梨小食心蟲幼蟲中腸中高表達(dá)消化酶和解毒酶基因的篩選

呂棟標(biāo), 張戰(zhàn)利, 冷春蒙, 袁向群, 李怡萍,*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 植保資源與病蟲害治理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西楊凌 712100; 2. 陜西省植物保護(hù)工作總站, 西安 710003; 3. 西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西楊凌 712100)

梨小食心蟲Grapholitamolesta是一種重要的世界性果樹害蟲，廣泛分布于亞洲、歐洲、美洲和大洋洲的溫帶與亞熱帶地區(qū)(Chenetal., 2020)。在我國，除西藏未見報(bào)道外，廣布全國各地，尤其在東北、華北、西北、華東地區(qū)的桃、梨主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，危害嚴(yán)重，影響了果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入(冷春蒙等, 2018)。梨小食心蟲在我國每年發(fā)生3～5代，以老熟幼蟲在枝干裂縫、根莖基部和落葉雜草中越冬(李帥等, 2018)。越冬代成蟲將卵產(chǎn)在樹枝頂端嫩梢附近，卵孵化后蛀入嫩梢進(jìn)行取食危害，造成枝條萎蔫。幼蟲主要蛀食果實(shí)，排泄物會(huì)被堆積在蟲孔周圍，然后逐漸變黑，最后形成一大塊黑斑，俗稱“黑膏藥”，這也是梨小食心蟲取食危害的明顯特征(Duetal., 2015)。梨小食心蟲以幼蟲鉆蛀危害，化學(xué)農(nóng)藥不易觸，其次，成蟲個(gè)體小、習(xí)性隱蔽和世代重疊嚴(yán)重等特點(diǎn)，致使化學(xué)防治困難，防治效果欠佳(冷春蒙等, 2018)，且化學(xué)防治的弊端“3R”問題日益突出。果實(shí)套袋是傳統(tǒng)防治病害的有效方法之一，但均衡人力消耗和高效性的考慮，該方法遲早要淘汰。因此，需要探索綠色、高效、靶標(biāo)性強(qiáng)的其他防治技術(shù)來解決這些問題。

昆蟲中腸是昆蟲消化與吸收營養(yǎng)物質(zhì)、進(jìn)行解毒代謝的主要場(chǎng)所，在消化酶的分泌、食物的消化和防御外源有毒物質(zhì)等方面有著至關(guān)重要的作用(唐慶峰等, 2005; 葉曉冬, 2014)。胰蛋白酶(trypsin, TRY)屬于絲氨酸蛋白酶，氨肽酶(aminopeptidase, APN)是水解肽鏈N端單個(gè)氨基酸酶，與氨肽酶同屬外肽酶(exopeptidase)的還有羧肽酶(carboxypeptidase, CP)，三者在昆蟲腸道消化食物中起著重要的作用(趙愛平等, 2016, 2017)。昆蟲在取食過程中會(huì)攝入大量的毒素，為保證昆蟲正常生長發(fā)育，昆蟲腸道需要解毒代謝毒素，因此，解毒酶在中腸中起著重要作用。 細(xì)胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)和羧酸酯酶(carboxylesterase, CarE)是3種主要的解毒酶。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以快速獲得物種的基因數(shù)據(jù)信息，包括基因挖掘、分子標(biāo)記開發(fā)、基因表達(dá)分析等方面內(nèi)容，為后續(xù)研究提供強(qiáng)大的理論支持和豐富的遺傳信息(張棋麟和袁明龍, 2013)。鱗翅目昆蟲如家蠶Bombyxmori、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella、亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis和草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda等昆蟲已通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序完成了絲氨酸蛋白酶基因的篩選和鑒定(Linetal., 2015; Guanetal., 2017; Liuetal., 2017; Hafeezetal., 2021)。近年來，也有對(duì)于梨小食心蟲轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的研究，如Jung和Kim(2014)對(duì)梨小食心蟲性信息素腺體轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，Li等(2015)利用高通量測(cè)序平臺(tái)Illumina Mesiq對(duì)梨小食心蟲觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，Guo等(2017)對(duì)梨小食心蟲卵、幼蟲、蛹、成蟲等不同蟲態(tài)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，冷春蒙等(2018)利用高通量測(cè)序平臺(tái)Illumina HiSeq X Ten對(duì)梨小食心蟲的幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序。擁有如此多轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，可以對(duì)數(shù)據(jù)深挖掘，對(duì)梨小食心蟲幼蟲中腸基因功能進(jìn)行注釋分析，從中篩選與消化和解毒代謝相關(guān)的基因。

基于我們前期對(duì)梨小食心蟲幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及SSR分子標(biāo)記的研究基礎(chǔ)和擁有完整轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，深入研究梨小食心蟲消化酶和解毒酶的功能，闡釋梨小食心蟲取食寄主的多樣性機(jī)制，本研究對(duì)梨小食心蟲幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組高表達(dá)的基因進(jìn)行GO功能分類和KEGG代謝通路分析，篩選出具有完整開放閱讀框的消化酶和解毒酶基因，將其編碼的蛋白和鱗翅目其他昆蟲的同源蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析，并檢測(cè)基因在幼蟲不同齡期中腸中的表達(dá)量。研究將獲得梨小食心蟲消化酶和解毒酶的重要數(shù)據(jù)信息，同時(shí)為以中腸消化酶和解毒酶為靶標(biāo)的新型農(nóng)藥研發(fā)和轉(zhuǎn)基因作物提供重要的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

本研究試蟲梨小食心蟲幼蟲由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院害蟲防治研究室提供，飼養(yǎng)條件和飼料配方參照杜娟(2009)的方法。 在溫度26±0.5℃，相對(duì)濕度70%±10%，光周期15L∶9D (光照：6:00-21:00時(shí)，4 800 lx)的Boxun-BIC400人工氣候箱，以人工飼料飼養(yǎng)種群。

1.2 試驗(yàn)試劑

Trizol提取液(賽默飛)、三氯甲烷(阿拉丁)、異丙醇(阿拉丁)、75%乙醇(阿拉丁)、反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒(艾科瑞)、ChamQ SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊)和2×Accurate Taq Master Mix(艾科瑞)等。

1.3 梨小食心蟲幼蟲中腸總RNA的提取與cDNA合成

將人工飼養(yǎng)的梨小食心蟲2-5齡幼蟲在體視鏡下冰浴解剖中腸，并以0.15 mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行多次沖洗，將各樣本中腸組織液氮冷凍，保存于-80℃?zhèn)溆谩Ｃ繕颖驹O(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)50頭。采用Trizol法提取不同齡期梨小食心蟲幼蟲中腸總RNA，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和賽默飛2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度(OD260/OD280)和濃度，檢測(cè)合格的RNA采用艾科瑞熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.4 梨小食心蟲幼蟲中腸中高表達(dá)基因分析

對(duì)本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的梨小食心蟲4齡幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用RSEM法計(jì)算轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量，以FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)值表示基因的表達(dá)水平。選取質(zhì)控得到的樣品轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)FPKM值大于15的高通量基因組序列稱為高表達(dá)基因，進(jìn)行GO分類和KEGG通路富集分析(Lietal., 2013)。

1.5 消化酶和解毒酶基因的篩選、鑒定與序列分析

基于1.4節(jié)功能注釋信息，BLAST同源搜索從中腸轉(zhuǎn)錄組中篩選和鑒定高表達(dá)消化酶和解毒酶基因。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、小菜蛾和草地貪夜蛾等其他鱗翅目昆蟲同源基因編碼的氨基酸序列，通過MEGA采用Clustal X進(jìn)行多序列比對(duì)，利用鄰接法(neighbour-joining method, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1 000次bootstrap驗(yàn)證結(jié)果。

1.6 消化酶和解毒酶基因表達(dá)量檢測(cè)

利用qRT-PCR檢測(cè)1.5節(jié)篩選到的消化酶胰蛋白酶(TRY)、氨肽酶(APN)和羧肽酶(CP)以及解毒酶谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、細(xì)胞色素P450(CYP450)以及羧酸酯酶(CarE)基因在梨小食心蟲2-5齡幼蟲中腸中的表達(dá)量。參照張國輝和仵均祥(2015)的引物，選取梨小食心蟲β-actin(GenBank登錄號(hào): JN857938)和EF-1α(GenBank登錄號(hào): KT363835)為內(nèi)參基因，根據(jù)上述篩選的6種高表達(dá)基因，每種分別隨機(jī)選擇2個(gè)基因，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR的引物，引物信息如表1所示。

表1 基因和引物信息Table 1 Information of genes and primers

以1.3節(jié)合成的梨小食心蟲2-5齡幼蟲中腸cDNA為模板，用染色法進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，LightCycler480進(jìn)行檢測(cè)。利用ChamQ SYBR qPCR Master Mix，反應(yīng)體系(25 μL): ChamQ SYBR qPCR Master Mix (2×) 12.5 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1.0 μL, cDNA 2.0 μL, RNase-free ddH2O 8.5 μL。PCR擴(kuò)增程序: 95℃ 30 s; 95℃ 10 s, 60℃ 60 s, 40個(gè)循環(huán)。相對(duì)定量分析采用2-ΔΔCt法。

1.7 數(shù)據(jù)分析

消化酶和解毒酶基因在梨小食心蟲不同齡期的表達(dá)量數(shù)據(jù)初步整理后，利用SPSS軟件(SPSS17.0，SPSS Inc.，美國)對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)Turkey氏法進(jìn)行差異顯著性比較(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 梨小食心蟲4齡幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組中高表達(dá)基因的GO功能注釋和KEGG通路

GO功能分類統(tǒng)計(jì)(圖1)表明，103 677個(gè)高表達(dá)基因主要被注釋在生物學(xué)進(jìn)程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)3個(gè)大類共41個(gè)分支。其中生物學(xué)進(jìn)程中參與細(xì)胞進(jìn)程(cellular process)最多(10 501個(gè))，其次是代謝進(jìn)程(metabolic process)(9 548個(gè))和單一生物體進(jìn)程(single-organism process)(8 341個(gè))。分子功能中參與結(jié)合(binding)和催化活性(catalytic activity)較多，分別為10 700和7 680個(gè)。細(xì)胞組分中參與細(xì)胞(cell)和細(xì)胞部分(cell part)最多，均為5 904個(gè)，其次是細(xì)胞器(organelle)、大分子復(fù)合物(macromolecular complex)、膜(membrane)和膜部分(membrane part)，分別為4 028, 3 703, 3 586和3 357個(gè)。

圖1 梨小食心蟲4齡幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組中高表達(dá)基因的GO功能注釋Fig. 1 GO function annotation of highly expressed genes in the transcriptome of the 4th larval midgut of Grapholita molesta

KEGG通路富集分析如圖2所示，共有10 846個(gè)高表達(dá)基因參與了32組子代謝通路，5類生化代謝通路。細(xì)胞進(jìn)程注釋最多的代謝通路是運(yùn)輸和分解代謝(transport and catabolism)，為739個(gè)；環(huán)境信息處理(environmental information processing)注釋最多的代謝通路是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)，為1 167個(gè)；遺傳信息處理(genetic information processing)注釋最多的代謝通路是翻譯(translation)，為747個(gè)；新陳代謝(metabolism)注釋最多的代謝通路是碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)，為597個(gè)；有機(jī)體系統(tǒng)(organismal system)注釋最多的代謝通路是內(nèi)分泌系統(tǒng)(endocrine system)，為681個(gè)。

圖2 梨小食心蟲4齡幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組中高表達(dá)基因的KEGG代謝通路Fig. 2 KEGG metabolic pathways of highly expressed genes in the transcriptome of the 4th instar larval midgut of Grapholita molestaA: 細(xì)胞進(jìn)程Cellular process; B: 環(huán)境信息處理Environmental information processing; C: 遺傳信息處理Genetic information processing; D: 新陳代謝Metabolism; E: 有機(jī)體系統(tǒng)Organismal system.

2.2 梨小食心蟲4齡幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組中高表達(dá)消化酶和解毒酶基因

篩選到具有完整開放閱讀框的5個(gè)胰蛋白酶(TRY)基因、3個(gè)氨肽酶(APN)基因和9個(gè)羧肽酶(CP)基因都屬于消化酶基因。 GmolTRY CL10148.19112, GmolTRY CL10148.19006, GmolTRY CL10148.20460, GmolTRY CL10148.17450和GmolTRY CL10148.18912具有保守的活性三聯(lián)體His, Asp和Ser，同樣具有RIVGG和CQGDSGGP保守的末端序列，是典型的胰蛋白酶?；贕molTRYs和其他類群昆蟲的TRYs氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，發(fā)現(xiàn)梨小食心蟲的5個(gè)TRYs分支聚類較為分散，但都至少與1個(gè)鱗翅目昆蟲的TRY聚類在一支，且序列一致性很高。GmolTRY CL10148.19112和GmolTRY CL10148.17450分別與大豆食心蟲LeguminivoraglycinivorellaLglyTRY(GenBank登錄號(hào): AFP74111.1)和煙草天蛾ManducasextaMsexTRY(GenBank登錄號(hào): KAG6444168.1)聚到一支。GmolTRY CL10148.19006和GmolTRY CL10148.18912與阿波羅絹蝶ParnassiusapolloPapoTRYs(GenBank登錄號(hào): CAG4992335.1和CAG5037487.1)聚到一支。

圖3 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的梨小食心蟲4齡幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組中5個(gè)GmolTRYs與其他鱗翅目昆蟲胰蛋白酶(TRYs)的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))Fig. 3 Phylogenetic tree of five GmolTRYs in the transcriptome of the 4th instar larval midgut of Grapholita molestaand trypsins (TRYs) from other lepidopteran insects based on amino acid sequences using neighbor-joining method (1 000 replicates)蛋白來源物種Origin species of proteins: Gmol: 梨小食心蟲Grapholita molesta; Dchr: 金斑蝶Danaus chrysippus; Harm: 棉鈴蟲Helicoverpa armigera; Lsin: 條紋小粉蝶Leptidea sinapis; Mcon: 蓓帶夜蛾Mamestra configurata; Pxut: 柑橘鳳蝶Papilio xuthus; Papo: 阿波羅絹蝶Parnassius apollo; Sfru: 草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda; Tni: 粉紋夜蛾Trichoplusia ni; Bino: 伊諾小豹蛺蝶Brenthis ino; Csup: 二化螟Chilo suppressalis; Dple: 黑脈金斑蝶Danaus plexippus; Dsac: 小蔗桿草螟Diatraea saccharalis; Pmac: 金鳳蝶Papilio machaon; Obru: 冬尺蛾Operophtera brumata; Pxyl: 小菜蛾P(guān)lutella xylostella; Sexi: 甜菜夜蛾Spodoptera exigua; Aarg: 木棉蟲Alabama argillacea; Onub: 歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis; Snon: 蛀莖夜蛾Sesamia nonagrioides; Cfum: 云杉色卷蛾Choristoneurafumiferana; Hpun: 斑實(shí)夜蛾Helicoverpa punctigera; Hvir: 煙芽夜蛾Heliothis virescens; Hvir: 苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca; Lgly: 大豆食心蟲Leguminivora glycinivorella; Msex: 煙草天蛾Manduca sexta; Msep: 黏蟲Mythimna separata; Tbis: 衣蛾Tineola bisselliella. 下圖同The same for the following figures.

APNs(圖4)系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，梨小食心蟲的3個(gè)APNs分支聚類較為分散，且都與1個(gè)鱗翅目昆蟲的APN聚類在一支，且序列一致性很高。 GmolAPN CL10148.19035, GmolAPN CL10148.20703和GmolTRY CL10148.19013分別與蘋淡褐卷蛾EpiphyaspostvittanaEposAPN(GenBank登錄號(hào): AAF99701.1)、二化螟ChilosuppressalisCsupAPN(GenBank登錄號(hào): RVE53189.1)和冬尺蛾OperophterabrumataObruAPN(GenBank登錄號(hào): KOB65200.1)聚到一支。

圖4 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的梨小食心蟲4齡幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組中3個(gè)GmolAPNs與其他鱗翅目昆蟲氨肽酶(APNs)的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))Fig. 4 Phylogenetic tree of three GmolAPNs in the transcriptome of the 4th instar larval midgut of Grapholita molestaand aminopeptidases (APNs) from other lepidopteran insects based on amino acid sequences using neighbor-joining method (1 000 replicates)蛋白來源物種Origin species of proteins: Bmor: 家蠶Bombyx mori; Ldis: 舞毒蛾Lymantria dispar; Ofur: 亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis; Hcun: 美國白蛾Hyphantria cunea; Epos: 蘋淡褐卷蛾Epiphyas postvittana; Lxyl: 木毒蛾Lymantria xylina; Pint: 印度谷螟Plodia interpunctella; Sinf: 大螟Sesamia inferens; Cinc: 黃豆銀紋夜蛾Chrysodeixis includes; Cmed: 稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis; Mbra: 甘藍(lán)夜蛾Mamestra brassicae. 下圖同The same for the following figures.

CPs系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)顯示，梨小食心蟲的9個(gè)GmolCPs分支聚類較為分散，但都至少與1個(gè)鱗翅目昆蟲的CP聚類在一支，且序列一致性很高。 GmolCP CL10148.18096, GmolCP CL10148.19435, GmolCP CL10148.16225和GmolCP CL10148.11888分別與二化螟CsupCPs(GenBank登錄號(hào): RVE46147.1, RVE46146.1, RVE53886.1和RVE53889.1)聚到一支。 GmolCP CL10148.19435, GmolCP CL10148/19598, GmolCP CL10148.23889和GmolCP CL10148.19821分別與阿波羅絹蝶PapoCPs(GenBank登錄號(hào): CAG4972060.1, CAG4967861.1, CAG5016938.1和CAG5004946.1)聚到一支。 GmolCP CL10148.15735與另外8個(gè)GmolCPs沒有聚到同一分支，和其他鱗翅目昆蟲的CPs單獨(dú)聚到一支。

圖5 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的梨小食心蟲4齡幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組中9個(gè)GmolCPs與其他鱗翅目昆蟲羧肽酶(CPs)的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))Fig. 5 Phylogenetic tree of nine GmolCPs in the transcriptome of the 4th instar larval midgut of Grapholita molestaand carboxypeptidases (CPs) from other lepidopteran insect based on amino acid sequences using neighbor-joining method (1 000 replicates)

篩選到具有完整開放閱讀框的11個(gè)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因、13個(gè)細(xì)胞色素P450(CYP450)基因和8個(gè)羧酸脂酶(CarE)基因都屬于解毒酶基因。GSTs系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)顯示，梨小食心蟲11個(gè)GSTs聚類較為集中，GmolGST CL10148.20001, GmolGST CL10148.20002和GmolGST CL10148.20240聚到一支，同時(shí)與蘋果蠹蛾CydiapomonellaCpomGST(GenBank登錄號(hào): ARM39000.1)聚為一支。 GmolGST CL10148.18663, GmolGST CL10148.19812, GmolGST CL10148.20710, GmolGST CL10148.19617, GmolGST CL10148.19740和GmolGST CL10148.20112分別與蘋果蠹蛾CpomGSTs(GenBank登錄號(hào): ARM39003.1, ARM39002.1, ARM39006.1, AYX80656.1, ARM39009.1和AYX80655.1)聚到一支。 GmolGST CL10148.18801和GmolGST CL10148.16901分別與梨小食心蟲GmolGSTs(GenBank登錄號(hào): AVX32544.1和AVZ44716.1)聚到一支。

圖6 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的梨小食心蟲4齡幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組中11個(gè)GmolGSTs與其他鱗翅目昆蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))Fig. 6 Phylogenetic tree of 11 GmolGSTs in the transcriptome of the 4th instar larval midgut of Grapholita molestaand glutathione S-transferases (GSTs) from other lepidopteran insect species based on amino acid sequences using neighbor-joining method (1 000 replicates)蛋白來源物種Origin species of proteins: Cpom: 蘋果蠹蛾Cydia pomonella; Gpyl: 桑絹野螟Glyphodes pyloalis; Hvit: 黃野螟Heortia vitessoides; Slit: ?；页嵋苟闟podoptera littoralis; Hass: 煙青蟲Helicoverpa assulta; Aper: 柞蠶Antheraea pernyi; Aips: 小地老虎Agrotis ipsilon; Cfum: 云杉卷葉蛾Choristoneura fumiferana; Mtro: 楊小舟蛾Micromelalopha troglodyta; Gmel: 大蠟螟Galleria mellonella. 下圖同The same for the following figures.

CYP450s系統(tǒng)發(fā)育樹(圖7)顯示，梨小食心蟲13個(gè)CYP450s聚類較為集中，GmolCYP450 CL10148.27307和GmolCYP450 CL10148.23751聚為一支。 GmolCYP450 CL10148.180049, GmolCYP450 CL10148.21072, GmolCYP450 CL10148.20009, GmolCYP450 CL10148.19051, GmolCYP450 CL10148.19496和GmolCYP450 CL10148.19528分別與蘋果蠹蛾CpomCYP450s(GenBank登錄號(hào): AZJ25110.1, AXP17117.1, AXP17131.1, AZJ25111.1, AXP17178.1, AXP17211.1, AZJ25098.1和AXP17158.1)聚為一支。GmolCYP450 CL10148.25748和GmolCYP450 CL10148.21217分別與小菜蛾P(guān)xylCYP450(GenBank登錄號(hào): KAG7296067.1)和茶小卷葉蛾AdoxophyeshonmaiAhonCYP450(GenBank登錄號(hào): BBE49547.1)聚為一支。

圖7 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的梨小食心蟲4齡幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組中13個(gè)GmolCYP450s與其他鱗翅目昆蟲細(xì)胞色素P450(CYP450s)的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))Fig. 7 Phylogenetic tree of 13 GmolCYP450s in the transcriptome of the 4th instar larval midgut of Grapholita molestaand cytochrome P450s (CYP450s) from other lepidopteran insects based on amino acid sequences using neighbor-joining method (1 000 replicates)蛋白來源物種Origin species of proteins: Zfil: 六星燈蛾Zygaena filipendulae; Mcin: 慶網(wǎng)蛺蝶Melitaea cinxia; Prap: 菜粉蝶Pieris rapae; Ahon: 茶小卷葉蛾Adoxophyes honmai; Bman: 野桑蠶Bombyx mandarina; Eelu: 煙草粉螟Ephestia elutella. 圖8同The same for Fig. 8.

CarEs系統(tǒng)發(fā)育樹(圖8)顯示，梨小食心蟲的8個(gè)CarEs分支聚類較為分散，但都至少與1個(gè)鱗翅目昆蟲的CarE聚類在一支，且序列一致性很高。 GmolCarE CL10148.19098, GmolCarE CL10148.15194和GmolCarE CL10148.9606分別與蘋果蠹蛾CpomCarEs(GenBank登錄號(hào): AKP92859.1, AMB19667.1和AKP92857.1)聚到一支。 GmolCarE CL10148.15334, GmolCarE CL10148.15735和GmolCarE CL10148.20762分別與伊諾小豹蛺蝶BrenthisinoBinoCarE(GenBank登錄號(hào): CAH0729058.1), 冬尺蛾ObruCarE(GenBank登錄號(hào): KOB70573.1)和二化螟CsupCarE(GenBank登錄號(hào): AIY69075.1)聚為一支。GmolCarE CL10148.11834和其他的GmolCarEs沒有聚到一支，和其他鱗翅目昆蟲的CarEs聚成獨(dú)立的小分支。

圖8 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的梨小食心蟲4齡幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組中8個(gè)GmolCarEs與其他麟翅目昆蟲羧酸酯酶(CarEs)的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))Fig. 8 Phylogenetic tree of eight GmolCarEs in the transcriptome of the 4th instar larval midgut of Grapholita molestaand carboxylesterases (CarEs) from other lepidopteran insects based on amino acid sequences using neighbor-joining method (1 000 replicates)蛋白來源物種Origin species of proteins: Eobl: 茶尺蠖Ectropis obliqua; Cpun: 桃蛀螟Conogethes punctiferalis.

2.3 梨小食心蟲4齡幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組中高表達(dá)消化酶和解毒酶基因的表達(dá)量

消化酶和解毒酶基因在梨小食心蟲不同齡期幼蟲中腸的表達(dá)量差異顯著，基因表達(dá)量隨齡期呈現(xiàn)先增長后下降的變化趨勢(shì)，表達(dá)量均在4齡幼蟲期最高，消化酶基因各幼蟲齡期表達(dá)量依次為4齡>3齡>2齡>5齡，解毒酶基因各幼蟲齡期表達(dá)量依次為4齡>3齡>5齡>2齡(圖9)。消化酶基因在梨小食心蟲各幼蟲齡期的表達(dá)量特點(diǎn)不同，4齡時(shí)，TRY基因的表達(dá)量為2齡時(shí)的4倍左右，APN基因和CP基因的表達(dá)量均為2齡時(shí)的3倍左右(P<0.05)；3齡時(shí)，TRY基因、APN基因和CP基因的表達(dá)量均為4齡時(shí)的一半左右(P<0.05)(圖9: A-C)。解毒酶基因在梨小食心蟲各幼蟲齡期的表達(dá)量特點(diǎn)不同，4齡時(shí)，CYP450基因、GST基因和CarE基因的表達(dá)量均為2齡時(shí)的2.5倍左右；CYP450基因(CL10148.19323)在各幼蟲齡期表達(dá)量差異顯著(P<0.05)，CYP450基因(CL10148.19496)在3齡和4齡幼蟲中的表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。 GST基因和CarE基因在3齡和4齡幼蟲中的表達(dá)量均差異顯著(P<0.05)(圖9: E, F)。

圖9 消化酶(A-C)和解毒酶(D-F)基因在梨小食心蟲不同齡期幼蟲中腸中的表達(dá)量Fig. 9 Expression levels of digestive enzyme (A-C) and detoxification enzyme (D-F) genes in the midgut of Grapholita molesta larvae at different instarsA: 胰蛋白酶Trypsin (TRY)； B: 氨肽酶Aminopeptidase (APN); C: 羧肽酶Carboxypeptidase (CP); D: 細(xì)胞色素P450 Cytochrome P450 (CYP450); E: 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Glutathione S-transferase (GST); F: 羧酸脂酶Carboxylesterase (CarE). 圖中數(shù)據(jù)分別為3組重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤; 柱上不同小寫字母表示基因在不同齡期間的相對(duì)表達(dá)量差異顯著(P<0.05, ANOVA, Tukey氏HSD)。Data in the figure are means±SE. Different lowercase letters above bars indicate significant difference in the relative expression levels of genes between different instars (P<0.05, ANOVA, Tukey’s HSD).

3 討論

本研究對(duì)前期梨小食心蟲幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組高表達(dá)基因的分析發(fā)現(xiàn)，GO功能分類中參與細(xì)胞進(jìn)程、代謝進(jìn)程和催化活性的基因較多(圖1)。KEGG代謝通路在細(xì)胞進(jìn)程中注釋最多是運(yùn)輸和分解代謝，新陳代謝中注釋最多是碳水化合物代謝通路(圖2)。大量高表達(dá)基因參與細(xì)胞進(jìn)程與代謝和運(yùn)輸與分解代謝，說明梨小食心蟲幼蟲在發(fā)育過程中需要大量的蛋白質(zhì)和能量，因此蛋白質(zhì)和能量代謝較為旺盛。物質(zhì)代謝的主導(dǎo)地位說明此時(shí)的梨小食心蟲幼蟲有著較強(qiáng)的消化吸收能力，主要用于梨小食心蟲的消化和生長，與前期的研究結(jié)果(冷春蒙等, 2018)相同。但仍有一些注釋到非主要功能的基因，說明為了維持腸道的穩(wěn)定，也有很多細(xì)胞生物功能的基因參與。

通過高表達(dá)功能基因篩選，本研究得到完整開放閱讀框的消化酶基因17個(gè)(5個(gè)TRY基因、3個(gè)APN基因和9個(gè)CP基因)以及解毒酶基因32個(gè)(11個(gè)GST基因、13個(gè)CYP450基因和8個(gè)CarE基因)。與其他鱗翅目昆蟲相比獲得的數(shù)量相對(duì)較少，可能是因?yàn)樗〔课粌H為幼蟲中腸，而頭、外表皮、脂肪體、馬氏管和觸角等部位也存在與此類相關(guān)的高表達(dá)基因。通過將消化酶和解毒酶分別與鱗翅目其他昆蟲同源蛋白氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)梨小食心蟲消化酶和大豆食心蟲、蘋淡褐卷蛾、煙草天蛾和阿波羅絹蝶的同源蛋白親緣關(guān)系較近(圖3-5)，解毒酶和蘋果蠹蛾、茶小卷葉蛾、小菜蛾、二化螟的同源蛋白親緣關(guān)系較近(圖6-8)。由于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)需要和NCBI基因數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nih.gov)中參考序列比對(duì)，雖然煙草天蛾、阿波羅絹蝶、小菜蛾和二化螟雖然都屬鱗翅目，但分別屬于天蛾科、絹蝶科、菜蛾科和螟蛾科，可能由于國內(nèi)外對(duì)煙草天蛾、阿波羅絹蝶、小菜蛾和二化螟的研究較多，NCBI數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)較為豐富，所以梨小食心蟲和它們親緣關(guān)系較近。消化酶與同源分支聚類較為分散，可能因?yàn)槔ハx的消化過程較為復(fù)雜，消化酶基因?yàn)橐粋€(gè)龐大的家族，本研究獲得的基因可能屬于不同的家族成員。GSTs和CYP450s與同源分支聚類較為聚中，可能因?yàn)镚STs和CYP450s本就屬于重要的解毒酶，本研究篩選的是高表達(dá)基因，所以GSTs和CYP450s聚類較為集中。

基于對(duì)梨小食心蟲GO功能分類和KEGG代謝通路的分析，本研究篩選出高表達(dá)的解毒酶和消化酶基因，并對(duì)各類代表性基因在不同齡期進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)，消化酶基因表達(dá)量變化趨勢(shì)和趙愛平等(2016)對(duì)胰蛋白酶基因的研究結(jié)果相同，表達(dá)量差異顯著，依次為4齡>3齡>2齡>5齡(圖9)。趙愛平等(2016)對(duì)梨小食心蟲幼蟲中腸蛋白酶活性進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)酶活性變化趨勢(shì)和胰蛋白酶基因表達(dá)趨勢(shì)一致。美國白蛾氨肽酶基因在各齡期表達(dá)量變化趨勢(shì)(Zhangetal., 2017)和本研究結(jié)果一致。家蠶羧肽酶部分基因在5齡幼蟲中腸中高表達(dá)，大螟和二化螟的氨肽酶基因在3齡幼蟲中腸中高表達(dá)(王興云等, 2012; 朱玉蘋等, 2016; Wangetal., 2017; 展恩玲, 2018)。本研究發(fā)現(xiàn)梨小食心蟲部分氨肽酶基因在2齡幼蟲中腸中高表達(dá)，可能是昆蟲物種不同而導(dǎo)致的差異。本研究中解毒酶基因在各幼蟲齡期的表達(dá)量變化趨勢(shì)依次為4齡>3齡>5齡>2齡(圖9)。白琪等(2018)研究發(fā)現(xiàn)二化螟兩種CYP450基因在幼蟲中隨齡期變化的表達(dá)量同樣是先增長后下降的趨勢(shì)；任娜娜等(2015)發(fā)現(xiàn)在小菜蛾4齡幼蟲中羧酸酯酶基因的表達(dá)量最高，顯著高于其他齡期的；劉月慶(2017)發(fā)現(xiàn)粘蟲各齡期幼蟲的CYP450基因表達(dá)量差異顯著，5齡和6齡時(shí)達(dá)到最大值。本研究結(jié)果與上述研究中解毒酶基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)一致。

本研究通過GO和KEGG數(shù)據(jù)庫成功篩選和驗(yàn)證部分高表達(dá)消化酶和解毒酶基因，研究結(jié)果為鱗翅目其他近緣物種昆蟲的腸道轉(zhuǎn)錄組的研究提供了重要的數(shù)據(jù)信息，對(duì)鱗翅目卷蛾科非模式昆蟲的研究有重要的推動(dòng)意義，同時(shí)為研究以腸道為靶標(biāo)的新型農(nóng)藥和轉(zhuǎn)基因作物提供了重要的理論參考依據(jù)。但要明確消化酶和解毒酶基因的具體功能，還需后續(xù)深入研究。