皇藏峪國(guó)家森林公園及其周邊可培養(yǎng)酵母資源的調(diào)查

孫 勇, 張藝嘉, 崔嫻秋, 蔣繼宏

(江蘇師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 徐州 221116)

森林資源的良好發(fā)展對(duì)微生物生態(tài)的維持有重要作用,同時(shí),良好的微生態(tài)環(huán)境對(duì)樹木的生長(zhǎng)也有反哺作用.皇藏峪國(guó)家森林公園是中國(guó)最大的古樹群落景區(qū)之一,有同緯度保存較完好的落葉闊葉林帶,以青檀樹、側(cè)柏、刺槐、橡樹、泡桐、櫟樹、瓜子黃楊、銀杏、南京椴、五角楓、黃連木、青桐、山杏、酸棗、豆梨、櫻桃、石榴等為主.周邊其他山林也較多,如龍崗山、塔山和龍脊山等山上植被繁茂.這些地區(qū)人員流動(dòng)較少,工業(yè)欠發(fā)達(dá),人類活動(dòng)對(duì)其生態(tài)環(huán)境破壞極少.皇藏峪地區(qū)呈現(xiàn)喀斯特地貌特征,屬于季風(fēng)氣候,其環(huán)境濕潤(rùn),四季變化明顯,果樹叢多,是調(diào)查野生酵母菌等微生物資源的良好場(chǎng)所.

酵母菌是十分重要的單細(xì)胞真核微生物,與人類的生活、生產(chǎn)密切相關(guān),在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品防腐保鮮、工業(yè)發(fā)酵、化工原材料制備和醫(yī)藥等方面有著廣泛的應(yīng)用,例如：拮抗酵母菌可用于防治果蔬采摘后的病害,延長(zhǎng)果蔬保鮮時(shí)間[1-4];布拉氏酵母菌對(duì)黃疸患兒有明顯療效[5];在人和動(dòng)物的腸道中,酵母菌可分泌抑菌性物質(zhì)和誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗性,發(fā)揮對(duì)致病菌和條件致病菌的拮抗作用,促進(jìn)優(yōu)勢(shì)種群生長(zhǎng),調(diào)整微生態(tài)平衡[6];酵母菌也可用于水處理,且處理后的剩余污泥中富含蛋白質(zhì)和多種氨基酸等[7-10].

近年來,我們多次在皇藏峪國(guó)家森林公園及其周邊地區(qū)采集植物樣品,包括野桃樹、山杏、橡樹、側(cè)柏、豆梨和石榴等,作為分離酵母菌的材料.基于酵母單細(xì)胞特性和細(xì)胞大小范圍,對(duì)傳統(tǒng)的酵母菌分離方法進(jìn)行了改進(jìn),分離的酵母菌株通過26S rDNA D1/D2區(qū)序列比對(duì)進(jìn)行初步鑒定,對(duì)不同樹種可培養(yǎng)酵母菌種類進(jìn)行了分析,為皇藏峪國(guó)家森林公園原生態(tài)環(huán)境質(zhì)量以及酵母多樣性研究提供理論參考,為酵母菌的開發(fā)應(yīng)用提供資源保障.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器及設(shè)備超凈工作臺(tái)(蘇州凈化);Mupid-exu電泳儀(日本Mupid);Gel Doc RF凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad);TP600型基因擴(kuò)增儀(日本Takara);D3024臺(tái)式高速微量離心機(jī)(美國(guó)Scilogex);DHP-9025電熱恒溫箱(上海坤誠(chéng));LDZX-50KBS高壓滅菌鍋器(上海申安).

1.1.2 培養(yǎng)基YPD液體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,蛋白胨20 g,酵母膏10 g,蒸餾水1 L.PDA培養(yǎng)基:土豆200 g,蔗糖20 g,蒸餾水1 L,瓊脂粉20 g.

1.2 方法

1.2.1 樣品采集采樣點(diǎn)位于安徽省宿州市北部的皇藏峪國(guó)家森林公園及其周邊的龍崗山、塔山和龍脊山等山林,見圖1(地圖來自https://ditu.cncn.com/huaibei).植物樣品為桃、杏、石榴、豆梨掉落的腐爛果實(shí)，麻櫟掉落的腐爛堅(jiān)果和側(cè)柏的果實(shí)等有機(jī)質(zhì)豐富的材料,同一采樣點(diǎn)至少采集3個(gè)樣品,樹種復(fù)雜的采樣點(diǎn)相應(yīng)增加樣品數(shù)量.采集樣品時(shí)佩戴手套,采集后的樣品置于信封袋中.為防止交叉,每種樣品一個(gè)信封袋,按采樣點(diǎn)編號(hào),記錄樣品名稱、海拔高度、經(jīng)緯度等信息,方便后續(xù)在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行酵母菌株分離.

圖1 樣品采集點(diǎn)分布圖Fig.1 Distribution map of sample collection points

1.2.2 酵母菌的分離和純化參照并改進(jìn)文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行酵母菌株的分離和純化:根據(jù)樣品數(shù)量準(zhǔn)備無菌的50 mL離心管備用,每個(gè)離心管中加入含氯霉素(終濃度為100 μg/mL)的10 mL YPD液體培養(yǎng)基.將樣品分別切成邊長(zhǎng)約2 mm的方塊,各取0.5 g放入各自的離心管中,150 r/min搖床上震蕩培養(yǎng)12 h,培養(yǎng)溫度25 ℃.取出擴(kuò)大培養(yǎng)的樣品,用無菌注射器吸取5 mL發(fā)酵液,先用10 μm孔徑的無菌濾膜過濾器過濾培養(yǎng)液,去除絲狀真菌和雜質(zhì)(殘留在濾膜上),再用3 μm孔徑的無菌濾膜過濾濾液(酵母大部分留在濾膜上)，后棄掉濾液,用無菌水反復(fù)沖洗濾膜以減少細(xì)菌數(shù)量.取下濾膜置于無菌平板上,用無菌水再次反復(fù)沖洗濾膜,沖洗液用1.5 mL的離心管收集,顯微鏡下觀察和估算酵母菌數(shù)量,然后10倍梯度稀釋2次.從不同梯度的稀釋液中各取100 μL,按先稀后濃的順序涂布于倒好的PDA平板培養(yǎng)基上,置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天查看1次菌落的生長(zhǎng)狀態(tài),連續(xù)查看2 d.菌落長(zhǎng)出后,用無菌槍頭蘸取需要進(jìn)一步培養(yǎng)的菌落,采用四區(qū)劃線法在PDA平板培養(yǎng)基上進(jìn)一步純化.純化得到的菌株接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中,在28 ℃搖床上培養(yǎng)3 d后,用菌液與質(zhì)量濃度為40%的甘油按體積比1∶1混合后冷凍保藏(-80 ℃).鑒定后的菌株,交由保藏中心用液氮和冷凍干燥等方法進(jìn)行永久或長(zhǎng)效保藏.

1.2.3 酵母菌株DNA的提取菌株純化后,挑取芝麻粒大小的菌體,置于1.5 mL的無菌離心管中,-20 ℃冰凍2 h后，立即加入質(zhì)量濃度為2%的CTAB 200 μL,再加入1/2體積的石英砂，離心管置于65 ℃的水浴鍋中溫浴1.5 h，加入PCI混合溶液(VTris-飽和酚∶V氯仿∶V異戊醇=25∶24∶1),劇烈震蕩1 min后,10 000 r/min離心10 min.吸取100 μL上清液移至新的離心管中,加入100 μL異丙醇,混勻,-20 ℃下孵育2 h,沉淀DNA.10 000 r/min離心10 min后,去上清液,沉淀用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇洗滌后,置于超凈工作臺(tái)上自然干燥,使用30 μL去離子水溶解提取到的DNA,置于-4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹12].

1.2.4 酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)序列擴(kuò)增及測(cè)序選擇酵母菌通用擴(kuò)增引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)/NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)進(jìn)行酵母菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)序列擴(kuò)增[13].

PCR的反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性20 s,52 ℃退火20 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)35次;72 ℃延伸10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,制備質(zhì)量濃度為1%的瓊脂糖凝膠,每孔上樣量為5 μL,150 V電壓下電泳20 min后EB染色,在UV凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄,好的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一且清晰,大小約為600 bp,剩余的擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生工生物技術(shù)公司測(cè)序.測(cè)序結(jié)果在Chromas軟件中分析數(shù)據(jù)的可靠性,用Editseq軟件打開序列數(shù)據(jù),將序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì),對(duì)比結(jié)果及序列合并保存.

1.2.5 菌株系統(tǒng)樹的構(gòu)建用軟件MEGA 6.0將每一個(gè)樣品分離的酵母菌株基于26S rDNA D1/D2區(qū)序列進(jìn)行聚類，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，在發(fā)育樹中顯示菌株分離鑒定結(jié)果和菌株重復(fù)數(shù)量.

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母的分離效果

與傳統(tǒng)分離方法(圖2A、B)相比，改進(jìn)的酵母菌分離方法增加了2次過濾步驟,處理后的平板培養(yǎng)狀態(tài)如圖2C、D所示.酵母菌的細(xì)胞濃度可以隨機(jī)調(diào)節(jié),涂布的平板上酵母菌落生長(zhǎng)密集,數(shù)量和種類較多,細(xì)菌菌落占比極少(酵母菌落和細(xì)菌菌落可通過質(zhì)地、透光度和細(xì)胞大小分辨),絲狀真菌極少或沒有,即除單細(xì)胞的酵母菌外,擴(kuò)張很快的絲狀雜菌對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)和后期純化影響極小.可見，改進(jìn)的分離方法排除了細(xì)菌和絲狀真菌對(duì)酵母菌的干擾,有利于延長(zhǎng)分離平板的培養(yǎng)時(shí)間及鑒別、挑選酵母菌株,提高獲得酵母純菌株的幾率.

A.不過濾分離(原液); B.不過濾分離(稀釋10倍); C.2次過濾(原液); D.2次過濾(稀釋10倍).圖2 分離平板上的菌落情況Fig.2 Colonies on the separation plate

2.2 同一采樣點(diǎn)可培養(yǎng)酵母種群分析

采樣點(diǎn)2以北緯117°4′10″,東經(jīng)34°1′47″為中心,面積約0.2 km2,地形為兩面山坡圍成的山峪,從北向南海拔逐漸升高,海拔高度為60～300 m;主要以側(cè)柏林為主,點(diǎn)綴幾片小桃林和零星的杏樹、洋槐等.采集側(cè)柏成熟球果、腐爛桃果和杏果作為酵母菌株的分離材料,分離后獲得的酵母菌株進(jìn)一步純化保存.以這些菌株的DNA為模板,進(jìn)行26S rDNA D1/D2區(qū)序列擴(kuò)增獲得PCR產(chǎn)物,測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上比對(duì),所有樣品的鑒定結(jié)果見系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3—5).

每行依次為菌株號(hào)、種名、最高相似度、重復(fù)鑒定菌株數(shù).疑似新種菌株號(hào)加粗.下同.圖3 桃果分離獲得的酵母菌株基于26S rDNA D1/D2區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 26S rDNA D1/D2 domain sequences of the yeast strains isolated from peach fruit

圖4 杏果分離獲得的酵母菌株基于26S rDNA D1/D2區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 26S rDNA D1/D2 domain sequences of the yeast strains isolated from apricot fruit

圖5 側(cè)柏樣品分離獲得的酵母菌株基于26S rDNA D1/D2區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on 26S rDNA D1/D2 domain sequences of the yeast strains isolated from platycladus orientalis

桃果樣品2個(gè)(編號(hào)A、T)，共鑒定酵母菌株39株，20個(gè)種，分屬于Papiliotrema、Kwoniella、Meyerozyma、Wickerhamomyces、Rhodotorula等18個(gè)酵母屬，其中Papiliotremaflavescens和Kwoniellabestiolae菌株重復(fù)較多，2個(gè)分離樣品共有交叉重復(fù)的菌株19株，僅4個(gè)種，表明同一樹種重復(fù)分離是必要的；從桃果樣品獲得了5個(gè)潛在新種，分別為Anhui A25(Tremellasp.)，Anhui A6和Anhui T8(Vishniacozymasp.)，Anhui T17(Cystofilobasidiumsp.)，Anhui T6和Anhui A22(Colacogloeasp.)，Anhui A20(Hamamotoasp.)(圖3).

杏果樣品2個(gè)(編號(hào)B、X)，共鑒定酵母菌株24株，10個(gè)種，分屬于Papiliotrema、Kwoniella、Vishniacozyma、Filobasidium、Curvibasidium、Sporidiobolus、Colacogloea、Hanseniaspora、Wickerhamomyces9個(gè)酵母屬，其中Vishniacozymatephrensis、Kwoniellabestiolae和Filobasidiummagnum重復(fù)菌株較多，2個(gè)分離樣品共有交叉重復(fù)的菌株15株，屬于4個(gè)種；另外,發(fā)現(xiàn)3個(gè)潛在新種，其中2個(gè)新種在桃樹上也分離到.與在桃樹上分離的酵母菌種相同的為Papiliotremaflavescens、Kwoniellabestiolae、Colacogloeasp.和Vishniacozymasp. 4個(gè)菌種(圖4).

側(cè)柏球果樣品1個(gè)(編號(hào)S),共獲得酵母菌株33株,鑒定為16個(gè)種,分屬于Aureobasidium、Bullera、Curvibasidium、Vishniacozyma、Papiliotrema、Sporidiobolus、Rhodosporidiobolus、Tremella、Hannaella、Pseudotremella10個(gè)酵母屬,其中Aureobasidiumnamibiae和Curvibasidiumpallidicorallinum重復(fù)菌株較多;另外，獲得3個(gè)潛在新種(圖5).

該采樣點(diǎn)共分離鑒定了酵母菌株96株,歸屬于25個(gè)屬,36個(gè)種,7個(gè)種為潛在新菌種,新種獲得率較高.不同的樹種材料分離的酵母菌株中,優(yōu)勢(shì)菌種存在差異,36種酵母菌中,桃樹獨(dú)有的菌種12個(gè),杏樹獨(dú)有的5個(gè),側(cè)柏獨(dú)有的9個(gè),桃和杏有4個(gè)種相同,桃和側(cè)柏有4個(gè)種相同,杏和側(cè)柏有3個(gè)種相同,3種植物共有的有2個(gè)種(Papiliotremaflavescens和Vishniacozymasp.).這表明,即使是在同一區(qū)域,不同樹種上的酵母菌種類也存在較大差別.

2.3 皇藏峪國(guó)家森林公園及其周邊區(qū)域酵母菌種的初步調(diào)查

在皇藏峪國(guó)家森林公園內(nèi)以北緯117°4′10″、東經(jīng)34°1′47″為中心設(shè)置1個(gè)采樣點(diǎn)，在其周圍的龍崗山(北緯117°3′20″,東經(jīng)34°2′2″)、塔山(北緯116°59′50″,東經(jīng)33°55′41″)和龍脊山(北緯116°28′48″,東經(jīng)33°54′48″)等地設(shè)置6個(gè)采樣點(diǎn)(圖1).采集的樣品來自杏、豆梨、橡樹、桃、石榴等植物,分離獲得了562株酵母菌株,對(duì)其中的216株菌株進(jìn)行26S rDNA D1/D2區(qū)序列測(cè)序,在NCBI網(wǎng)站上比對(duì)，分類鑒定結(jié)果見表1.鑒定的216株酵母菌株歸屬于37個(gè)屬,68個(gè)種(子囊菌酵母25種,擔(dān)子菌酵母43種);潛在新種11個(gè),分屬于子囊菌的Metschnikowia屬和Wickerhamomyces屬,擔(dān)子菌的Cryptococcus屬、Tremella屬、Cystofilobasidium屬、Rhodotorula屬、Fibulobasidium屬、Vishniacozyma屬、Colacogloea屬和Hamamotoa屬,潛在新種占16.2%.

表1 皇藏峪國(guó)家森林公園及其周邊的酵母種類Tab.1 Yeast species isolated from Huangcangyu National Forest Park and its surroundings areas

3 討論

通常,分離酵母菌的方法包括樣品的處理、酵母富集培養(yǎng)、梯度稀釋后涂布分離、酵母的挑選和純化[11,14-15].富集培養(yǎng)主要利用的是培養(yǎng)基差異和加入抗生素來抑制酵母菌外的微生物生長(zhǎng),這種分離方法對(duì)細(xì)菌的抑制程度小,部分細(xì)菌具有抗藥性,會(huì)和酵母菌一起生長(zhǎng),影響酵母單菌落的生長(zhǎng)和后期的分離純化.絲狀真菌如沒有去除措施,其快速擴(kuò)展會(huì)導(dǎo)致酵母菌落還未表現(xiàn)出個(gè)體差異就被絲狀真菌覆蓋，影響后期酵母菌落的挑選和純化.本研究改進(jìn)的分離方法增加了2步過濾步驟：樣品富集培養(yǎng)時(shí),絲狀真菌的孢子已經(jīng)變成菌絲,通過10 μm濾膜去除,較好地解決了絲狀真菌的干擾;3 μm濾膜的過濾及多次沖洗可以去除大部分的細(xì)菌.值得注意的是,使用這種方法過濾時(shí)樣品要干凈,且不能過碎,否則不易過濾;濾液量少而稀才能發(fā)揮濾膜的選擇作用.

影響酵母菌種調(diào)查的因素很多,除同一區(qū)域不同樹種分離的酵母不同外,不同區(qū)域同一樹種分離的酵母菌種類也存在差異.培養(yǎng)法是獲取微生物資源、用于實(shí)際應(yīng)用的主要途徑,能部分反映取樣地區(qū)微生物的豐富度,經(jīng)過分離和培養(yǎng)過程,平板上獲得的菌株數(shù)量與實(shí)際情況會(huì)有較大差異,主要表現(xiàn)在分離中的富集培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)時(shí),不同的菌株生長(zhǎng)和分裂速度不一樣,導(dǎo)致分析結(jié)果與事實(shí)可能不一致;另外,挑取菌落用于鑒定時(shí),帶有一定的人為主觀因素,菌株重復(fù)或不全面與挑菌人員的知識(shí)儲(chǔ)備有很大關(guān)系.因此，培養(yǎng)法僅能調(diào)查到一個(gè)地區(qū)酵母菌的部分種類.我們僅對(duì)皇藏峪國(guó)家森林公園部分植物進(jìn)行了調(diào)查，從目前分離和鑒定的結(jié)果看,分離到37個(gè)屬，68個(gè)種及潛在新種11個(gè)，表明該地區(qū)酵母多樣性非常豐富,值得進(jìn)一步采樣分離,獲取菌種資源,從而為后續(xù)的酵母菌功能研究及酵母菌資源開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ).