農(nóng)作物遺傳育種中RAPD 技術(shù)的應(yīng)用分析

黎永丹

（貴州醫(yī)科大學(xué)神奇民族醫(yī)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550004）

農(nóng)作物育種是放大其基因優(yōu)勢(shì)，改良作物生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，保質(zhì)增收，為我國農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展賦能的重要科研項(xiàng)目。隨著我國“菜籃子”工程的持續(xù)推進(jìn)，相關(guān)研究人員應(yīng)合理應(yīng)用RAPD 技術(shù)，充分發(fā)揮其在保護(hù)農(nóng)作物遺傳多樣性、純度鑒定以及標(biāo)記育種中的優(yōu)勢(shì)，保證各類農(nóng)作物品種與資源確定的便捷性和科學(xué)性，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供更高質(zhì)量的育種服務(wù)，更好地保證農(nóng)作物持續(xù)供應(yīng)，解決在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中存在的育種問題。

1 RAPD 技術(shù)的原理與優(yōu)劣勢(shì)

1.1 原理

RAPD 本質(zhì)上是一種全新并切實(shí)有效的遺傳標(biāo)記，其應(yīng)用原理是通過對(duì)于一系列堿基序列存在不同的隨機(jī)引物針對(duì)基因組DNA 展開PRC 擴(kuò)增，然后利用凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物DNA 片段所具有的多態(tài)性進(jìn)行分析，在其中存在的擴(kuò)增片段分別表示基因組上的各個(gè)位點(diǎn)，其所展現(xiàn)出的多態(tài)性能充分展現(xiàn)出相應(yīng)區(qū)域DNA 所具有的多態(tài)性。RADP 所使用的DAN 序列整體呈現(xiàn)出一定的差異性。在基因組DAN 上，不同的特定引物都包含著相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，若基因組在上述區(qū)域產(chǎn)生DNA 片段插入或者是缺失等現(xiàn)象，便有可能會(huì)導(dǎo)致其特定結(jié)合位點(diǎn)的分布出現(xiàn)變化。在此過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物在大小及數(shù)量等方面均會(huì)隨之出現(xiàn)變化。工作人員進(jìn)行PRC 檢測(cè)便能完成對(duì)基因組DNA 多態(tài)性的合理檢測(cè)工作。對(duì)于單一引物來說，僅能實(shí)現(xiàn)對(duì)于基因組特定區(qū)域DNA 多態(tài)性的檢測(cè)，通過一系列引物則能夠使得檢測(cè)區(qū)域逐漸實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)基因組的全方位覆蓋?；诖耍茖W(xué)使用RAPD 技術(shù)能幫助工作人員全方位開展對(duì)于基因組DNA 的多態(tài)性檢測(cè)工作，還能將其作為依據(jù)建立起相應(yīng)的DNA 指紋圖譜。

1.2 優(yōu)劣勢(shì)

其一，優(yōu)勢(shì)。引物自身不存在種屬特異性，采用一套隨機(jī)引物能有效應(yīng)用在不同作物基因組的分析。同時(shí)，合理使用RAPD 構(gòu)建基因圖譜不會(huì)涉及克隆問題，其在實(shí)際應(yīng)用過程中能展現(xiàn)出更加簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，并且分析工作還可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，不會(huì)產(chǎn)生過于繁雜的程序，在應(yīng)用時(shí)也不會(huì)產(chǎn)生過大的DNA 用量，對(duì)于一次反應(yīng)來說僅需要10～50 ng 模板。

其二，劣勢(shì)。RAPD 屬于一種顯性標(biāo)記，無法有效區(qū)分純合子以及雜合子，所以在試驗(yàn)過程中往往呈現(xiàn)出相對(duì)較差的重復(fù)性以及穩(wěn)定性。除此以外，該技術(shù)還面臨共遷徙問題，僅能夠分開長(zhǎng)度存在差異性的DNA 片段，但對(duì)長(zhǎng)度相同但堿基序列各不相同的片段難以達(dá)到預(yù)期效果。工作人員在正式應(yīng)用該技術(shù)時(shí)，需要在充分發(fā)揮出其應(yīng)用優(yōu)勢(shì)的同時(shí)盡可能避免其劣勢(shì)[1]。

2 RAPD 技術(shù)的改進(jìn)

2.1 改進(jìn)擴(kuò)增程序

改進(jìn)擴(kuò)增程序是RAPD 分子標(biāo)記方法改進(jìn)的重要組成部分。模板DNA 處在94 ℃變性解鏈—36 ℃使得引物和模板退火—72 ℃擴(kuò)增，還要經(jīng)歷至少45 圈的循環(huán)，通過應(yīng)用相關(guān)物質(zhì)實(shí)現(xiàn)對(duì)于產(chǎn)物的染色，并采用紫外光對(duì)其展開檢測(cè)工作，該程序往往要花費(fèi)4 h 以上，若處理樣品較多，便需要擴(kuò)大在PRC 擴(kuò)增方面所投入的時(shí)間。

完成優(yōu)化改進(jìn)的擴(kuò)增程序，94 ℃1 min 的變性時(shí)間縮短為10 s，經(jīng)驗(yàn)證，這一時(shí)間長(zhǎng)度能夠基本上滿足RAPD 反應(yīng)中模板解鏈的需求。與此同時(shí)，短時(shí)間變性還可以獲取更加具有豐富性以及清晰性的擴(kuò)增電泳條帶圖譜。這主要是因?yàn)樵?4 ℃環(huán)境中，Taq 酶在一段時(shí)間之后依然能夠保存一定的活性，但從實(shí)際情況來看，其生命活性的實(shí)際跨度始終存在局限性，當(dāng)其反復(fù)經(jīng)歷較長(zhǎng)時(shí)間的變性之后，最終勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致催化活性降低，所以縮短原有的變性時(shí)間能夠在一定程度上強(qiáng)化其催化活性，可以為PCR 反應(yīng)創(chuàng)造良好的條件[2]。

同時(shí)，工作人員還可以將復(fù)性時(shí)間維持在30 s 左右。相關(guān)研究結(jié)果顯示，30 s 的退火溫度能夠充分同RAPD 反應(yīng)過程中引物同模板之間的配對(duì)結(jié)合相適應(yīng)，并且不會(huì)對(duì)最終的擴(kuò)增效果造成負(fù)面影響。對(duì)于電泳條帶圖譜形式來說，擴(kuò)增時(shí)間這一參數(shù)對(duì)于其影響較大，結(jié)合相關(guān)研究可知，其延伸在實(shí)踐方面的長(zhǎng)短同PCR 反應(yīng)中的最大擴(kuò)增判斷大小之間存在一定的關(guān)系。若延伸時(shí)間能夠維持在5～10 s，便呈線性關(guān)系。延伸時(shí)間為5 s 足夠使其擴(kuò)增0.6 kb 大小的片段，而當(dāng)其時(shí)間延伸到60 s 之后便能夠出現(xiàn)3 kb 的擴(kuò)增片段。在充分考慮節(jié)省時(shí)間的基礎(chǔ)上還應(yīng)當(dāng)確保其在EB 染色之后能夠出現(xiàn)方便進(jìn)行熒光亮度較高的條帶，擴(kuò)增時(shí)間隨機(jī)確定，最終證明其效果良好。循環(huán)次數(shù)的多少對(duì)于擴(kuò)增程度有一定影響，但經(jīng)過試驗(yàn)證明，循環(huán)35 圈和45 圈相比，在最終的試驗(yàn)結(jié)果上并不存在突出的差異性。在完成改進(jìn)工作之后的擴(kuò)增程序之后，一次RAPD 反應(yīng)的時(shí)間大概要經(jīng)歷2 h，所以能夠節(jié)省2 h，從絕大部分引物擴(kuò)增結(jié)果來看，可以在極大程度上提升電泳條帶檢出效果。

2.2 提高穩(wěn)定性

為了有效提升試驗(yàn)過程中RAPD 技術(shù)應(yīng)用的穩(wěn)定性，相關(guān)工作人員需要加強(qiáng)對(duì)于模板的控制，要合理把控模板DNA 本身所具有的純度。從目前的實(shí)際情況來看，PCR 技術(shù)本身作為一種重要的DNA 擴(kuò)增方法，有相對(duì)較高的敏感性，一般來說，在常規(guī)PCR 反應(yīng)中會(huì)將模板控制在102～105 拷貝的靶序列。

通常情況下，在1 ng 的大腸桿菌DNA 中的拷貝數(shù)總共包含3×105個(gè)靶分子，所以能夠得出在模板中包含小量的外源污染，其對(duì)于最終RAPD 的試驗(yàn)結(jié)果有著較大的影響。因此，在正式開展試驗(yàn)的過程中需要保障所選用的DNA 抽提方法效率較高，能真正實(shí)現(xiàn)對(duì)模板純度的合理控制，為RAPD 反應(yīng)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。PCR 擴(kuò)增儀器的使用同樣會(huì)對(duì)試驗(yàn)最終結(jié)果造成一定影響，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行染色，能夠在原有基礎(chǔ)上促進(jìn)RAPD 自身分辨率以及靈敏度的進(jìn)一步提升，并且對(duì)于保障RAPD 技術(shù)應(yīng)用的實(shí)效性以及穩(wěn)定性有重要意義[3]。

3 RAPD 技術(shù)在農(nóng)作物遺傳育種中的應(yīng)用——以番茄作物為例

3.1 鑒定品種純度

現(xiàn)如今鑒定農(nóng)作物種子純度經(jīng)常會(huì)應(yīng)用RAPD 技術(shù)，應(yīng)用該技術(shù)比傳統(tǒng)的化學(xué)法以及形態(tài)學(xué)等具有一定的特殊性。一是植物組織不論處在哪一個(gè)發(fā)育時(shí)期，都能夠?qū)ζ溥M(jìn)行分析。二是應(yīng)用該技術(shù)不僅能明確各個(gè)品種之間遺傳因子的差異，還可以充分展現(xiàn)出母體細(xì)胞質(zhì)非孟德爾遺傳因子影響。三是能夠直接針對(duì)基因核苷酸組成展開相應(yīng)的探測(cè)工作，無論其DNA 序列是否存在編碼，都能利用探針展現(xiàn)，并且整體具有較高的準(zhǔn)確性以及靈敏性。四是分離的DNA 樣品需要在特定的時(shí)間范圍內(nèi)對(duì)其開展長(zhǎng)時(shí)間的保存工作，此舉能夠?yàn)樽匪菪砸约爸俨眯澡b定等工作的開展提供支持。除此以外，相關(guān)工作人員可以結(jié)合現(xiàn)有條件制備大量DNA，為后續(xù)長(zhǎng)期應(yīng)用提供支持。針對(duì)普通番茄而言，其本身屬于一種自花授粉植物，在實(shí)際雜交育種階段常會(huì)出現(xiàn)母本自交的現(xiàn)象，進(jìn)而出現(xiàn)假雜種的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象是工作人員在控制種子純度過程中需要著重解決的問題。應(yīng)用RAPD 技術(shù)主要是建立RAPD 擴(kuò)增產(chǎn)物圖譜，然后再鑒定品種的純度以及真實(shí)性，在實(shí)施階段能有效減少在時(shí)間以及人力成本方面的過度消耗，并且不會(huì)產(chǎn)生過多的樣品需求，能夠在任何發(fā)育期都實(shí)現(xiàn)應(yīng)用。相關(guān)研究人員在試驗(yàn)中選取了3 個(gè)番茄品種的F1 雜交種展開了相應(yīng)的分析工作，對(duì)各個(gè)雜種的DNA 進(jìn)行了RAPD 分析，在多個(gè)隨機(jī)引物中合理篩選兩個(gè)引物，以便于有效區(qū)分母本以及雜種一代，最終結(jié)果表明，可以在雜種鑒定方面使用RAPD 技術(shù)。

相關(guān)研究人員通過應(yīng)用RAPD 技術(shù)，對(duì)普遍種植在我國東北地區(qū)的兩個(gè)番茄雜種展開了純度鑒定工作，從100 個(gè)引物當(dāng)中尋找5 個(gè)引物進(jìn)行純度鑒定，應(yīng)用該方法具有一定的簡(jiǎn)單性和適用性。部分人員在試驗(yàn)中采用番茄F1 代雜交品種的干種子作為材料，使用RAPD 技術(shù)初步實(shí)現(xiàn)對(duì)于種子自身純度的鑒定。其所選用的RAPD 引物是在眾多個(gè)隨機(jī)引物中所篩選出的BA1072，在正式使用該方法的過程中不用開展田間種植便能夠鑒定番茄雜種的純度，并確保其具有較高的純度。研究人員可以基于RAPD 技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)番茄體細(xì)胞無性系變異的有效鑒定，在未經(jīng)篩選的葉片中提取DNA，然后構(gòu)建起可以同番茄RAFD 分析相適應(yīng)的PCR 條件，可以立足于多個(gè)隨機(jī)引物，在其中尋找能夠進(jìn)行番茄品種體細(xì)胞無性系變異的引物。合理使用該方法對(duì)體細(xì)胞無性編譯鑒定，能夠切實(shí)提升其快速性以及簡(jiǎn)單性；同時(shí)，因?yàn)楸旧聿⒉簧婕拜^大的DNA 用量，所以不會(huì)對(duì)后續(xù)被檢植株的正常生長(zhǎng)造成影響，可極大程度地提升選擇效率。

3.2 種質(zhì)資源研究

番茄野生種具有良好的抗病蟲能力，科學(xué)使用DNA 分子標(biāo)記法合理進(jìn)行番茄屬種質(zhì)資源研究，能夠高效應(yīng)用在品種資源保存以及鑒定等相關(guān)工作上。目前，多樣化的分子標(biāo)記方法已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了在品種純度分析、番茄品種鑒定以及種植分析等多方面的廣泛應(yīng)用，具體包括SSR 標(biāo)記、RFLP 標(biāo)記及RAPD 標(biāo)記等。

國外專家使用RAPD 技術(shù)對(duì)秘魯和智利等多個(gè)番茄種展開了聚類分析工作，結(jié)果表明，PC 同EC 所具有的遺傳背景存在相對(duì)較明顯的差異，在EC 中的紅果以及綠果劃分基本上能夠符合RFLP 標(biāo)記的分析結(jié)果。不同材料的番茄也有不同的遺傳背景，這一結(jié)果也符合現(xiàn)階段的研究成果，RFLP 和RAPD 分類結(jié)果基本上同番茄形態(tài)學(xué)分類的有關(guān)研究成果相一致。我國研究人員針對(duì)番茄屬的43 份材料展開了相應(yīng)的RAPD分析工作，通過聚類分析能夠使番茄本身劃分成4 個(gè)類群。在綜合分析基因雜合度以及遺傳封堵等指數(shù)的基礎(chǔ)上，能夠明確相對(duì)于普通番茄類群野生類群有更為突出的遺傳多樣性，這也在一定程度上表明野生類群中富含著更加豐富且能夠在番茄育種中實(shí)現(xiàn)高效應(yīng)用的遺傳資源[4]。

相關(guān)研究人員應(yīng)用RAPD 技術(shù)對(duì)部分番茄品種展開了比較和研究工作，對(duì)各個(gè)品種之間所存在的遺傳差異進(jìn)行詳細(xì)分析，合理采用41 個(gè)RAPD 引物對(duì)大量品種進(jìn)行分析，最終得出了98 個(gè)多態(tài)性RAPD 標(biāo)記。從實(shí)際情況來看，智利、秘魯以及厄瓜多爾等地區(qū)的品種在差異性方面要遠(yuǎn)比其他來源的品種大，對(duì)于普通番茄來說，品種的差異性大多是受到所在地理區(qū)域不同的影響。研究人員通過觀察種質(zhì)庫中的29 份番茄材料，明確了其中有19 對(duì)以上的變異，其對(duì)于不同的基因重組來說存在著較大的潛力，可以進(jìn)一步展現(xiàn)出種植資源庫本身具有保存遺傳多樣性的能力。

3.3 基因分子標(biāo)記

當(dāng)前，RAPD 技術(shù)多應(yīng)用在番茄基因分子標(biāo)記中，根據(jù)抗病基因以及性狀基因進(jìn)行標(biāo)記工作，可有效對(duì)育種以及定位起到輔助作用。在番茄生長(zhǎng)過程中，煙草花葉病毒是主要病原之一，經(jīng)常開展抗TMV 基因標(biāo)記工作，根據(jù)抗病基因的具體位置，可使重組率下降。在近等基因的組建下，包含Tm-2 產(chǎn)生的代群體，結(jié)合多個(gè)隨機(jī)引物對(duì)Tm-2 基因標(biāo)記進(jìn)行挑選，大約19%的近等基因產(chǎn)生多態(tài)性，并取其中引物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)69%的引物產(chǎn)生多態(tài)性與nv 基因分離現(xiàn)象。

在RAPD 技術(shù)的研究下，對(duì)抗TMV 基因座展開深入分析，并建立不同標(biāo)記，形成完整的單拷貝序列。同時(shí)，在RAPD 技術(shù)的應(yīng)用過程中，可有效獲取與番茄抗TMV 基因的分子標(biāo)記。在分離群體內(nèi)運(yùn)用相關(guān)分析方法可對(duì)番茄分子標(biāo)記進(jìn)行探究，由此可獲得連鎖分子標(biāo)記，遺傳距離為7.067 cm。在感病以及抗病的基因中隨機(jī)挑選引物。其中，OPK-6 能夠擴(kuò)增出特異片段，將該片段進(jìn)行再次組合能夠形成PCR 引物。利用該引物可在兩個(gè)品系中繼續(xù)擴(kuò)增，以形成相應(yīng)片段，將小片段與RAPD 片段雜交，并對(duì)不同品系內(nèi)的片段回收測(cè)序，可充分發(fā)現(xiàn)酶切位點(diǎn)，將片段切為不同片段，由此獲取SCAR 標(biāo)記，將此標(biāo)記運(yùn)用到群體分析中，確保分析結(jié)構(gòu)與實(shí)際檢測(cè)結(jié)果保持相同。

同時(shí)，利用抗病以及感病系列進(jìn)行群體檢驗(yàn)，標(biāo)記番茄黃化卷葉病毒的QTL 基因，抗病中帶有細(xì)葉抗番茄黃化卷葉病毒基因。在此系列中，挑選出抗性較強(qiáng)的以及感病最強(qiáng)的F4 系，將其合理組成基因池，對(duì)不同基因池以多個(gè)引物進(jìn)行分析。其中，42%左右的引物可出現(xiàn)多態(tài)片段，出現(xiàn)該情況的主要原因是親本遺傳差距相對(duì)較大，其由不同野生番茄所摻雜。通過檢驗(yàn)多態(tài)引物，可得出相應(yīng)引物與抗病性保持聯(lián)系，其他引物則呈現(xiàn)隨機(jī)分布的狀態(tài)。在對(duì)RAPD 標(biāo)記分析下，充分表明其處于相同的連鎖群體內(nèi)，其在抗番茄黃化卷葉病毒中所占比例大約為27.7%。在普通番茄以及潘那利翻群體下，充分運(yùn)用BSA 方法合理挑選隨機(jī)引物，從而得到相應(yīng)的多態(tài)RAPD 引物[5-6]。

4 結(jié)論

通過應(yīng)用RAPD 技術(shù)可以更好地豐富、保存和改良農(nóng)作物的遺傳基因。在RAPD 技術(shù)的未來發(fā)展中，應(yīng)進(jìn)一步結(jié)合克隆技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等生物科學(xué)技術(shù)，為農(nóng)作物育種提供更完善、科學(xué)、高效的育種服務(wù)，保證廣大農(nóng)民獲得更多的經(jīng)濟(jì)效益，確保我國農(nóng)業(yè)朝著智慧轉(zhuǎn)和高質(zhì)量方向發(fā)展。同時(shí)，應(yīng)加深在農(nóng)作物種質(zhì)資源上的研究，發(fā)揮RAPD 技術(shù)的育種優(yōu)勢(shì)，以此保證我國的種質(zhì)資源管理工作的規(guī)范化和科學(xué)化發(fā)展，提高種質(zhì)分類的準(zhǔn)確性以及效率水平。