chǎn)次數(shù)呈負相關，并指出VEGF-A、VEGF-C低表達與RSA易感性之間密切關聯(lián)，可將其作為原因不明RSA患者流產(chǎn)發(fā)生的預測標志物。

miRNAs主要通過調(diào)控靶基因表達發(fā)揮作用，其主要通過介導血管生成、細胞增殖、凋亡、免疫耐受等參與RSA發(fā)生[15-16]。miR-187作為頗受關注的miRNA，在惡性腫瘤、腦缺血、骨質(zhì)疏松等疾病中已有較深入的研究[17-19]。研究發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠者相比，RSA患者絨毛組織miR-187表達顯著升高[20]。Chen等[21]研究發(fā)現(xiàn)，與正常流產(chǎn)患者相比，RSA患者絨毛組織miR-187表達明顯升高，進一步研究miR-187對RSA的影響發(fā)現(xiàn)，過表達的miR-187可通過下調(diào)BCL6表達抑制PI3K/AKT信號通路，從而起到抑制滋養(yǎng)細胞增殖、遷移和侵襲作用，最終導致RSA。

補腎安胎沖劑以腎主生殖、胞胎系于腎為理論依據(jù)，由壽胎丸化裁而來，具有補腎健脾、益氣安胎之效。方中菟絲子益腎填精，為君藥；桑寄生、續(xù)斷補肝腎、安胎，熟地黃養(yǎng)血滋陰、益腎填精，黨參、炙黃芪健脾益氣固精，麩炒白術補益脾氣、安胎，黃芩清熱止血安胎，以上共為臣藥；白芍養(yǎng)血斂陰止痛，苧麻根、墨旱蓮涼血止血、安胎，共為佐使藥。全方既補先天，又培后天，精充血旺，胎得所養(yǎng)，孕胎乃固。補腎中藥被廣泛用于治療原因不明RSA[22]，且臨床療效顯著。李偉莉等[23]用補腎安胎沖劑治療RSA患者，分別于治療前后檢測患者血清VEGF及可溶性受體-1（sFlt-1）表達，發(fā)現(xiàn)補腎安胎沖劑可使VEGF表達升高，sFlt-1表達下降，從而促進胎盤血管新生，提高妊娠成功率。亦有實驗表明，補腎安胎沖劑可提高RSA小鼠蛻膜組織VEGF、VEGF-R2 mRNA和蛋白表達，調(diào)節(jié)Th1/Th2、Th17/Treg細胞平衡，從而改善蛻膜血管重構(gòu)，降低胚胎丟失率[7，24]。

本研究顯示，RSA小鼠胎盤滋養(yǎng)細胞miR-187表達顯著升高，VEGF、VEGF-R2 mRNA及蛋白表達顯著降低。補腎安胎沖劑干預后，miR-187表達顯著下調(diào)，VEGF、VEGF-R2 mRNA及蛋白表達顯著上調(diào)，提示補腎安胎沖劑可能通過靶向調(diào)控miR-187/VEGF通路，介導血管新生，促進母胎界面血管重構(gòu)，從而對RSA發(fā)揮治療作用。本研究為補腎安胎沖劑治療RSA的有效性提供實驗證據(jù)，但RSA母胎界面血管重構(gòu)機制較復雜，仍需聯(lián)合臨床試驗進行更深入的探索。