利用柚子皮提取液制備具有抗氧化和抗菌性能的納米銀

何悅，杜津，任丹,2，吳習(xí)宇,2，徐丹,2*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400700)2(食品貯藏與物流研究中心(西南大學(xué))，重慶，400700)

納米銀(silver nanoparticles，AgNPs)因其具有獨(dú)特的表面增強(qiáng)特性、等離子體效應(yīng)、催化活性及抗菌性，被廣泛用在食品抗菌、醫(yī)療抗癌、紡織制造、廢水處理和信息材料等領(lǐng)域[1]。近年來，AgNPs常被用作填料添加進(jìn)包裝薄膜或涂膜材料中，應(yīng)用于奶制品、肉制品及果蔬的貯藏保鮮[2]，其可顯著抑制產(chǎn)品中微生物的生長，從而延長產(chǎn)品的保質(zhì)期，在食品貯藏保鮮領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力[3]。常見的AgNPs制備方法有物理法和化學(xué)法。物理法原理簡單，制得的AgNPs純度高，但設(shè)備成本高，且所得AgNPs粒徑不均，易發(fā)生團(tuán)聚；化學(xué)法雖能制備穩(wěn)定的AgNPs粒子，但使用的化學(xué)試劑具有一定毒性，不環(huán)保，且所得AgNPs也不適合用于食品包裝。綠色合成法則是采用天然無毒的植物材料或微生物系統(tǒng)作為還原劑和封端劑來合成AgNPs，可直接、快速地合成粒徑小、純度高、穩(wěn)定性好的AgNPs，且在合成過程中不產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物[4]。其中，利用富含抗氧化活性物質(zhì)的植物提取液來進(jìn)行AgNPs的綠色合成，在近年來引起了廣泛關(guān)注[5]。

柚子[Citrusmaxima(Burm) Merr.]為蕓香料柑橘屬植物，品種眾多，是亞熱帶的主要果樹之一。柚子皮作為柚子果實(shí)的副產(chǎn)物約占鮮果總重的20%～50%，其除了常見的水分、油脂、纖維素等成分外，還含有維生素、類胡蘿卜素、抗壞血酸、類黃酮、煙酸、核黃素、類檸檬苦素等有機(jī)化合物[6]。這些富含羥基和醛基的化合物提取簡單、無毒無污染、綠色環(huán)保，且抗氧化性強(qiáng)，可用作天然的還原劑[7]。但在目前的報(bào)道中，柚子皮主要用于加工飲品和蜜餞，以及制作肥料[8]，缺少對(duì)其中活性物質(zhì)的利用。因此，有效利用柚子皮中的抗氧化活性物質(zhì)，提高其附加值的研究顯得極為重要。機(jī)械球磨法是1970年BENJAMIN[9]在研究氧化物彌散強(qiáng)化鎳基高溫合金時(shí)提出的，其原理是在機(jī)械研磨的過程中使粉末發(fā)生變形、變性、破裂和分解等物理或化學(xué)反應(yīng)，具有簡單、綠色以及高效等優(yōu)點(diǎn)[10]。研磨的過程中微觀結(jié)構(gòu)的細(xì)化，可使后續(xù)提取過程中柚子皮中有機(jī)化合物充分釋放，有效提高其利用率[11]。有研究報(bào)道，將蛋殼膜與AgNO3的共混物放入球磨儀中進(jìn)行反應(yīng)，能合成粒徑小、穩(wěn)定性高、抗菌能力強(qiáng)的AgNPs粒子[12]，這為機(jī)械球磨在納米粒子合成中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

本研究以機(jī)械球磨后的柚子皮提取液為還原劑，為提高綠色合成法的效率，以AgNPs產(chǎn)率和粒徑為指標(biāo)，優(yōu)化制備條件，并對(duì)制備的AgNPs的性能進(jìn)行表征，為其在食品包裝中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮柚子[Citrusmaxima(Burm) Merr.]，市售；AgNO3、氨水、NaCl、NaOH、K2HPO4、DPPH(均為分析純)，成都市科龍化工試劑廠；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、葡萄糖(均為分析純)，北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司；大腸桿菌(Escherichiacoli)BNCC336953、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)BNCC354037、沙門氏菌(Salmonella)BNCC103283、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)BNCC184122，北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-10型真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；HH·B-S型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；Nano-ZS90型馬爾文激光粒度儀，英國馬爾文公司；THZ-D型臺(tái)式恒溫?fù)u床，江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；SP-756P型紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；BM6Pro型行星式球磨儀，北京格瑞德曼儀器設(shè)備有限公司；YK-24HDD型高溫高壓滅菌鍋，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；JEM-1200EX型透射電子顯微鏡，日本電子公司；XRD-7000型X射線衍射儀，日本島津公司；Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Nicolet公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 柚子皮粉末的制備

用蒸餾水將新鮮柚子表皮清洗干凈，剝下柚皮并去除柚皮上的白瓤，保留約2 mm厚的外皮。然后將外皮切成碎片，真空冷凍干燥12 h后，用高速多功能粉碎機(jī)將干燥的柚皮粉碎，得到柚皮粉末，再將粉末過200目篩，能通過篩子的粉末即為實(shí)驗(yàn)所需的原料。將原料放入相對(duì)濕度60%、溫度25 ℃的防潮柜中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 AgNO3及銀氨溶液的制備

準(zhǔn)確稱取2 g AgNO3，將其溶于純水中并定容至100 mL，配制成2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)的AgNO3溶液，避光低溫保存?zhèn)溆?。?%的AgNO3溶液50 mL，向其中逐滴加入2%的氨水，邊滴邊振蕩，直到最初生成的沉淀剛好溶完為止，得到銀氨溶液(Tollens試劑)，低溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 AgNPs的制備

稱取一定量的柚子皮粉末(0.8、1.0、1.2 g)和25 g球磨珠(大珠∶中珠∶小珠=1∶2∶2，質(zhì)量比)于球磨筒體中，以500 r/min的速度球磨一定的時(shí)間(20、40、60 min)，將球磨后的粉末放入250 mL的燒杯中。然后向燒杯中加入80 mL的去離子水及20 mL 1%的AgNO3或銀氨溶液，在90 ℃下水浴加熱反應(yīng)一定時(shí)間(0、0.5、1.0、1.5、2.0 h)合成AgNPs，最后將反應(yīng)液4 000 r/min離心10 min，保留上清液，即得AgNPs溶液。

1.3.4 結(jié)構(gòu)及性能表征

通過AgNPs的紫外可見吸收光譜(ultraviolet and visible spectroscopy，UV-Vis)、粒徑分布及粒徑大小分析銀源、球磨時(shí)間、柚子皮添加量以及加熱時(shí)間對(duì)制備AgNPs的影響，再表征AgNPs的結(jié)構(gòu)和性能。

1.3.4.1 紫外吸光光譜的測(cè)定

將AgNPs溶液稀釋50倍后，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在325～700 nm范圍內(nèi)的UV-Vis，分辨率為1 nm。

1.3.4.2 粒徑的測(cè)定

將AgNPs溶液稀釋100倍后，使用馬爾文激光粒度儀測(cè)定AgNPs的粒徑，樣品池內(nèi)溫度25 ℃，平衡60 s。

1.3.4.3 微觀形貌測(cè)定

將均勻分散的AgNPs溶液滴在覆炭銅網(wǎng)上，室溫干燥后，使用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)對(duì)樣品進(jìn)行觀察。觀察條件為點(diǎn)分辨0.24 nm、線分辨率0.14 nm和加速電壓200 kV。

1.3.4.4 結(jié)晶形貌測(cè)定

根據(jù)于嘉倫等[13]的方法，采用X射線衍射儀測(cè)定AgNPs的X射線衍射(X-ray diffraction，XRD)圖譜。

1.3.4.5 紅外光譜測(cè)定

將AgNPs溶液充分干燥后，采用KBr壓片法測(cè)定AgNPs在波數(shù)500～4 000 cm-1的紅外光譜(Fourier transform infrared spectrum，F(xiàn)TIR)。掃描次數(shù)32次，分辨率4 cm-1。

1.3.4.6 穩(wěn)定性測(cè)定

將AgNPs溶液稀釋50倍，置于4 ℃避光保存，每隔24 h吸取3.5 mL到石英比色皿中，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量溶液的最大吸光度值。

1.3.4.7 抗氧化性測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.019 7 g DPPH溶于無水乙醇中并定容至100 mL，得到濃度為0.05 mmol/L的DPPH溶液，裝入棕色瓶中備用。分別稱取0.03 g球磨后的柚子皮粉末和凍干后的AgNPs粉末分散于30 mL 0.05 mmol/L的DPPH溶液中，充分搖勻后置于25 ℃、150 r/min的恒溫振蕩器中避光反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后將溶液6 000 r/min離心6 min，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定上清液在517 nm下的吸光度值，以乙醇為參比調(diào)零。并用二丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT)和維生素C作為陽性對(duì)照。樣品的DPPH自由基清除率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：Ai，樣品加入DPPH溶液混勻后立即離心測(cè)得的吸光度值；Ac，DPPH溶液的吸光度值；Aj，樣品與DPPH溶液反應(yīng)30 min后的吸光度值。

1.3.4.8 抗菌性測(cè)定

將直徑為6 mm的無菌濾紙片分別放在生理鹽水、柚皮粉末提取液(8 g/L)、稀釋1倍(50% AgNPs)及不稀釋的AgNPs溶液中浸泡24 h后，根據(jù)于嘉倫等[13]的方法測(cè)量各組樣品對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌以及沙門氏菌的抑菌圈直徑。

準(zhǔn)確稱取10 mg凍干后的AgNPs粉末分散于10 mL的生理鹽水中，并將其進(jìn)行2倍濃度梯度稀釋，得到質(zhì)量濃度為1 000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9 mg/L的AgNPs分散液，滅菌后備用。然后，根據(jù)于嘉倫等[13]的方法測(cè)定AgNPs溶液對(duì)4種菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。按照AgNPs濃度從高到低將樣品編號(hào)為1～9，陰性和陽性對(duì)照分別編號(hào)為10和11。

從MIC實(shí)驗(yàn)樣品中各吸取0.2 mL混合液滴加到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，涂布均勻后37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基上細(xì)菌的生長情況。若培養(yǎng)基上有菌落形成則用“+”表示；若沒有菌落形成則用“-”表示。以培養(yǎng)基上沒有細(xì)菌生長時(shí)向試管中加入的最低AgNPs的濃度作為最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，采用單因素方差(ANOVA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均測(cè)定3次及以上，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 AgNPs合成工藝的優(yōu)化

2.1.1 銀源的影響

用AgNO3和銀氨溶液分別作為銀源制備AgNPs(柚子皮添加量0.8 g，球磨時(shí)間1 h, 加熱反應(yīng)時(shí)間1.5 h)，所得AgNPs的UV-Vis譜圖和粒徑分布如圖1所示。

a-UV-Vis譜圖；b-粒徑分布圖圖1 銀源對(duì)AgNPs的UV-Vis譜圖及粒徑分布的影響Fig.1 Effect of silver sources on the UV-Vis spectra and particle size distribution of AgNPs

2種銀源制備的AgNPs樣品均在430 nm左右有1個(gè)明顯的吸收峰(圖1-a)，為AgNPs表面等離子體共振所產(chǎn)生[14]，由此表明采用2種銀源均可制得AgNPs粒子。采用銀氨溶液制備的AgNPs溶液在最大吸收波長處的吸光度值顯著高于AgNO3制備的AgNPs溶液，表明采用銀氨溶液為原料時(shí)轉(zhuǎn)化率更高；采用AgNO3溶液為原料時(shí)，制備的AgNPs溶液的最大吸收波長發(fā)生了較大程度的紅移，表明其粒徑較大。圖1-b所示的粒徑分布進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)果。其中，銀氨溶液制備的AgNPs粒徑分布較窄(圖1-b)，且平均粒徑僅為(44.54±2.81) nm，顯著低于AgNO3溶液制備的AgNPs粒徑(148.97±4.84) nm(P<0.05)。相較于AgNO3，銀氨溶液中的Ag+與氨基絡(luò)合后，容易被醛、糖等化合物還原發(fā)生銀鏡反應(yīng)，且銀氨離子中的氨基容易與柚子皮中含羧基、酚羥基、氨基等基團(tuán)的活性物質(zhì)結(jié)合，使得銀氨離子被這些活性物質(zhì)吸附后，在溶液中形成多個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)位點(diǎn)的同時(shí)生成AgNPs，因此所得AgNPs的粒徑較小[15]。而AgNO3較難被醛、糖等弱還原劑還原，反應(yīng)活化能高，反應(yīng)速率慢，導(dǎo)致反應(yīng)過程中生成的AgNPs容易發(fā)生互相碰撞而團(tuán)聚[16]。因此，采用綠色還原法時(shí)，應(yīng)采用銀氨溶液為銀源，制備得到的AgNPs具有產(chǎn)率高、粒徑小、分布均勻等特點(diǎn)。具有較小粒徑的AgNPs其比表面積更高，可釋放出更多的Ag+，因此抗菌效果更好[17]。DONDI等[18]使用銀氨溶液作為銀源，采用糖三唑作為還原劑和鈍化配體，制備得到高度穩(wěn)定、尺寸和形狀受控的AgNPs。

2.1.2 球磨時(shí)間的影響

圖2所示為球磨時(shí)間分別為20、40、60 min(采用銀氨溶液為銀源，柚子皮添加量0.8 g，加熱反應(yīng)1.5 h)時(shí)所制備AgNPs的UV-Vis譜圖和粒徑分布。

a-UV-Vis譜圖；b-粒徑分布圖圖2 球磨時(shí)間對(duì)AgNPs的UV-Vis譜圖及粒徑分布的影響Fig.2 Effect of ball milling time on the UV-Vis spectra and particle size distribution of AgNPs

當(dāng)球磨時(shí)間為40 min時(shí)，所得AgNPs的最大吸光度值最高，粒徑分布最窄，平均粒徑最小為(42.07±1.84) nm；當(dāng)球磨時(shí)間為20或60 min時(shí)，所得AgNPs的吸光度較低，平均粒徑分別為(63.12±1.53)和(49.21±1.47) nm，粒徑分布范圍均有所增加。球磨時(shí)間過短，柚子皮纖維破壞不充分，在后續(xù)加熱反應(yīng)過程中，柚子皮中還原性物質(zhì)釋放不完全，反應(yīng)液中還原劑較少，導(dǎo)致AgNPs的產(chǎn)率低，且此時(shí)吸附在AgNPs表面的活性物質(zhì)較少，AgNPs不穩(wěn)定而易發(fā)生團(tuán)聚，因此粒徑分布不均；而球磨時(shí)間過長，柚子皮中部分還原性物質(zhì)可能在球磨珠的持續(xù)碰撞過程中發(fā)生分解，同樣造成后續(xù)反應(yīng)中還原劑減少，并且研磨時(shí)間較長會(huì)導(dǎo)致研磨介質(zhì)的污染[12]。BAL?等[12]將AgNO3溶液分別與球磨了30 min的蛋殼膜和45 min的牛至混合，均成功制備了粒徑約為35 nm的AgNPs，與本文研究結(jié)果接近。因此，最佳球磨時(shí)間為40 min。

2.1.3 柚子皮添加量的影響

分別加入0.8、1.0、1.2 g柚子皮進(jìn)行球磨，制備得到AgNPs(銀氨溶液為銀源，球磨時(shí)間40 min，加熱反應(yīng)1.5 h)的UV-Vis譜圖和粒徑分布如圖3所示。

a-UV-Vis譜圖；b-粒徑分布圖圖3 柚子皮添加量對(duì)AgNPs的UV-Vis譜圖及粒徑分布的影響Fig.3 Effect of pomelo peel adding amount on the UV-Vis spectra and particle size distribution of AgNPs

隨著柚子皮粉末添加量的增加，所得AgNPs的最大吸光度值先降低后增加，粒徑分布范圍逐漸增大，其平均粒徑分別為(37.61±0.46)、(42.07±1.84)、(47.37±2.22) nm，呈顯著增加(P<0.05)的趨勢(shì)。柚子皮用量的增加使反應(yīng)中的還原劑增加，有利于提高轉(zhuǎn)化率，但是過多的柚子皮會(huì)導(dǎo)致球磨不充分，且AgNPs合成過程中，過多的還原劑吸附在AgNPs表面，導(dǎo)致其粒徑增加。SONG等[19]發(fā)現(xiàn)隨著木蘭葉提取物添加量的提升，合成AgNPs的粒徑逐漸增加，并推斷納米粒子的粒徑與其表面結(jié)合的封端分子之間的相互作用有關(guān)。綜上選擇柚子皮的添加量為0.8 g。

2.1.4 加熱時(shí)間的影響

以不同加熱時(shí)間(0、0.5、1.0、1.5、2.0 h)制備AgNPs(采用銀氨溶液為銀源，柚子皮添加量為0.8 g，球磨時(shí)間為40 min)，結(jié)果如圖4所示。以上4種加熱時(shí)間下制備的AgNPs平均粒徑分別為(111.43±8.13)、(44.89±1.68)、(42.34±1.45)、(41.27±0.01)、(42.62±0.20) nm。當(dāng)不加熱時(shí)(0 h)，溶液中只有非常少的AgNPs產(chǎn)生，且粒徑分布范圍很廣，其平均粒徑遠(yuǎn)高于加熱反應(yīng)所得的AgNPs粒徑，可能是溫度較低時(shí)，未達(dá)到反應(yīng)的活化能，導(dǎo)致溶液中的活化分子較少，發(fā)生反應(yīng)的活性位點(diǎn)少，導(dǎo)致更多的銀氨離子吸附在少數(shù)反應(yīng)成核的AgNPs表面，使其粒徑增大。于嘉倫[20]采用天草柑提取液制備AgNPs最佳反應(yīng)溫度為90 ℃，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了加熱時(shí)間的優(yōu)化。由圖4-a可知，加熱時(shí)間從0.5 h增加至1.5 h時(shí)，溶液的最大吸光度值逐漸增加，AgNPs粒徑逐漸減小(圖4-b)。當(dāng)加熱時(shí)間增至2.0 h時(shí)，溶液的最大吸光度值反而降低，且AgNPs粒徑增大，表明大量的AgNPs合成后，再繼續(xù)加熱攪拌會(huì)導(dǎo)致AgNPs的聚集。由此說明，在加熱活化后，AgNPs逐漸生成，但反應(yīng)在1.5 h后已基本完成。因此，合成AgNPs的最優(yōu)加熱時(shí)間確定為1.5 h。

a-UV-Vis譜圖；b-粒徑分布圖圖4 加熱時(shí)間對(duì)AgNPs的UV-Vis譜圖及粒徑分布的影響Fig.4 Effect of heating time on the UV-Vis spectra and particle size distribution of AgNPs

2.2 AgNPs的結(jié)構(gòu)和性能分析

2.2.1 形貌與結(jié)構(gòu)分析

采用以上所得最佳工藝(將20 mL銀氨溶液和0.8 g球磨40 min的柚子皮加入80 mL純水中，在90 ℃下加熱攪拌1.5 h)合成AgNPs，并對(duì)其進(jìn)行表征。首先，利用TEM觀察AgNPs的微觀結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5-a、圖5-b所示。AgNPs粒子近于球形，且可均勻分散，說明本方法制備的AgNPs具有良好的分散性。同時(shí)觀察到部分較小粒徑的AgNPs，結(jié)合粒徑分布圖(圖1-b和圖4-b)可知AgNPs在溶液中呈雙峰分布，主要分布在0～10 nm及20～40 nm，可能是由于在反應(yīng)的過程中先合成了較小粒徑的AgNPs，然后合并成較大的簇，并進(jìn)一步重結(jié)晶成更大的Ag微晶[12]。

a-TEM(單個(gè)AgNP)；b-TEM(多個(gè)AgNPs)圖5 AgNPs微觀結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Microstructures of AgNPs

利用XRD測(cè)定AgNPs的結(jié)晶形貌，結(jié)果如圖6-a所示。在2θ值為38.4°、44.1°、64.4°、77.1°處出現(xiàn)了尖銳的吸收峰，與JCPDS (No.04-0783)立方相Ag的標(biāo)準(zhǔn)峰相一致，分別對(duì)應(yīng)于立方相Ag的(111)，(200)，(220)和(311)晶面[21]。由此說明，銀氨溶液中的Ag+被還原為AgNPs顆粒，且其晶相為面心立方結(jié)構(gòu)。2θ=22.6°處的寬吸收峰可能是AgNPs表面吸附的活性有機(jī)物質(zhì)產(chǎn)生的，說明柚子皮中的還原性物質(zhì)可能吸附于AgNPs表面。

a-XRD圖譜；b-FTIR圖譜圖6 AgNPs的XRD與FTIR結(jié)果圖Fig.6 XRD and FTIR results of AgNPs

2.2.2 穩(wěn)定性、分散性與抗氧化性分析

AgNPs溶液的UV-Vis光譜中最大吸光度值隨時(shí)間變化曲線如圖7-a所示。AgNPs溶液初始的最大吸光度值為1.03，在整個(gè)貯藏期間數(shù)值雖有波動(dòng)但波動(dòng)幅度較小，12 d后溶液的最大吸光度值為1.02，僅比第1天下降了0.01，說明AgNPs在水中極穩(wěn)定?？赡苁且?yàn)殍肿悠ぶ械男》肿游镔|(zhì)吸附在AgNPs的表面[15]，降低了AgNPs的表面能，因此在水中不易團(tuán)聚也不易沉降。

a-貯藏期間AgNPs溶液的最大吸光度值；b-DPPH自由基清除率圖7 AgNPs溶液在貯藏期間最大吸光度值的變化與AgNPs的DPPH自由基清除能力Fig.7 Maximum absorbance of AgNPs solution during storage and the DPPH free radical scavenging capability of AgNPs

AgNPs與球磨后柚子皮粉末的DPPH自由基清除能力如圖7-b所示，兩者對(duì)DPPH自由基的清除率均介于BHT和維生素C之間，說明具有較強(qiáng)的抗氧化能力。其中，柚子皮粉末的清除率約為59.78%，而AgNPs約為79.20%，說明AgNPs的抗氧化能力顯著高于柚子皮粉末(P<0.05)，其原因可能在于AgNPs比表面積大，表面吸附了較多的多酚、類黃酮等，能較好地與DPPH自由基進(jìn)行反應(yīng)，而柚子皮粉末中還含有較多纖維等雜質(zhì)，活性物質(zhì)的濃度較低，因此抗氧化能力弱于等質(zhì)量的AgNPs。

2.2.3 抗菌性分析

AgNPs通過釋放Ag+不僅能使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，細(xì)胞液滲漏[24]，而且可以與細(xì)胞內(nèi)酶中的硫氫基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，干擾細(xì)胞分裂[25]，還可以與細(xì)胞中的DNA反應(yīng)，通過光動(dòng)力反應(yīng)顯著增強(qiáng)嘧啶二聚化并阻止DNA復(fù)制[26]，從而使細(xì)胞凋亡。因此，AgNPs具有很強(qiáng)的光譜抗菌性，被廣泛用于食品、醫(yī)療及生活用品中。如圖8-a所示，生理鹽水和柚子皮粉末提取液對(duì)4種菌的生長均無抑制作用，而AgNPs則對(duì)4種菌都表現(xiàn)出明顯的生長抑制現(xiàn)象，但AgNPs與稀釋1倍后的AgNPs溶液(50% AgNPs)的抑菌圈差異不顯著，說明較低濃度的AgNPs就具有很強(qiáng)的抑菌性。4種菌中，AgNPs對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果最明顯，其抑菌圈直徑達(dá)到了28.0 mm，其次為沙門氏菌(11.2 mm)、金黃色葡萄球菌(10.0 mm)和大腸桿菌(9.8 mm)。

AgNPs對(duì)4種菌的MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8-b所示。結(jié)果顯示AgNPs對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的MIC分別為125、125、250、62.5 mg/L，說明AgNPs對(duì)4種菌的生長均有良好的抑制效果，但對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用最強(qiáng)，與抑菌圈的結(jié)果一致；對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力較為接近；對(duì)沙門氏菌的抑制作用相對(duì)較弱。

在MIC實(shí)驗(yàn)中，雖然營養(yǎng)培養(yǎng)基澄清，但培養(yǎng)基中的細(xì)菌不一定被完全殺死。為了進(jìn)一步探究AgNPs的殺菌性，在MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，測(cè)定了AgNPs對(duì)4種菌的MBC，結(jié)果如表1所示。AgNPs對(duì)4種菌均有明顯的殺滅效果，對(duì)大腸桿菌MBC值最低，為125 mg/L；其次是金黃色葡萄球菌，為250 mg/L；對(duì)沙門氏菌和枯草芽孢桿菌具有相同的MBC，為500 mg/L。綜上所述，本研究中合成的AgNPs對(duì)革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌均有良好的抗菌效果，可用于抗菌食品包裝。

a-抑菌圈；b-最小抑菌濃度圖8 AgNPs對(duì)4種菌的抑菌圈與最小抑菌濃度圖示Fig.8 The inhibition zone and the minimum inhibitory concentration of AgNPs towards four kinds of bacteria

表1 AgNPs對(duì)4種菌的MBCTable 1 MBC of AgNPs towards four kinds of bacteria

3 結(jié)論

采用球磨后的柚子皮合成AgNPs時(shí)，銀源、球磨時(shí)間、柚子皮添加量以及加熱時(shí)間對(duì)AgNPs的粒徑和得率均有較大的影響。將0.8 g球磨40 min的柚子皮加入20 mL銀氨溶液中，在90 ℃下加熱攪拌1.5 h制備AgNPs，得率高，粒徑小且均勻。在此條件下合成的AgNPs平均粒徑為(37.61±0.46)nm，呈球形面心立方結(jié)構(gòu)，可均勻分散在水性介質(zhì)中且穩(wěn)定性好。其對(duì)DPPH自由基的清除率約為79.2%，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及枯草芽孢桿菌的抑制生長和殺滅作用顯著。本研究對(duì)柚子皮進(jìn)行球磨處理以促進(jìn)其活性還原性物質(zhì)的溶出，并以銀氨溶液為銀源，大大提高了AgNPs合成反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，制備得到了粒徑小、分布均勻、可穩(wěn)定分散，并同時(shí)具有抗菌和抗氧化性能的AgNPs。本研究一方面使柚子皮廢棄物得到了高值化利用，另一方面為AgNPs的綠色高效合成提供了新的思路，為其AgNPs在食品活性包裝中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)仍需對(duì)柚子皮提取液合成AgNPs的機(jī)理以及AgNPs在食品包裝中的應(yīng)用效果進(jìn)行進(jìn)一步研究。