基于網(wǎng)絡藥理學結(jié)合體外實驗探討黑種草治療糖尿病作用機制

溫望文，姚寶樂，朱曉娟，佟天天，白隆博，胡海波，3，劉 海，李林福，黃 浩，，3*

( 1.贛南醫(yī)學院 藥學院 國家中藥現(xiàn)代化工程技術研究中心-客家中醫(yī)藥資源研究分中心，江西 贛州 341000；2.澳門科技大學 中藥質(zhì)量研究國家重點實驗室，中國 澳門 999078；3.比利時荷語天主教魯汶大學 生物系，比利時 魯汶 3000)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一種以糖脂代謝異常為特征，由胰島素分泌或利用缺陷而引起的慢性代謝性疾病，臨床分型為1型糖尿病(Diabetes mellitus type 1，T1DM)和2型糖尿病(Diabetes mellitus type 2，T2DM)，是臨床常見病、多發(fā)病[1-2]。據(jù)2021年國際糖尿病聯(lián)盟(IDF Diabetes Atlas)報告顯示，全球約有5.37億成年人患有糖尿病，且每年患病人數(shù)仍在持續(xù)增加，預計至2045年，患病人數(shù)將達7.83億，2021年，全球糖尿病醫(yī)療支出費用高達9 600億美元[3]，給社會經(jīng)濟帶來了沉重負擔。糖尿病患者血糖、血脂長期異常會損傷心臟、腎臟、血管和神經(jīng)等多個組織器官，引發(fā)創(chuàng)面愈合障礙、大血管病變、視網(wǎng)膜病變、周圍神經(jīng)病變和心力衰竭等多種嚴重并發(fā)癥，具有極高的致死率、致殘率，嚴重威脅患者生命健康[4-6]。糖尿病致病機制復雜，受遺傳、心理和環(huán)境等多種因素影響[7]。目前，臨床治療DM的藥物主要有雙胍類(二甲雙胍)、磺脲類、α-葡萄糖苷酶抑制劑、噻唑烷二酮類等[8]，但上述藥物僅能控制DM病情發(fā)展，尚達不到根治疾病的效果，且長期使用易引起各種不良反應，如二甲雙胍、阿卡波糖、DPP-4抑制劑等，會引起胃腸道不適、肝腎損傷、身體消瘦等[9-10]，降低患者生活質(zhì)量，危及患者健康安全。DM為現(xiàn)代醫(yī)學病名，歸屬中醫(yī)學“消渴”范疇。臨床研究表明，中藥及中藥復方可有效治療DM，能有效控制患者血糖、血脂水平，改善糖尿病并發(fā)癥，療效顯著、安全性高，具有副作用少、作用溫和持久等特點，體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療的優(yōu)勢[11-14]。

黑種草(Nigellasativa)是毛茛科黑種草屬的一年生草本植物，常以種子入藥，味甘、辛，性溫[15]。黑種草富含揮發(fā)油、黃酮、皂苷、生物堿和不飽和脂肪酸等多種活性成分[16]，在地中海、中亞和中國新疆等地區(qū)有悠久的民族藥用歷史，被稱為“靈丹妙藥(Kalonji、A miracle herb)”，可治療哮喘、偏頭痛、癲癇和癱瘓等多種疾病[17-20]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黑種草有顯著的抗DM作用，能調(diào)節(jié)DM患者血糖水平、改善血脂代謝紊亂，抑制糖尿病并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展，可明顯提高患者生活質(zhì)量[21-22]。但黑種草化學成分繁多、治療機制復雜，目前，黑種草治療DM的藥效物質(zhì)基礎和藥理機制尚未明確，還有待進一步研究。

網(wǎng)絡藥理學基于系統(tǒng)生物學理論，通過構(gòu)建“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡，從分子水平研究藥效物質(zhì)基礎和藥理作用機制，突破了傳統(tǒng)“單成分、單靶點”的研究模式，具有系統(tǒng)性、整體性和動態(tài)性的特點，與中醫(yī)藥的整體思維和中醫(yī)辨證論治的整體觀思想一致[23-26]。分子對接是計算機輔助藥物設計和新藥開發(fā)的重要技術，通過研究受體蛋白活性位點與配體分子間相互作用，預測結(jié)合模式與親和力，可用于發(fā)現(xiàn)或優(yōu)化藥物先導化合物[27-28]?；诖?，本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法結(jié)合分子對接技術，篩選、驗證黑種草治療DM的主要活性成分，從分子水平闡明藥理作用機制，指導后續(xù)實驗研究，為黑種草治療DM的臨床應用與產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。

1 網(wǎng)絡藥理學

1.1 化學成分收集與有效成分篩選

通過中藥百科全書數(shù)據(jù)庫[29](The encyclopedia of traditional Chinese medicine，ETCM，http：//www.tcmip.cn/ETCM/)，結(jié)合文獻調(diào)研方法，整理匯總黑種草的化學成分信息，建立黑種草化學成分庫。利用PubChem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索收集的黑種草化學成分，獲取成分的結(jié)構(gòu)式并以SDF格式導出；對于PubChem數(shù)據(jù)庫中未收錄的成分，運用Chemdraw 16.0軟件繪制成分結(jié)構(gòu)圖并保存為SDF格式。將成分結(jié)構(gòu)的SDF數(shù)據(jù)導入SwissADME平臺[30](http：//www.swissadme.ch/)篩選有效成分。以藥代動力學參數(shù)(GI absorption)為“High”，類藥性參數(shù)(Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)至少滿足2個“Yes”為篩選標準[31]；另結(jié)合文獻將不符合篩選標準，但明確報道具有藥理活性且與研究主題相關的化合物仍列為候選的有效成分。

1.2 有效成分的作用靶標獲取與收集

利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺[32](Traditional Chinese medicine database and analysis platform，ETCM，https：//tcmsp-e.com/)和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫[33](http：//swisstargetprediction.ch/)，對有效成分的作用靶點進行預測，并結(jié)合通用蛋白資源數(shù)據(jù)庫(Universal protein resource，Uniprot，https：//www.uniprot.org/)，限定物種為“Human”，將TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取的蛋白靶點轉(zhuǎn)換為對應的基因名，基因名以官方名稱(Offical gene symbol)為標準。匯總基因靶點，刪除重復值并剔除無對應靶點的成分，獲得黑種草有效成分與基因靶點的有關信息。

1.3 DM疾病基因靶點獲取

為保證數(shù)據(jù)的準確性和完整性，在人類基因數(shù)據(jù)庫(The human genedatabase，GeneCards，https：//www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫[34](Online mendelian inheritance in man，OMIM，https：//www.omim.org/)和Uniprot數(shù)據(jù)庫中以關鍵詞“Diabetes mellitus”“Diabetes mellitus type 1”“Diabetes mellitus type 2”分別進行檢索，匯總結(jié)果并刪除重復的基因靶點，即為DM疾病基因靶點庫。

1.4 黑種草治療DM相關基因靶點的獲取及韋恩圖、蛋白互作圖繪制

將“1.2”項下有效成分的基因靶點與“1.3”項下DM疾病基因靶點相互映射，取二者交集即為黑種草治療DM的相關基因靶點。在Venny 2.1.0在線作圖工具平臺(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)導入黑種草有效成分的基因靶點及DM疾病基因靶點，獲得黑種草治療DM的基因靶點韋恩圖。在STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)中導入黑種草治療DM的相關基因靶點，蛋白種類設置為“Home sapiens”，靶點關聯(lián)的置信度設置為“High confidengce 0.700”，隱藏游離節(jié)點，下載靶點相互作用網(wǎng)絡關系的TSV數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.8.2軟件，繪制成蛋白互作網(wǎng)絡(Protein-protein interaction，PPI)，進行數(shù)據(jù)可視化處理，并使用CytoHubba插件的最大團中心度算法(Maximal clique centrality，MCC)篩選出網(wǎng)絡重要的樞紐基因[35]。

1.5 GO生物富集及KEGG信號通路富集分析

采用Metascape數(shù)據(jù)庫[36](http：//metascape.org/)對黑種草治療DM的相關基因靶點進行基因本體(Gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析，數(shù)據(jù)庫篩選參數(shù)PValue Cutoff設定為0.05。下載GO和KEGG通路富集數(shù)據(jù)，導入imageGP繪圖軟件，根據(jù)-LogP值選出GO生物功能的生物過程(Biological process，BP)、細胞組分(Cellular component，CC)、分子功能(Molecular function，MF)的前10條和KEGG通路前20條進行數(shù)據(jù)可視化分析。

1.6 有效成分-疾病靶點-信號通路網(wǎng)絡構(gòu)建

將“1.2”項下黑種草有效成分-基因靶點與“1.3”項獲取的DM疾病基因靶點進行匹配，保留有匹配結(jié)果的有效成分和基因靶點，刪除無匹配結(jié)果的數(shù)據(jù)，結(jié)合“1.5”項下富集的糖尿病相關信號通路，獲得有效成分-疾病靶點-信號通路數(shù)據(jù)庫。將數(shù)據(jù)庫信息導入Cytoscape 3.8.2軟件進行數(shù)據(jù)可視化處理，預測出黑種草治療DM的成分與疾病靶點、信號通路的網(wǎng)絡關系，并結(jié)合Cytoscape內(nèi)置插件Network Analyzer分析該網(wǎng)絡的拓撲學參數(shù)，以連接度值(Degree)篩選黑種草治療糖尿病的核心成分、核心靶點。

1.7 分子對接評估

分析“1.4”項黑種草治療DM相關靶點PPI網(wǎng)路、“1.6”項下有效成分-DM靶點-信號通路網(wǎng)絡，將連接度值較大的核心成分百里醌(Degree：67)、常春藤皂苷元(Degree：60)、羊毛甾醇(Degree：57)、山柰酚(Degree=48)與核心靶點胰島素蛋白(Insulin，INS)、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)，“1.4”項PPI網(wǎng)絡中連接度值較大的樞紐靶點芳香化酶(Aromatase，CYP19A1)、皮質(zhì)類固醇11-β-脫氫酶同工酶1(Corticosteroid 11-beta-dehydrogenase isozyme 1，HSD11B1)、多不飽和脂肪酸5-脂氧合酶(Polyunsaturated fatty acid 5-lipoxygenase，ALOX5)進行分子對接研究。在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(https：//www.rcsb.org/)中檢索核心靶點蛋白的3D晶體結(jié)構(gòu)，下載靶點蛋白PDB文件，并運用PyMol軟件對靶點蛋白進行去除溶劑、加氫、平衡電荷等預處理。通過ZINC數(shù)據(jù)庫[37](https：//zinc.docking.org/)查找核心成分的3D結(jié)構(gòu)，并保存為Mol2格式。在SwissDock數(shù)據(jù)庫[38](http：//www.swissdock.ch/)中導入核心靶點蛋白與核心成分的3D結(jié)構(gòu)，進行分子對接評估分析，評估結(jié)果在UCSF Chimera軟件[39]中進行可視化處理。

2 細胞實驗

2.1 儀器與試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE1010(鄭州凱瑞設備有限公司)；BJ-1CD/2CD凈化工作臺(上海博訊實業(yè)有限公司)；實時熒光定量PCR儀QuantStudioTM 5(美國賽默飛公司)；CO2培養(yǎng)箱310(美國賽默飛公司)；酶標儀SpectraMax i3x(美國賽默飛公司)；DSZ2000X倒置顯微鏡(重慶知微儀器有限公司)。

黑種草(購自北京同仁堂，批號：2110227)；高糖DMEM培養(yǎng)基(H-DMEM，4.5 μg/mL Glu，Sigma-Aldrich公司)；鏈脲佐菌素(STZ，MCE公司)；qRT-PCR試劑盒(碧云天公司)；Min6胰島素瘤細胞(凱基生物公司，批號：CL-0674)；胎牛血清(批號：164210)、青霉素-鏈霉素溶液(批號：PB180120)均購自普諾賽生物公司。

2.2 黑種草提取物制備

取黑種草25 g，按照提取條件為料液比1∶8(g/mL)加入水，溫度80 ℃，提取3次，每次30 min。合并3次提取液，濾過，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮制成浸膏。取浸膏適量，加PBS制成10 mg·mL-1的黑種草提取物母液，0.22 μm的微孔濾膜濾過，備用。

2.3 細胞培養(yǎng)及糖尿病細胞模型制備

Min6胰島素瘤細胞加入DMEM培養(yǎng)基(含15%的胎牛血清、50 μg·mL-1鏈霉素和75 μg·mL-1青霉素)中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。當細胞融合至70%～80%進行傳代。按參考文獻[40]方法，將Min6細胞置于含有5 mmol·L-1STZ的DMEM培養(yǎng)基中孵育30 min。即得糖尿病胰島β細胞模型，命名為糖尿病Min6細胞。

2.4 MTT法檢測細胞活力

將正常Min6細胞接種于96孔板中(每孔1.5×105個細胞)，每孔100 μL。試驗設置正常組(僅含培養(yǎng)基)，給藥組(分別添加培養(yǎng)基和0.30、0.6、1.2、2.4、4.8 mg·mL-1的黑種草提取物)，每組均設置3個重復孔。在37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h后，除去培養(yǎng)基，每孔添加100 μL含有0.5 mg·mL-1MTT的培養(yǎng)基。繼續(xù)孵育4 h后，吸除培養(yǎng)基，并向每個孔中添加100 μL二甲基亞砜。在酶標儀570 nm波長下測量吸收波長。以正常組細胞存活率為100%，比較給藥組細胞活力情況。

2.5 實時定量PCR分析

將Min6細胞接種于6孔板(每孔1.5×105個細胞)中。試驗設置正常組：Min6細胞在DMEM中孵育30 min后，置于H-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h；造模組：糖尿病Min6細胞在添加有5 mmol·L-1STZ的培養(yǎng)基孵育30 min后，置于4.5 mg·mL-1的H-DMEM培養(yǎng)基中孵育1 h；給藥組：糖尿病Min6細胞在添加有5 mmol·L-1STZ的培養(yǎng)基孵育30 min，后置于分別添加0.30、0.6、1.2、2.4 mg·mL-1黑種草提取物的H-DMEM培養(yǎng)基中孵育1 h。每組均設有3個重復孔。用Trizol法提取總RNA，取用2 μL總RNA進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。實時PCR檢測系統(tǒng)和SYBR對INS、AKT1、ALOX5、AR和ACHE進行RT-PCR擴增，20 μL擴增體系，程序設置為：94 ℃預處理30 s，后進行94 ℃、5 s；62 ℃、34 s；72 ℃、60 s的40個循環(huán)。相對表達含量運用2-ΔΔCt法進行計算，將正常組的mRNA表達水平設置為1，研究造模組和給藥組相關基因表達的情況。引物序列信息見表1。

表1 引物序列

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 黑種草與DM基因靶點的獲取

利用ETCM數(shù)據(jù)庫和SwissADME平臺結(jié)合文獻調(diào)研方法，共收集獲得黑種草化學成分102個，篩選得到有效成分41個，見表2。通過TCMSP、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預測有效成分潛在的基因靶點，刪除重復值，共獲得黑種草基因靶點786個。在GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索DM相關基因靶點共有13 761個，篩選相關度分值(Relevance score)≥10的基因共有806個作為研究靶點；OMIM數(shù)據(jù)庫和Uniprot數(shù)據(jù)庫中分別獲得DM相關基因靶點185、184個。匯總?cè)コ貜椭档玫?49個DM基因靶點。

表2 黑種草有效成分

續(xù)表2

3.2 黑種草治療DM基因靶點獲取及韋恩圖、蛋白互作圖繪制

將“2.1”項下獲取的786個黑種草基因靶點與949個DM基因靶點導入Venny 2.1.0在線作圖工具平臺制成韋恩圖，共獲160個交集靶點，即為黑種草治療DM疾病的基因靶點，見圖1。利用String和Cytoscape 3.8.2軟件，繪制黑種草治療DM基因靶點的PPI圖，見圖2，圖中“節(jié)點(node)”代表基因靶點，顏色越深、面積越大，說明與網(wǎng)絡中更多節(jié)點相關聯(lián)，節(jié)點越重要；“邊(edge)”代表節(jié)點之間的關聯(lián)強度，邊的顏色深淺、寬度代表“Combined score(關聯(lián)度)”，顏色越深、線條越寬說明連線兩端的節(jié)點間關系越緊密。運用CytoHubba插件的MCC算法篩選出排名前10的樞紐基因靶點。如圖3所示，胰島素蛋白(Insulin、INS、Degree：121)、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase、AKT1、Degree：114)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor、TNF、Degree：112)、清蛋白(Albumin、ALB、Degree：111)、白細胞介素-6(Interleukin-6、IL6、Degree：108)等樞紐基因靶點與網(wǎng)絡其他靶點關聯(lián)緊密，樞紐基因表達上調(diào)或下調(diào)對整個網(wǎng)絡均會造成較大影響。推測圖3所示的樞紐基因靶點在黑種草治療DM時很可能發(fā)揮了重要作用。

圖1 黑種草治療DM相關基因靶點韋恩圖

圖2 黑種草治療DM相關基因靶點PPI圖

圖3 黑種草治療DM相關基因靶點中樞紐基因靶點PPI圖

3.3 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果

將“2.2”項下篩選獲得的160個交集靶點上傳至Metascape數(shù)據(jù)庫進行GO分析和KEGG通路富集分析。其中，GO分析結(jié)果如圖4所示，GOBP條目有2 491條，主要涉及糖脂代謝調(diào)控、激素分泌、激酶活性調(diào)節(jié)和炎癥反應等方面；GOCC條目有102條，在細胞囊泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞膜等富集占比高；GOMF198條，相關靶點調(diào)節(jié)糖尿病的功能主要富集在細胞信號傳導活動、轉(zhuǎn)錄表達活動和激酶活性調(diào)節(jié)等。KEGG富集分析共獲得通路343條，除去廣泛通路[41]，篩選出排名前20的糖尿病相關信號通路，如圖5所示。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，160個黑種草治療糖尿病相關靶點主要富集在糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、胰島素抵抗通路(Insulin resistance)和胰島素信號通路(Insulin signaling pathway)、2型糖尿病通路(Type II diabetes mellitus)、PI3K-Akt通路(PI3K-Akt signaling pathway)和胰高血糖素通路(Glucagon signaling pathway)等糖尿病相關通路上，這表明黑種草作用于多條信號通路發(fā)揮抗糖尿病作用。在糖尿病相關通路中，糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路上富集有24個靶點(黑種草治療DM相關靶點共160個)，富集比最大為15%，可信度最高，可信度值Neglig10_P為31.877；其次為胰島素抵抗通路，富集基因數(shù)為23，可信度值為29.483。此二者可能是黑種草治療DM的關鍵通路。

圖4 黑種草治療DM相關基因靶點的GO富集分析圖

圖5 黑種草治療DM相關基因靶點KEGG富集分析結(jié)果氣泡圖

3.4 有效成分-疾病靶點-信號通路網(wǎng)絡構(gòu)建

將“2.1”項下黑種草有效成分-作用靶點、DM基因靶點進行匹配，保留有匹配結(jié)果的有效成分和作用靶點，刪除無匹配結(jié)果的數(shù)據(jù)，結(jié)合“2.3”項下富集的糖尿病相關信號通路，獲得有效成分-疾病靶點-信號通路數(shù)據(jù)庫，包括39個有效成分、160個疾病靶點和8條糖尿病相關通路。運用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建黑種草治療DM疾病的“有效成分-疾病靶點-信號通路”網(wǎng)絡圖，并運用Cytoscape內(nèi)置插件Network Analyzer分析該網(wǎng)絡的拓撲學參數(shù)。如圖6所示，該網(wǎng)絡含有213個節(jié)點，930條邊。節(jié)點的顏色越深、面積越大，說明該節(jié)點在整個網(wǎng)絡中越重要；邊的顏色深淺、寬度代表相關度，顏色越深、線條越寬說明連線兩端的節(jié)點間關系越緊密。網(wǎng)絡中Degree(連接度)值排名前10的成分預測為黑種草治療DM核心成分：百里醌(Degree：67)、常春藤皂苷元(Degree：60)、羊毛甾醇(degree：57)、山柰酚(Degree=48)、β-谷甾醇(Degree=44)、亞油酸(Degree=36)、油酸(Degree=31)、β-香樹精(Degree=28)、二聚百里醌(Degree=28)和2，4-二羥基苯乙酸甲酯(Degree=24)；排名前10的核心靶點有：芳香化酶(Aromatase，CYP19A1)、皮質(zhì)類固醇11-β-脫氫酶同工酶1(Corticosteroid 11-beta-dehydrogenase isozyme 1，HSD11B1)、多不飽和脂肪酸5-脂氧合酶(Polyunsaturated fatty acid 5-lipoxygenase，ALOX5)、雄激素受體(Androgen receptor，AR)、乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，ACHE)、雌激素受體(Estrogen receptor，ESR1)、性激素結(jié)合球蛋白(Sex hormone-binding globulin，SHBG)、NPC1樣細胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白1(NPC1-like intracellular cholesterol transporter 1，NPC1L1)、一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，inducible，NOS2)、類固醇17-α-羥化酶/17α裂解酶(Steroid 17-alpha-hydroxylase/17，20 lyas，CYP17A1)。在Cytoscape網(wǎng)絡分析中，每種活性成分對應多個靶點，而每個靶點均連接多個成分。這提示黑種草是通過多成分作用于多靶點發(fā)揮治療DM作用。

3.5 分子對接評估結(jié)果

運用SwissDock驗證黑種草治療DM的核心成分與核心靶點、樞紐靶點的結(jié)合情況。SwissDock對接結(jié)果評價參數(shù)主要有Delta G、Cluster rank，Delta G是受體蛋白與配體小分子對接的自由結(jié)合能，Delta G為負值代表受體、配體的結(jié)合可以自行發(fā)生，且Delta G數(shù)值≤-7時說明配、受體親和力強，結(jié)合穩(wěn)定；Cluster rank代表分子不同的結(jié)合模式，數(shù)值為“0”時，結(jié)合模式最佳[42-44]。核心成分與核心靶點、樞紐靶點對接情況如表3所示。挑選Delta G≤-7，配、受體結(jié)合穩(wěn)定的對接組進行可視化處理，如圖7所示。樞紐靶點INS-山柰酚、AKT1-山柰酚、TNF-羊毛甾醇、TNF-山柰酚，核心靶點CYP19A1-常春藤皂苷元、CYP19A1-山柰酚、HSD11B1-羊毛甾醇、HSD11B1-山柰酚、ALOX5-羊毛甾醇、ALOX5-山柰酚均結(jié)合穩(wěn)定，有較好的相互作用。這提示核心成分、核心靶點和樞紐靶點可能是黑種草發(fā)揮抗DM作用的主要藥效成分、作用靶點。

圖6 黑種草治療DM的有效成分-疾病靶點-信號通路網(wǎng)絡

表3 核心成分與樞紐、核心靶點的分子對接情況

圖7 核心成分與樞紐、核心靶點的分子對接圖

3.6 黑種草提取物對Min6細胞活力的影響

通過MTT試驗評估黑種草提取物對Min6細胞活力的影響，如圖8所示，在0.30、0.60、1.20、2.40 mg·mL-1給藥濃度下，細胞存活率均>90%，說明黑種草提取物的上述濃度對細胞影響較小。對比正常組，給藥4.8 mg·mL-1黑種草提取物后，細胞存活率顯著降低(P<0.001)，說明該濃度對Min6細胞毒性較強，會影響其正常生長，為避免干擾后續(xù)試驗，不采用此濃度。

注：與正常組比較，***P<0.001。

3.7 黑種草提取物對INS、AKT1、ALOX5、ACHE和AR的mRNA表達影響

黑種草提取物對糖尿病Min6細胞中INS、AKT1、ALOX5、ACHE和AR的mRNA表達影響見圖9。與造模組相比，黑種草提取物給藥組(0.30、0.6、1.2、2.4 mg·mL-1)的INS、AKT1、ALOX5和AR的mRNA表達均顯著提高，ACHE的mRNA表達水平明顯下降。

注：與造模組比較，nsP>0.05，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

4 討論

糖尿病DM是臨床常見、多發(fā)的慢性疾病，亦是全球患病人數(shù)增長最快的疾病之一[45]，嚴重威脅人類公共衛(wèi)生安全?？固悄虿∷幬锏拈_發(fā)受到醫(yī)藥行業(yè)的持續(xù)關注，但由于傳統(tǒng)抗糖尿病的化學藥、生物藥存在無法徹底治愈，長期服用易產(chǎn)生耐藥性及諸多副作用等問題[46]。近年來，以天然藥物為基礎的糖尿病治療策略得以廣泛研究，其中，黑種草被認為是極具開發(fā)價值的抗糖尿病天然藥物[47]。研究表明，黑種草通過多種活性成分協(xié)同作用，調(diào)節(jié)糖尿病患者的高血糖水平，改善血脂譜，緩解糖尿病并發(fā)癥，從而發(fā)揮其抗糖尿病活性[48-49]。但黑種草化學成分復雜，且囿于傳統(tǒng)“單成分”“單靶點”的研究模式，黑種草治療DM的活性成分、作用機制仍未十分明確。本研究利用網(wǎng)絡藥理學結(jié)合分子對接技術，從分子層面研究黑種草抗糖尿病的物質(zhì)基礎、作用機制，為后續(xù)實驗的開展提供了目標與思路。

通過構(gòu)建有效成分-疾病靶點-信號通路網(wǎng)絡發(fā)現(xiàn)，黑種草通過多種活性成分，經(jīng)多條信號通路協(xié)同作用于多個靶點而發(fā)揮抗DM作用，其中，百里醌、常春藤皂苷元、羊毛甾醇、山柰酚、β-谷甾醇、亞油酸、油酸、β-香樹精、二聚百里醌和丁香酸等10個化合物是黑種草治療DM的核心成分[50-52]。百里醌是黑種草主要活性成分之一，含量豐富[50]，Alshahrani S等[53]研究發(fā)現(xiàn)，百里醌可以顯著降低糖尿病大鼠的血糖、血脂水平，改善胰島素抵抗。此外，百里醌還通過介導PI3K/Akt信號通路，減輕氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡改善心血管功能，起到緩解糖尿病并發(fā)癥的效果[54-55]。實驗證明，山柰酚、β-谷甾醇、亞油酸、油酸、β-香樹精等成分與糖尿病及糖尿病并發(fā)癥病理機制相關[56-60]，而常春藤皂苷元、羊毛甾醇、β-谷甾醇、二聚百里醌和2，4-二羥基苯乙酸甲酯等成分尚無治療糖尿病相關報道，可能是潛在的抗糖尿病先導化合物或協(xié)同作用成分，還有待進一步實驗驗證。分析黑種草治療DM相關基因靶點的PPI網(wǎng)絡，結(jié)合有效成分-疾病靶點-信號通路網(wǎng)絡顯示，樞紐靶點INS、AKT1、TNF與Degree值排名前3的核心靶點CYP19A1、HSD11B1、ALOX5在黑種草治療DM時可能發(fā)揮重要作用。其中，INS(胰島素)參與機體糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)[61]、脂質(zhì)代謝[62]、神經(jīng)突觸調(diào)節(jié)[63]和炎癥反應[64]等生物過程，而以上過程均與糖尿病及其并發(fā)癥有關，胰島素分泌缺陷、胰島素抵抗是糖尿病的重要致病因素[1，65]；AKT1是胰島素受體底物蛋白(Insulin receptor substrate，IRS)的下游效應因子，被磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)激活，AKT1被激活后可通過正反饋調(diào)節(jié)方式刺激胰島β細胞分泌胰島素，參與調(diào)節(jié)機體內(nèi)葡萄糖糖穩(wěn)態(tài)平衡；研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠AKT基因后，小鼠表現(xiàn)為2型糖尿病表型，證明了AKT的3種亞型AKT1/2/3在2型糖尿病的發(fā)病中均發(fā)揮重要作用[66-67]。2型糖尿病被認為是由氧化應激導致多基因代謝紊亂而引發(fā)的代謝性疾病，氧化應激是造成機體胰島素抵抗，β細胞功能障礙和葡萄糖耐量受損的根本原因；而ALOX5作為氧化應激相關基因受到學術界的廣泛關注[68-69]。Schwartzman等[70]敲除小鼠的ALOX5基因發(fā)現(xiàn)，小鼠的胰島素分泌明顯減少，空腹血糖水平和脂肪量顯著增加，證明ALOX5在調(diào)節(jié)機體葡萄糖穩(wěn)態(tài)中有重要作用，ALOX5表達異常會促進2型糖尿病的發(fā)生與發(fā)展[71]，驗證了本研究結(jié)果的準確性、科學性。分子對接技術分析連接度值(Degree)排名前4的核心成分百里醌、常春藤皂苷元、羊毛甾醇、山柰酚與關鍵樞紐靶點、核心靶點的結(jié)合情況，結(jié)果表明，每一核心成分均能與多個靶點產(chǎn)生相互作用，體現(xiàn)了黑種草多成分、多通路、多靶點治療DM的特點。

本研究對黑種草治療DM相關靶點進行了GO生物進程分析和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，黑種草主要干預機體細胞糖脂代謝、激素分泌、激酶活性以及機體炎癥反應等生物進程。糖尿病患者糖脂代謝紊亂會導致機體血糖過高、血脂譜異常，也是糖尿病動脈粥樣硬化等大血管并發(fā)癥的高危因素[72]；機體內(nèi)甲狀腺激素、生長激素和糖皮質(zhì)激素等激素異常分泌可誘發(fā)糖尿病發(fā)作[73-74]；蛋白激酶對于機體葡萄糖穩(wěn)態(tài)具有重要意義，例如，磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide-3-kinase，PI3K)、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)和蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)等激酶異常激活時，將導致肥胖、糖尿病及糖尿病的微血管、大血管病變等[75-76]；炎癥通路是肥胖、糖尿病和心血管疾病的致病機制之一[77]，血管炎癥反應及組織器官的炎癥損傷、病變是糖尿病中、后期的主要危害因素，易誘發(fā)心腦血管病變、周圍神經(jīng)病變等。KEGG通路富集主要集中在糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路、胰島素抵抗通路、胰島素通路、2型糖尿病通路、PI3K-Akt通路和胰高血糖素通路等糖尿病相關通路上。糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路與糖尿病及其并發(fā)癥密切相關，晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanced glycation end-products，AGEs)作為該通路的起始環(huán)節(jié)，是由蛋白質(zhì)、氨基酸和脂類等分子與還原糖發(fā)生美拉德反應的產(chǎn)物，而高血糖濃度會促進該反應進行[78]。當機體處于持續(xù)高血糖水平時，大量蓄積的AGEs與細胞表面受體RAGE結(jié)合，引發(fā)級聯(lián)反應，激活細胞內(nèi)NADPH氧化酶生成活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，激活PI3K-Akt信號通路、MAPKs通路和NF-κB通路等下游通路，從而促進炎癥反應、氧化應激和細胞凋亡等生物進程，介導糖尿病及并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[79-83]。研究表明，AGEs及其受體(RAGE)在糖尿病及神經(jīng)病變、認知障礙、腎病、視網(wǎng)膜病變、動脈粥樣硬化、微血管病變等糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，且二者常作為生物標志物用于檢測糖尿病及其并發(fā)癥的病變情況[84-86]。如圖10所示，在糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路中，黑種草成分通過作用于AKT1、IL-6、PIK、VCAM1和NOS3等24個靶點，干擾機體細胞增殖、細胞凋亡、炎癥反應和動脈粥樣硬化進程，從而發(fā)揮抗糖尿病作用。

圖10 黑種草治療DM的AGE-RAGE信號通路

本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法發(fā)現(xiàn)，黑種草百里醌、常春藤皂苷元、羊毛甾醇、山柰酚、β-谷甾醇、亞油酸、油酸、β-香樹精、二聚百里醌和丁香酸等多個化合物經(jīng)由糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路、胰島素抵抗通路、胰島素信號通路、2型糖尿病通路、PI3K-Akt通路和胰高血糖素通路等糖尿病相關通路，協(xié)同作用于INS、AKT1、TNF、ALB、IL-6、CYP19A1、HSD11B1、ALOX5、AR、ACHE等多個靶點發(fā)揮干預治療糖尿病的作用，顯示黑種草治療DM是多成分、多通路、多靶點共同作用的結(jié)果。本研究利用實時熒光定量PCR技術，檢測了黑種草提取物對糖尿病Min6細胞INS、AKT1、ALOX5、AR和ACHE的mRNA表達水平影響，黑種草可以使INS、AKT1、ALOX5、AR表達上調(diào)，促進β細胞胰分泌胰島素，并降低ACHE表達，抑制細胞凋亡進程，進而調(diào)控血糖水平，達到治療糖尿病的效果。本研究結(jié)果可為黑種草治療DM的臨床應用與產(chǎn)品開發(fā)提供理論參考和實驗依據(jù)。