黃豆發(fā)酵與牛乳發(fā)酵酸奶的細(xì)菌多樣性分析

謝遼遼，丁云龍，鄧慧琳，吳念，田星,2*

1(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長沙，410208)2(湖南省康德佳林業(yè)科技有限責(zé)任公司，湖南 永州，425600)3(中國檢驗認(rèn)證集團湖南有限公司，湖南 長沙，410007)

如今，牛奶過敏、乳糖不耐癥、高膽固醇血癥以及對素食主義的青睞等影響了消費者對于牛乳替代品的選擇[1]。盡管以乳制品為基礎(chǔ)的功能性食品種類非常豐富，但植物源性乳作為乳制品的可持續(xù)替代品，因其豐富的營養(yǎng)價值以及能夠緩解畜牧業(yè)對環(huán)境的巨大壓力而受到廣泛關(guān)注[2]?！?020～2025年中國植物蛋白飲料行業(yè)市場需求與投資規(guī)劃分析報告》指出，在食品行業(yè)未來幾年的發(fā)展中，植物乳制品將有希望保持20%以上的平均增長速度。植物基蛋白發(fā)酵酸奶是以大豆、椰子等植物原料作為基底，輔以代糖、檸檬酸等其他原料，經(jīng)菌株發(fā)酵后得到的酸奶[3]。而作為一種優(yōu)質(zhì)植物源性原料，大豆具有高蛋白營養(yǎng)、植物甾醇和多不飽和脂肪酸以及低成本效益等特點[4]，同時其所含的肽類已被證明具有抗氧化、抗癌、抗菌、免疫調(diào)節(jié)和胰島素調(diào)節(jié)等特性，因此，大豆成為了近年來功能性食品研究的新熱點。

對發(fā)酵乳制品中微生物多樣性的研究，傳統(tǒng)方法在多數(shù)情況下采用分離培養(yǎng)，但是在各種環(huán)境樣品中僅有小于1%的微生物能獲得純培養(yǎng)。而如變性梯度凝膠電泳、熒光原位雜交等傳統(tǒng)免培養(yǎng)技術(shù)能檢測到的微生物種類有限且準(zhǔn)確性低?；诟咄繙y序技術(shù)的宏基因組學(xué)技術(shù)則可對生態(tài)位中提取的所有微生物DNA進行深度測序和分析，鑒定其物種組成、菌群結(jié)構(gòu)和表征群落豐度，具有讀長高、精度高、通量高、無偏性等優(yōu)勢。同時，技術(shù)的發(fā)展和成熟也使得高通量測序更多地用于乳制品及其他領(lǐng)域微生物群落分析，如用高通量測序研究腌制麻竹筍中細(xì)菌群落的動態(tài)演替[5]；分析新疆不同地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬的微生物群落多樣性[6]；分析西藏牦牛酸奶菌群多樣性[7]；評價不同飼料源附近生微生物群及其對納皮爾草發(fā)酵品質(zhì)和微生物多樣性的影響[8]。

目前對酸奶微生物多樣性的研究多數(shù)以牛乳為原料，對植物蛋白發(fā)酵酸奶與動物蛋白發(fā)酵酸奶進行對比的研究甚少，而進一步開發(fā)植物蛋白中特殊的微生物資源將逐漸成為研究的熱點。植物蛋白酸奶雖然具有廣闊的發(fā)展前景，但仍要解決營養(yǎng)不均衡、發(fā)酵體系不穩(wěn)定等問題[1]。本研究通過對黃豆發(fā)酵酸奶和牛乳發(fā)酵酸奶中菌群組成、結(jié)構(gòu)和群落差異進行分析，探究植物蛋白與動物蛋白發(fā)酵乳品中細(xì)菌多樣性之間的聯(lián)系，以期為開發(fā)利用植物蛋白中微生物資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸菌酸奶發(fā)酵粉(經(jīng)典5菌型：保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌)，北京川秀科技有限公司；羅漢果糖，湖南華城生物資源股份有限公司；伊利無菌磚純牛奶，長沙市沃爾瑪超市；FastDNA?Spin Kit for Soi DNA抽提試劑盒，美國MP Biomedicals 公司；NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建庫試劑盒，美國Bioo Scientific公司；biowest agArose瓊脂糖，西班牙biowest公司；MiSeq Reagent Kit v3測序試劑盒，美國Illumina公司；FastPfu Polymerase，中國TransGen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

N13462C移液器、5424R高速臺式冷凍離心機，德國Eppendorf公司；ABSON MiFly-6小型離心機，合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司；GeneAmp?9700 PCR儀，美國ABI公司；QuantusTMFluorometer微型熒光計，美國Promega公司；Illumina MiSeq測序儀，美國Illumina公司；ELx800酶標(biāo)儀，美國Biotek公司；TL-48R粉碎研磨儀，上海萬柏生物科技有限公司；QL-901旋渦混合器，海門其林貝爾儀器制造有限公司；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 純黃豆、純牛乳發(fā)酵酸奶的制備

以純黃豆發(fā)酵酸奶為例，黃豆冷水浸泡10 h后熱開水浸泡15 min，榨汁并加入1.5 g瓊脂，過濾后加入13 g羅漢果糖，經(jīng)25～30 MPa均質(zhì)處理后95 ℃高溫滅菌10 min，待混合物降溫至40 ℃，接種1.0 g乳酸菌發(fā)酵粉進行發(fā)酵處理，于42 ℃恒溫發(fā)酵6.5 h，經(jīng)殺菌包裝后于低溫下冷藏保存。牛乳發(fā)酵酸奶原料采用牛乳替代黃豆汁，其余流程與純黃豆發(fā)酵酸奶相同，無糖樣本不添加羅漢果糖。黃豆發(fā)酵酸奶制備工藝流程如圖1所示。取1～2 g酸奶樣本置于無菌凍存管中，做3個平行，共12個樣本于-80 ℃保存。

圖1 純黃豆發(fā)酵酸奶制備工藝流程圖Fig.1 The production process flow chart of soy fermented yoghurt

1.3.2 理化指標(biāo)的測定

水分含量參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》中的直接干燥法測定；灰分含量參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》；脂肪含量參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》索氏抽提法測定；蛋白質(zhì)含量參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法測定；碳水化合物含量通過組分總量減去水分、灰分、脂肪和蛋白質(zhì)的組分含量測得；鈉含量參照GB 5009.91—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鉀、鈉的測定》中的火焰原子吸收光譜法測定。

1.3.3 菌群DNA抽提和PCR擴增測序

酸奶菌群DNA提取參照李薇等[5]、戈子龍等[9]的方法稍作改良。以338F-806R(468 bp)為引物，擴增細(xì)菌16S rRNA V3-V4可變區(qū)。PCR擴增具體體系為5×FastPfu Buffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、Forward Primer 0.8 μL、Reverse Primer 0.8 μL、FastPfu Polymerase 0.4 μL、BSA 0.2 μL、Template DNA 10 ng，補ddH2O至20 μL。PCR擴增具體程序為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s重復(fù)進行27次，72 ℃延伸10 min。Picogreen染料熒光計對PCR產(chǎn)物進行定量均一化混勻，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Miseq PE300平臺測序。上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成PCR擴增及測序工作。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS Statistics 25.0軟件對理化指標(biāo)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。基于美吉生物云平臺對環(huán)境微生物群落進行交互式分析并對數(shù)據(jù)進行處理。質(zhì)控采用FASTP軟件[10]，拼接在FLASH軟件[11]上進行。根據(jù)97%[12-13]的相似度在UPARSE軟件[13]上對序列進行操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)聚類、剔除嵌合體。通過RDP classifier[14]進行物種分類注釋，比對閾值70%(Silva 16SrRNA數(shù)據(jù)庫-v138)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序信息統(tǒng)計

通過測序12個樣品共產(chǎn)生564 314個序列數(shù)。去除葉綠體、線粒體等背景污染、抽平序列后的有效序列數(shù)為557 197，平均長度為428 bp，其中純黃豆發(fā)酵酸奶有271 452個序列數(shù)，純牛乳發(fā)酵酸奶有285 745個序列數(shù)。通過OTU聚類，總共匯聚成116個OTU。詳細(xì)數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 測序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計表Table 1 The statistical table of sequencing data results

2.2 純黃豆、牛奶發(fā)酵酸奶菌群多樣性分析

2.2.1 稀釋曲線和α-多樣性分析

當(dāng)測序深度逐漸增加時，稀釋曲線趨近于平緩(圖2)，2組發(fā)酵酸奶樣本在測序覆蓋度上沒有顯著差異，所有測序覆蓋度高于99.99%以上，說明對純黃豆、純牛乳發(fā)酵酸奶微生物群落的檢測率接近飽和，測序量能夠覆蓋酸奶中的絕大部分物種。

圖2 Shannon指數(shù)稀釋曲線Fig.2 The Shannon exponential dilution curve

對純黃豆發(fā)酵酸奶(SY)和純牛乳發(fā)酵酸奶(LR2)微生物群落多樣性指數(shù)進行分析(表2)。指數(shù)組間差異檢驗結(jié)果如圖3所示。

表2 基于T檢驗的α-多樣性指數(shù)表Table 2 α-Diversity index table based on T test

圖3 指數(shù)組間差異檢驗柱形圖Fig.3 Histogram of difference test between index groups注：***表示存在極顯著性差異(P<0.01)

兩組樣本檢測到包括Chao指數(shù)(P=0.907 6)和Ace指數(shù)(P=0.459 1)的群落OTU豐富度沒有顯著性差異。然而，兩組樣本的群落多樣性指數(shù)，包括Shannon指數(shù)(P≤0.001)和Simpson指數(shù)(P≤0.001)具有極顯著性差異，表明黃豆發(fā)酵酸奶細(xì)菌多樣性高于牛乳發(fā)酵酸奶。

2.2.2 Beta多樣性分析

純黃豆、純牛乳發(fā)酵酸奶通過置換多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA)，黃豆樣本、牛乳樣本組間菌群結(jié)構(gòu)差異極顯著大于組內(nèi)差異(R=0.577 8，P=0.003<0.01)(圖4)，本次實驗分組具有意義。

圖4 基于Bray-Curtis的組間距離盒狀圖Fig.4 The box plot of distance between groups based on Bray-Curtis

主坐標(biāo)分析結(jié)果表明(圖5)，在OTU水平上，黃豆樣本、牛乳樣本分別聚集在一起(R2=0.207 5，P=0.039)，第1主成分對樣本菌群結(jié)構(gòu)差異解釋度所占比重為39.15%，第2、第3主成分分別為21.13%、14.37%，黃豆樣本與牛乳樣本組間群落組成差異極其顯著(P<0.05)。

圖5 基于unweighted_unifrac的細(xì)菌群落主坐標(biāo)分析3D圖Fig.5 The PCoA-3D of bacterial community based on unweighted_unifrac

2.3 純黃豆、牛乳發(fā)酵酸奶中營養(yǎng)成分和細(xì)菌菌群的組成及差異分析

2.3.1 營養(yǎng)指標(biāo)分析

如表3所示，水分、脂肪和碳水化合物的含量在黃豆樣本和牛乳樣本中有顯著性的差異；黃豆無糖、牛乳無糖樣本水分含量明顯高于黃豆代糖、牛乳代糖樣本；黃豆無糖、牛乳無糖樣本碳水化合物含量遠(yuǎn)低于黃豆代糖、牛乳代糖樣本。由此可知，原料不同對于發(fā)酵酸奶中主要營養(yǎng)組分的含量具有一定的影響。

表3 黃豆、牛乳發(fā)酵酸奶的營養(yǎng)指標(biāo)分析 單位：g/100 g

2.3.2 細(xì)菌菌群的組成及差異分析

通過菌群組成分析，屬水平上共測得12個屬(圖6-a)，鏈球菌屬(Streptococcus)在黃豆樣本和牛乳樣本菌群中均占主要優(yōu)勢。除鏈球菌屬外(圖6-b)，芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)僅在黃豆樣本中存在；棒狀桿菌屬(Corynebacterium)僅在黃豆無糖5(SY_5)樣本中存在；伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)僅在牛乳樣本中存在；摩根氏菌屬(Morganella)、漫游球菌屬(Vagococcus)、假紅桿菌屬(Pseudorhodobacter)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、泰式菌屬(Tissierella)在黃豆樣本和牛乳樣本中均存在。鏈球菌屬以及乳桿菌屬在發(fā)酵過程中進行微弱的水解作用，有助于維持較高的發(fā)酵活性，經(jīng)常用于混合發(fā)酵以制備大豆酸奶[15]。門水平上，共測得2個門：厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，其中厚壁菌門在黃豆、牛乳樣本中均占主要優(yōu)勢，這與張敏等[16]對酸奶中微生物多樣性的研究結(jié)果相一致。

通過LEfSe多級物種層級分析顯示(圖7-a)，從目水平來看，芽孢桿菌目(Bacillales)在黃豆樣本顯著富集，而在牛乳樣本大量富集乳酸桿菌目(Lactobacillales)；從種水平來看，枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillus

a-屬水平上細(xì)菌群落；b-隱去鏈球菌屬的細(xì)菌群落圖6 屬水平下的群落柱狀圖Fig.6 The histogram of the community at the genus level

subtilissubsp.subtilis)在黃豆樣本顯著富集，牛乳樣本唾液鏈球菌嗜熱亞種(Streptococcussalivariussubsp.thermophilus)顯著富集。線性判別分析(linear discriminant analysis, LDA)(LDA閾值>1.0)(圖7-b)表明，對牛乳、黃豆樣本菌群結(jié)構(gòu)差異具有顯著影響的物種主要包括芽孢桿菌屬(Bacillus)和鏈球菌屬(Streptococcus)(P<0.01)。

a-LEfSe多級物種層級分析;b-LDA圖圖7 純黃豆、純牛乳發(fā)酵酸奶菌群差異分析圖Fig.7 The difference analysis of bacterial flora between pure soybean and pure milk fermented yoghurt

2.3.3 主要營養(yǎng)成分與優(yōu)勢菌屬的相關(guān)性分析

通過SPSS 25.0和TB tools軟件，將黃豆、牛乳發(fā)酵酸奶中主要營養(yǎng)成分含量與其菌群中主要優(yōu)勢菌屬(鏈球菌屬)豐度進行相關(guān)性分析(圖8)?？芍?、脂肪和碳水化合物含量與菌群優(yōu)勢菌屬豐度值呈極顯著相關(guān)；蛋白質(zhì)、鈉含量與菌群優(yōu)勢菌屬不相關(guān)(P>0.05)。結(jié)合營養(yǎng)指標(biāo)分析數(shù)據(jù)(表3)可推測得，原料中有無添加植物代糖對黃豆、牛乳發(fā)酵酸奶中細(xì)菌菌群種類有一定的影響，后續(xù)對此結(jié)論進行了深入的分析與證實。

圖8 酸奶組分與主要菌群菌屬相關(guān)性熱圖Fig.8 Heat map of correlation between yogurt components and flora

2.4 植物代糖對黃豆、牛乳發(fā)酵酸奶中微生物菌群的影響

本研究從是否添加代糖的角度對2組樣本進行層級聚類(圖9)，添加代糖樣本(SY_4、SY_5、SY_6、LR2_4、LR2_5、LR2_6)，未添加代糖樣本(SY_1、SY_2、SY_3、LR2_1、LR2_2、LR2_3)。根據(jù)分析結(jié)果，共聚成兩大分支，第一大分支為黃豆無糖樣本，第二大分支為其他樣本。第二大分支中，6個牛乳樣本所屬同一個小分支，不論有無植物代糖，6個樣本分支距離皆小，說明樣本特征值組成差異較小，即對于純牛乳發(fā)酵酸奶，添加代糖與否對菌群差異的影響較?。挥刑屈S豆樣本分別屬于2個小分支,其中SY_2無糖與SY_5有糖黃豆樣本屬于同一小分支的原因還需要進一步實驗探究?？沙醪脚卸?，有無添加植物代糖對黃豆樣本群落組成有一定的影響。因此，可從有無添加植物代糖的角度對豆類等植物源性發(fā)酵酸奶中植物代糖對人體腸道菌群的影響。

圖9 基于Bray-Curtis的樣本層級聚類樹Fig.9 The sample level clustering tree on Bray-Curtis

2.5 對黃豆、牛乳樣本中微生物群落功能組成的預(yù)測

普通酸奶是牛奶經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵而成，有改善腸道微環(huán)境的作用[17]，但以植物蛋白為原料的發(fā)酵酸奶對人體腸道菌群、健康功能的影響目前所知甚少。本研究對牛乳與黃豆樣本菌群KEGG pathway進行功能組成分析，得到的KEGG功能預(yù)測信息組成基本相同(圖10)，12份樣品的細(xì)菌群落組成雖存在明顯差異(圖6)，但基因功能一致，只是部分功能豐度變化有所不同，原因可能是不同菌群所具有的基因功能具有相似性[18]。

圖10 KEGG功能熱圖Fig.10 The heat map of KEGG functions

菌群基因大多與碳水化合物代謝(9.93%)、氨基酸代謝(7.43%)、翻譯功能(3.91%)以及能量轉(zhuǎn)換(3.04%)有關(guān)，這與前人的研究結(jié)果具有相似性[19]，表明在發(fā)酵酸奶細(xì)菌基因組中包含大量參與蛋白質(zhì)、碳水化合物代謝相關(guān)的基因。黃豆、牛乳樣本具體在以下4個功能中豐度變化顯著不同：細(xì)胞運動(cell motility)、癌癥：特定類型(cancer:specific types)、排泄系統(tǒng)(excretory system)、物質(zhì)依賴(substance dependence)，且在黃豆酸奶樣本中豐度值均遠(yuǎn)大于在牛乳酸奶樣本中，這與前人的研究結(jié)果有一定的關(guān)聯(lián)性，即食用豆制品被證明可以降低患心血管疾病[20]、癌癥(乳腺癌和前列腺癌)和骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險，但不能明確地表明作用機制，應(yīng)該進一步研究驗證植物蛋白發(fā)酵酸奶為腸道菌群變化而帶來的健康益處及具體作用機制。

3 結(jié)論

黃豆發(fā)酵酸奶細(xì)菌多樣性顯著高于牛乳發(fā)酵酸奶，黃豆發(fā)酵酸奶與牛乳發(fā)酵酸奶組間菌群結(jié)構(gòu)及群落組成差異極其顯著。對黃豆、牛乳樣本菌群結(jié)構(gòu)差異有顯著影響的物種主要包括鏈球菌屬和芽孢桿菌屬，鏈球菌屬在黃豆、牛乳樣本中均為優(yōu)勢屬。初步判定，有無添加植物代糖對純黃豆發(fā)酵酸奶群落組成有一定的影響，可從此方面對其進行更深入的探究。KEGG pathway功能組成分析發(fā)現(xiàn)，在以下4個功能中樣本豐度變化顯著不同：細(xì)胞運動、癌癥：特定類型、排泄系統(tǒng)、物質(zhì)依賴，且從豐度值來看，黃豆樣本中均遠(yuǎn)大于牛乳樣本，此發(fā)現(xiàn)可為后續(xù)對植物蛋白基因功能等方面的深入探究提供參考。因此，本研究通過對純黃豆、牛乳發(fā)酵酸奶中細(xì)菌多樣性進行分析，為探究植物蛋白與動物蛋白發(fā)酵乳品中細(xì)菌多樣性之間的聯(lián)系提供借鑒。植物基發(fā)酵酸奶有很大潛力成為一種新型的功能性食品，然而隨著消費者偏好的變化和發(fā)酵過程的進步，需要對植物蛋白乳制品及其他發(fā)酵食品中的微生物資源進行更深層次研究，以優(yōu)化植物蛋白酸奶發(fā)酵工藝條件以及菌種優(yōu)良選育，改善人體腸道健康以及自然環(huán)境可持續(xù)發(fā)展。