半滑舌鰨腸道中抗氧化活性乳酸桿菌的篩選與鑒定

郭 東， 包瑞璇， 王 逸， 盧 靜， 呂明生*， 王淑軍

（1.江蘇海洋大學(xué)海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇海洋大學(xué)，江蘇連云港 225005；2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇連云港 222000）

半滑舌鰨魚（Cynoglossus semilaevis）屬于舌鰨屬，經(jīng)中國(guó)水產(chǎn)研究院黃海研究所成功訓(xùn)化后，是我國(guó)重要水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一（張馨馨，2021）。魚體內(nèi)脂肪中含有豐富的不飽和脂肪酸，具有防止動(dòng)脈粥樣硬化、防治心血管疾病、增強(qiáng)記憶力和防止視力衰退等功效（張永真等，2016；王娜，2010）。該種魚多產(chǎn)于我國(guó)渤海灣、膠州灣和海州灣等海域（孫中之等，2005），近年來(lái)隨著養(yǎng)殖數(shù)量的增加，腹水病、爛鰭病、腸炎病等疾病經(jīng)常發(fā)生（蘇兆軍，2015）。水產(chǎn)養(yǎng)殖中急需有效的病害防控措施。

乳酸菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的微生態(tài)菌種之一，通過(guò)產(chǎn)生有機(jī)酸、乳酸菌素等提高養(yǎng)殖動(dòng)物抵抗力（鞏華等，2018）。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌和發(fā)酵產(chǎn)物還具有抗氧化作用。通過(guò)在飼料中添加具有抗菌和抗氧化作用的乳酸菌，可以實(shí)現(xiàn)健康養(yǎng)殖（曹衛(wèi)華，2017）。本研究從半滑舌鰨魚腸道中篩選乳酸菌，并對(duì)其生長(zhǎng)特性、抑菌作用、抗氧化活性以及其對(duì)飼料脂質(zhì)抗氧化作用進(jìn)行了研究，擬為獲得的乳酸菌的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原材料 健康的半滑舌鰨魚：水產(chǎn)品養(yǎng)殖場(chǎng)；高脂半滑舌鰨魚飼料：通威股份；創(chuàng)傷弧菌、大腸桿菌、副溶血弧菌、維氏氣單胞菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、庫(kù)氏鏈霉菌、擬桿菌、嗜水氣單胞菌等指示菌株：江蘇海洋大學(xué)海洋資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K：購(gòu)于南京都萊生物技術(shù)有限公司；過(guò)氧化氫酶：購(gòu)于上海阿拉丁試劑；革蘭氏染色試劑盒：購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；DNA marker2000、DNA marker5000：購(gòu)自Takara-寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；電泳用瓊脂糖：購(gòu)于BIOWEST公司；細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒：購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：Sigma公司；MRS肉湯：北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 1510酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo公司；SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；XN-26高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌鑒定

1.2.1.1 革蘭氏染色 將培養(yǎng)10 h的菌株進(jìn)行革蘭氏染色鑒定。

1.2.1.2 16SrDNA鑒定 將革蘭氏染色陽(yáng)性的菌株提取基因組，選用細(xì)菌鑒定通用引物，經(jīng)提取菌株基因組，PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后寄上海生工生物公司檢測(cè)，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹（高鵬，2016；呂愛軍等，2010）。

1.2.2 乳酸菌對(duì)病原菌的抑制 采用牛津杯法。將分離菌株接種MRS液體培養(yǎng)基，37℃，48 h，取部分發(fā)酵液7300×g，4℃離心30 min（郭鳳茹，2019；Komora等，2017）。選取創(chuàng)傷弧菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌、哈維氏菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、庫(kù)氏鏈霉菌、擬桿菌和嗜水氣單胞菌活化后，稀釋涂布于LB培養(yǎng)基，滅菌牛津杯放置涂菌培養(yǎng)基表面加入200μL發(fā)酵上清液，37℃，24 h，測(cè)定抑菌圈直徑。

1.2.3 乳酸菌生長(zhǎng)特性

1.2.3.1 耐酸性 將菌株接種于用1 mol NaOH和1 mol的HCl調(diào)節(jié)pH至2.0和3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，分別于0、2、4、6 h取樣測(cè)定發(fā)酵液OD600（杜金城等，2016；Pakarian等，2016），不調(diào)節(jié)pH的MRS培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.2.3.2 耐膽鹽 在MRS液體培養(yǎng)基添加0、0.1%、0.3%、0.5%的膽鹽（杜金城等，2016；郝志明等，2006）。接種菌株，37℃培養(yǎng)，分別于0、2、4、6 h取樣測(cè)定發(fā)酵液OD600。

1.2.4 抗生素對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響 采用藥敏紙片擴(kuò)散法。菌株100μL菌液涂布MRS培養(yǎng)基，放置數(shù)分鐘，選用硫酸卡那霉素、氨芐青霉素、硫酸鏈霉素和氯霉素四種抗生素，藥敏試紙含抗生素量為10μg/mL。將藥敏試紙分別放置于培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h（任士菊等，2014；Newaj-Fyzul等，2014），測(cè)定抑菌圈直徑。

1.2.5 抑菌物質(zhì)的鑒定 分別檢測(cè)過(guò)氧化氫酶、蛋白酶、pH、加熱處理和超濾對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響，采用牛津杯法，測(cè)定上清液抑菌圈的大小（馬迎濤，2016；Ngo，2015）。

1.2.5.1 過(guò)氧化氫酶 調(diào)節(jié)菌株發(fā)酵上清液至過(guò)氧化氫酶的最適pH 7.0，加入濃度為5 mg/mL的過(guò)氧化氫酶，37℃處理2 h，處理后調(diào)節(jié)pH與對(duì)照上清液相同。

1.2.5.2 蛋白酶 菌株發(fā)酵上清液分別加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶，使其終濃度為5 mg/mL，分別在酶的最適溫度和pH條件下2 h，將上清液pH調(diào)至與對(duì)照組相同（Papagianni，2015）。

1.2.5.3 pH 菌株發(fā)酵上清液的pH調(diào)節(jié)至3.0、5.0、7.0、9.0，對(duì)照為未調(diào)節(jié)pH。

1.2.5.4 加熱處理 菌株發(fā)酵上清液置于60、80、100℃條件下處理15 min，未處理的上清液為對(duì)照（遲海等，2020）。

1.2.5.5 超濾 檢測(cè)活性物質(zhì)的分子量。選用3、10、30、50 K和100 K超濾管，取5 mL發(fā)酵上清液超濾，4℃，2400×g離心后，取200μL，采用牛津杯法檢測(cè)。指示菌為副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌。

1.2.6 乳酸菌發(fā)酵液的抗氧化活性 菌株發(fā)酵上清液、菌懸液及無(wú)細(xì)胞提取物（CFE）的制備（Li等，2013；Chen等2008）。菌株以1%接種MRS液體培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)16 h。（1）發(fā)酵液4℃條件下，7300×g離心30 min，收集上清液和菌體；（2）菌體經(jīng)PBS緩沖液洗3次，調(diào)整濃度為1.0×1010cfu/mL菌懸液；（3）取部分菌體超聲（1500 W，10 min）破碎，4℃，7300×g離心30 min，上清液為CFE。

1.2.6.1 超氧陰離子自由基的清除能力 在含有0.05 mol的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0，4.5 mL）和2.5mol的鄰苯三酚0.4 mL溶液中加入樣品100μL，置于25℃恒溫水浴中放置8 min，立即滴加一滴8 mol HCl終 止反應(yīng) （余芳等，2017；Box等，2014）。在325 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。樣品的吸光度：A1，生理鹽水代替樣品：空白對(duì)照A0。

超氧陰離子自由基清除率/%=（A0-A1）/A0×100。

1.2.6.2 羥自由基（·OH）的清除能力 在試管中加入的FeSO4溶液（5 mol）2 mL，C7H6O3-C2H5OH（5 mol）2 mL，H2O2溶液（3 mol）2 mL，混合均勻，加入3 mL樣品，37℃保溫20 min，在4℃，7300×g離心10 min，上清液測(cè)定OD510數(shù)值為Aβ。以無(wú)菌生理鹽水代替H2O2為空白，測(cè)定的吸光度數(shù)值為Aα；生理鹽水代替樣品為對(duì)照，測(cè)定的吸光度數(shù)值為Aε（Das等，2015）。

·OH自由基的清除率/%=[1-（Aβ－Aα）]/Aε×100。

1.2.6.3 DPPH自由基的清除能力 試管中加入樣品和含有0.2 mol DPPH的無(wú)水乙醇溶液各2 mL，混均后避光靜置30 min，4℃，7300×g離心10 min，取上清液測(cè)定OD517數(shù)值為Aγ。空白不含DPPH，記為Aθ，對(duì)照為無(wú)菌水，記為AΩ（黃玉軍，2013）。

DPPH自 由 基 清 除 率/%=[1-（Aγ－Aθ）]/AΩ×100。

1.2.6.4 還原能力 玻璃試管加入樣品、K3[Fe（CN）6]（1%）、pH 6.6的PBS緩沖液各1 mL，混合均勻后（姚杰玢等，2015），50℃保溫15 min，降至室溫后加入1 mL的10%體積的C2HCl3O2，混勻，于4℃，7300×g離心10 min。取上清液、純水和三氯乙酸試劑（0.1%）各2 mL，充分混勻，靜置5min后 測(cè) 定OD700（Mikulski等，2020；Wang，2020）。樣品的吸光度值為Aa，以PBS緩沖液代替樣品的吸光度值為Ab。

還原能力/%=（Aa-Ab）/Ab×100。

1.2.7 抗脂質(zhì)過(guò)氧化 取250 g高脂質(zhì)半滑舌鰨魚飼料樣品碾碎成粉末，加入50 mL培養(yǎng)16 h的菌懸液或發(fā)酵上清液，拌勻，空白對(duì)照不加。于60℃條件下放置24 h后取出放入500 mL錐形瓶中，加入適量石油醚浸沒樣品，靜置24 h后過(guò)濾，置于45℃烘箱內(nèi)干燥2 h，參考伍立鋒等（2011）的方法測(cè)OD572并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算過(guò)氧化值。

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用三組平行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用Origin 2021進(jìn)行作圖，應(yīng)用IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)，MEGA 7.0繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌鑒定

2.1.1 革蘭氏染色結(jié)果 經(jīng)過(guò)多輪篩選，共獲得有透明圈的菌株32株。經(jīng)革蘭氏染色、芽孢染色和鞭毛染色觀察。其中，菌株CS1、CS2、CS4為革蘭氏陽(yáng)性，桿菌、無(wú)芽孢、無(wú)鞭毛、菌端鈍圓。結(jié)果見圖1。

圖1 菌株CS1、CS2、CS4革蘭氏染色結(jié)果

2.1.2 菌株16SrDNA的序列分析 三株菌16S rDNA的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳見圖2，產(chǎn)物大小約為1500 bp。經(jīng)上海生工進(jìn)行測(cè)序、比對(duì)，構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖3、圖4、圖5。

圖2 16S rDNA PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖3 菌株CS1系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 菌株CS2系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖5 菌株CS4系統(tǒng)進(jìn)化樹

菌株CS1和CS2與發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）的同源性為99%；CS4與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的同源性為98%，確定三菌株分另為L(zhǎng)actobacillus sp.CS1，Lactobacillus sp.CS2，Lactobacillus sp.CS4。

2.2 菌株對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 菌株發(fā)酵上清對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響見表1。菌株CS1對(duì)大腸桿菌、維氏氣單胞菌、副溶血弧菌、枯草芽孢桿菌抑菌能力最強(qiáng)，對(duì)庫(kù)氏鏈霉菌、擬桿菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌抑制能力次之，對(duì)霍亂弧菌以及創(chuàng)傷弧菌則無(wú)明顯的抑制作用。菌株CS2和CS4對(duì)維氏氣單胞菌的抑菌能力最強(qiáng)，對(duì)創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌以及幽門螺旋桿菌則無(wú)抑制作用，對(duì)其余菌株均有不同程度的抑制作用。結(jié)果表明，菌株的上清液可抑制病原菌生長(zhǎng)，具有廣譜抑菌效果。

表1 菌株上清液的抑菌圈直徑結(jié)果

2.3 菌株的生長(zhǎng)特性

2.3.1 耐酸性研究結(jié)果 菌株CS1、CS2、CS4在pH 2～3條件下均可生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速率略有降低（圖6）。該特性有利于菌株在腸道中的定植。

圖6 菌株CS1、CS2、CS4在不同pH條件下的生長(zhǎng)曲線

2.3.2 耐膽鹽研究結(jié)果 從圖7可以看出，在0.1%膽鹽濃度條件下，菌株CS1、CS2、CS4均可正常生長(zhǎng)。隨著膽鹽濃度的增加，對(duì)菌株CS1、CS2、CS4的生長(zhǎng)有一定影響。在0.5%膽鹽條件下，菌株的生長(zhǎng)速率較正常條件降低40%左右。腸道中膽鹽可以抑制微生物的生長(zhǎng)，菌株在不同膽鹽條件下的生長(zhǎng)特性有利于其成為腸道優(yōu)勢(shì)菌。

圖7 菌株CS1、CS2、CS4在不同濃度膽鹽下的生長(zhǎng)曲線

2.4 藥敏試驗(yàn) 由表2可知，氨芐青霉素鈉、氯霉素對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)有顯著的抑制性，顯示出清晰的抑菌圈，而菌株CS1、CS2、CS4對(duì)硫酸鏈霉素和硫酸鹽卡那霉素則不敏感。

表2 乳酸菌對(duì)抗生素的耐藥性

2.5 抑菌物質(zhì)活性研究

2.5.1 排除過(guò)氧化氫試驗(yàn)結(jié)果 由表3可以看出，經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理后的上清液，菌株CS1、CS2、CS4的抑菌圈略有下降，但差異不顯著。結(jié)果表明，乳酸菌不是通過(guò)產(chǎn)生H2O2抗菌的。

表3 乳酸菌上清液排除過(guò)氧化氫試驗(yàn)結(jié)果

2.5.2 蛋白酶對(duì)抑菌物質(zhì)活性影響的試驗(yàn)結(jié)果由表4可知，經(jīng)蛋白酶K處理后，沒有抑菌活性，經(jīng)胰蛋白酶處理后，抑菌活性顯著降低。木瓜蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)上清液的抑菌作用沒有影響。推測(cè)上清液中抑菌成分為蛋白質(zhì)，這與王騰騰（2017）從許氏平鲉腸道中分離的乳酸菌的結(jié)果相似。

表4 乳酸菌上清液驗(yàn)證蛋白性試驗(yàn)結(jié)果

2.5.3 pH對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響 由表5可見，在酸性條件下，菌株CS1、CS2、CS4的發(fā)酵上清液對(duì)指示菌株的抑制能力沒有顯著差異；在中性條件下，抑菌能力下降；堿性條件時(shí)，抑菌能力喪失。

表5 pH對(duì)乳酸菌上清液抑菌的影響

2.5.4 抑菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性研究試驗(yàn)結(jié)果 菌株CS1、CS2、CS4發(fā)酵上清液經(jīng)不同溫度處理后，其抑菌能力均未有顯著變化（表6），表明抑菌物質(zhì)具有較強(qiáng)的耐高溫能力，短時(shí)間在高溫條件下處理，其抑菌能力不受影響。

表6 乳酸菌上清液熱穩(wěn)定性影響的試驗(yàn)結(jié)果

2.6 抑菌物質(zhì)的抗氧化活性

2.6.1 對(duì)超氧陰離子自由基（O2-）的清除能力 由圖8可見，三株試驗(yàn)菌株的上清液對(duì)超氧陰離子的清除能力最強(qiáng)，其中，菌株CS1最強(qiáng)達(dá)到（29.8±2.41）%，高于菌株CS2與CS4。三株菌株的無(wú)細(xì)胞提取物的清除能力弱，表明抗氧化物主要為菌株發(fā)酵的胞外產(chǎn)物。與劉洋等（2012）的研究結(jié)果相同。

圖8 對(duì)超氧陰離子的清除結(jié)果

2.6.2 對(duì)羥自由基（·OH）的清除能力 由圖9可知，菌株CS1、CS2、CS4的發(fā)酵上清液對(duì)羥基自由基的清除能力最強(qiáng)，菌懸液次之，無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)羥基自由基的清除能力最弱；不同菌株間，CS2的上清液較其他菌株清除能力較強(qiáng)，達(dá) （35.0±1.54）%；對(duì)羥基自由的的清除能力強(qiáng)弱則體現(xiàn)了該物質(zhì)抗氧化能力的大小。

圖9 對(duì)羥基自由基的清除結(jié)果

2.6.3 對(duì)DPPH自由基的清除能力 菌株的發(fā)酵上清液對(duì)DPPH清除能力最強(qiáng)，其中，菌株CS1達(dá)到（52.6±4.10）%，最弱的是菌株CS2，清除能力為（41.7±1.55）%。菌懸液的DPPH清除能力次之，無(wú)細(xì)胞提取物清除能力最弱。

圖10 對(duì)DPPH自由基的清除結(jié)果

2.6.4 菌株發(fā)酵液的還原能力 從圖11可以看出，菌株發(fā)酵上清液的還原能力最強(qiáng)，其中，菌株CS2為（27.5±3.12）%，明顯高于其他兩株菌株。從菌懸液的角度，菌株CS4的還原能力最強(qiáng)，為（20.3±2.35）%，甚至高于其自身上清液。

圖11 菌株發(fā)酵液還原性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 活性物質(zhì)分子量估算 選取嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌作為指示菌，利用超濾管能將不同分子量物質(zhì)分離開來(lái)的特性，表7和表8顯示，菌株CS1、CS2、CS4的上清液中的抑菌物質(zhì)主要存在于3～10 kDa，且對(duì)于不同病原菌，抑菌物質(zhì)存在一定差異。結(jié)果表明，不同乳酸菌的產(chǎn)物和作用機(jī)制有較大的差異，與王偉（2018）試驗(yàn)結(jié)果相同。

表7 不同分子量范圍的上清液對(duì)嗜水氣單胞菌的抑制能力

表8 不同分子量范圍的上清液對(duì)副溶血弧菌的抑制能力

2.8 抗脂質(zhì)過(guò)氧化 由圖12可見，與空白相比，加入乳酸菌或其發(fā)酵上清的飼料，其抗脂質(zhì)氧化作用顯著提高，單純加入發(fā)酵上清的效果最好。其中，菌株CS4的作用最強(qiáng)。

圖12 乳酸菌菌株的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用

從半滑舌鰨腸道中篩選獲得的乳酸桿菌菌株CS1、CS2和CS4，具有一定的抵抗病害菌的能力，還可以提高飼料的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力，在水產(chǎn)飼料加工中具有一定的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

從半滑舌鰨腸道中篩選并鑒定了三株乳酸桿菌菌株CS1、CS2和CS4，對(duì)病害菌具有一定的抑制能力，其中，對(duì)維氏氣單胞菌的作用最強(qiáng)。氨芐青霉素鈉和氯霉素對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)有顯著的抑制性；相反，菌株對(duì)硫酸鏈霉素和硫酸鹽卡那霉素不敏感。通過(guò)排除試驗(yàn)，推測(cè)抑菌物質(zhì)為一種耐熱的蛋白質(zhì)，分子量在3～10 kDa。菌株在低pH和膽鹽存在條件下可以生長(zhǎng)。菌株發(fā)酵液具有抗氧化活性，其在飼料中添加可以顯著提高飼料的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力。乳酸桿菌CS1、CS2和CS4在水產(chǎn)養(yǎng)殖以及水產(chǎn)飼料加工中具有一定的應(yīng)用潛力。