艾灸足三里、太溪對腎虛-黃體抑制流產(chǎn)模型孕鼠蛻膜組織細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

胡 珊 陳鵬典 寧 艷 馬 飛 劉昱磊 邱婷婷 覃曉玲 唐 夢

南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院中醫(yī)科，廣東深圳 518028

自然流產(chǎn)是目前全球生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點難點，發(fā)生在妊娠12 周內(nèi)稱為早期自然流產(chǎn)。近年研究[1-2]表明，細(xì)胞凋亡是調(diào)控細(xì)胞增殖、保證胎盤組織結(jié)構(gòu)和功能的重要調(diào)控機制，妊娠過程中胎盤絨毛和蛻膜的細(xì)胞凋亡與增殖處于一種相對平衡的狀態(tài)，當(dāng)這種平衡被打破可能影響妊娠結(jié)局?，F(xiàn)代研究[3]發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥可通過調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌功能和免疫因子功能、協(xié)調(diào)母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞增殖凋亡及改善胎盤微循環(huán)障礙等環(huán)節(jié)干預(yù)自然流產(chǎn)。本課題組前期臨床研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，“補腎健脾”中藥可一定程度改善早期妊娠先兆流產(chǎn)患者焦慮情緒狀態(tài)及免疫和凝血功能，提高保胎療效。在此基礎(chǔ)上，觀察“補腎健脾”灸法對腎虛-黃體抑制流產(chǎn)模型孕鼠蛻膜組織相關(guān)凋亡細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響，以探討艾灸防治早期流產(chǎn)的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選購廣東省實驗動物中心SD 大鼠雄性16 只、雌性36 只，周齡8～10 周，體重220～250 g，許可證號為SCXK（粵）2018-0002，實驗動物使用許可證號為SYXK（粵）2020-0230。購入后于SPF 實驗動物中心空調(diào)下架式單籠喂養(yǎng)，環(huán)境溫度20～25℃，濕度50%～60%，光照、黑暗各12 h 交替，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料、滅菌注射用水喂養(yǎng)。本實驗已通過深圳拓普生物科技有限公司動物實驗福利和倫理審查（TOP-IACUC-2020-07-0011）。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 主要儀器 超凈工作臺（型號：YJ-VS-1，無錫一凈凈化設(shè)備有限公司）；倒置顯微鏡（型號：Mshot MF53，廣州明美光電有限公司）；生物組織包埋機（型號：EG11504，德國Leica 公司）；組織脫水機（型號：ASP3 00S，德國Leica 公司）；冷卻臺（型號：EG1150C，德國Leica 公司）；石蠟切片機（型號：RM2235，德國Leica公司）等。

1.2.2 試劑 地屈孕酮片（360397，10 mg/片，荷蘭Abbott公司）；米非司酮片（200402，25 mg/片，廣州朗圣藥業(yè)有限公司）；羥基脲片（0B0193D05，0.5 g/片，齊魯制藥有限公司）；TUNEL 檢測試劑盒（G1507，塞維爾生物科技有限公司）；大鼠抗Bcl-2 多克隆抗體（12789-1-AP）、大鼠抗Caspase-3 多克隆抗體（19677-1-AP）、大鼠抗Bax 多克隆抗體（50599-2-Ig）均來自Proteintech 公司；清艾條（200505，江蘇康美制藥有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組、造模與干預(yù)治療 雌鼠（36 只）和雄鼠（16 只）合籠交配。合籠第1 天晨起雌鼠行陰道涂片，觀察到大片精子及陰道栓脫落作為妊娠第1 天[6]。選取32 只孕鼠采用隨機數(shù)字表法將其分為正常組、模型組、地屈孕酮組和艾灸組，每組8 只。其他四只雌鼠未妊娠。除正常組以外，其他組均采用“羥基脲+米非司酮”造模[7]：從妊娠第1 天開始，每天上午正常組予4 ml生理鹽水灌胃；模型組予2 ml 蒸餾水灌胃；造模同時，地屈孕酮組予生理鹽水＋地屈孕酮片（3.02 mg/kg）2 ml/d 灌胃；艾灸組予艾灸雙側(cè)足三里和太溪穴，其定位參照大鼠常用針灸穴位[8]，用艾條懸灸以上兩組穴位，持續(xù)時間為15 min/（次·穴），每日1 次至動物處死。下午除正常組予蒸餾水灌胃外，其余各組均予生理鹽水＋羥基脲（450 mg/kg）1 ml 灌胃，共9 d。在妊娠第10 天早上除正常組外，其余各組均分別加用米非司酮（RU486）4.0 mg/kg，以造成腎虛-黃體抑制流產(chǎn)模型。孕鼠出現(xiàn)形體消瘦，精神萎靡，毛色枯槁，喜蜷縮，脫毛，小便頻且清長，納呆，甚至出現(xiàn)陰道出血，提示造模成功[9]。

1.3.2 標(biāo)本制備與采集 各組均在妊娠第11 天（除正常組外，其他組均在灌服米非司酮24 h 后）處死大鼠，取子宮濾紙吸干，計算胚胎數(shù)并測量子宮直徑。將取得的新鮮蛻膜組織用甲醛溶液固定、石蠟包埋、組織切片、TUNEL 檢測及免疫組化等制作。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.4.1 一般情況 觀察大鼠的精神狀態(tài)、鼠毛、納食、大小便及活動情況等。

1.4.2 免疫組織化學(xué)法測定Bax、Bcl-2 和Caspase-3蛋白的表達(dá) 將石蠟切片用二甲苯及梯度酒精脫蠟至水，經(jīng)EDTA 抗原修復(fù)，并按標(biāo)準(zhǔn)分別使用5%山羊血清、分別予兔抗大鼠Bax 多克隆抗體（1∶200 稀釋）、兔抗大鼠Bcl-2 多克隆抗體（1∶200 稀釋）、兔抗大鼠Caspase-3 多克隆抗體（1∶200 稀釋）、兔抗大鼠Fas 多克隆抗體（1∶200 稀釋）、兔抗大鼠FasL 多克隆抗體（1∶200 稀釋）、兔抗大鼠P53 多克隆抗體（1∶200 稀釋）及兔抗大鼠CDKN1A 多克隆抗體（1∶200 稀釋），4℃過夜，PBS 沖洗，二抗孵育，DAB 顯色，蘇木精返藍(lán)液返藍(lán)，梯度酒精二甲苯脫水，中性樹膠封片等操作后，在顯微鏡下觀察棕色陽性點，高倍鏡（100×）下隨機選擇5 個不重疊的視野；采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)，選用陽性區(qū)域積分光密度（optical density，OD）及陽性面積行統(tǒng)計分析，并計算陽性表達(dá)的平均OD 值。

1.4.3 TUNEL 法測定原位細(xì)胞凋亡 檢測遵照試劑盒說明書進(jìn)行。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，新鮮稀釋的蛋白酶K 溶液消化，TBS 沖洗；加3%H2O2；加100 μl 1×TdT 平衡緩沖液，室溫孵育。加標(biāo)記反應(yīng)混合液，TBS洗；加終止緩沖液，室溫孵育；加封閉緩沖液；加稀釋過的1×偶聯(lián)物，室溫孵育；加DAB 顯色液，室溫孵育；dH2O 漂洗，甲基綠復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。凋亡指數(shù)（apoptosisindex，AI）=凋亡細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，計數(shù)資料采用例數(shù)表示。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

造模期間，與正常組比較，模型組孕鼠形體消瘦，精神萎靡，毛色枯槁，喜蜷縮，脫毛明顯，小便頻且清，納呆，妊娠約第6 天開始逐漸出現(xiàn)陰道出血；地屈孕酮組和艾灸組均可改善腎虛-黃體抑制流產(chǎn)模型一般體征，減少其陰道出血癥狀。

2.2 各組大鼠子宮直徑及宮內(nèi)胚胎數(shù)比較

與正常組比較，模型組大鼠子宮直徑減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；與模型組比較，艾灸組子宮直徑均增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；正常組和模型組，模型組和艾灸組宮內(nèi)胚胎總數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠子宮直徑及宮內(nèi)胚胎數(shù)比較（）

表1 各組大鼠子宮直徑及宮內(nèi)胚胎數(shù)比較（）

注 與正常組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05

2.3 各組大鼠蛻膜組織Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白平均OD 值及細(xì)胞AI 值比較

各組大鼠蛻膜組織Bax、Bcl-2 蛋白陽性染色位于細(xì)胞漿，Caspase-3 蛋白陽性染色位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，均呈棕黃色，Bax、Caspase-3 蛋白在正常組、地屈孕酮組及艾灸組中分布較為稀疏，在模型組分布較密集。見圖1。與正常組比較，模型組Bax、Caspase-3蛋白平均OD 值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），與模型組比較，艾灸組Bax、Caspase-3 蛋白平均OD值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2。Bcl-2蛋白在正常組、地屈孕酮組及艾灸組中分布較為密集，在模型組分布較為稀疏，且在地屈孕酮組染色較為明顯，正常組及艾灸組次之，模型組染色較輕。見圖1。與正常組比較，模型組Bcl-2 蛋白平均OD 值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），與模型組比較，艾灸組Bcl-2 蛋白平均OD 值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2。凋亡細(xì)胞陽性染色主要位于細(xì)胞核，呈棕黃色-黃色，在模型組中凋亡蛋白表達(dá)較為密集。見圖2。與正常組比較，模型組細(xì)胞AI 值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），與模型組比較，艾灸組細(xì)胞AI 值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠蛻膜組織Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白平均OD 值及AI 值比較（）

表2 各組大鼠蛻膜組織Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白平均OD 值及AI 值比較（）

注 與正常組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。OD：光密度；AI：凋亡指數(shù)

圖1 四組大鼠蛻膜組織Bax、Bcl-2 和Caspase-3 蛋白表達(dá)水平（免疫組化法染色，100×）

圖2 四組原位凋亡細(xì)胞表達(dá)比較（TUNEL 法，100×）

3 討論

細(xì)胞凋亡是機體清除病理性受損組織的一種重要途徑[10]。妊娠過程中，適當(dāng)?shù)牡蛲龀绦蚩纱龠M(jìn)蛻膜組織結(jié)構(gòu)改建并完善其功能，但過度表達(dá)，尤其在妊娠早期，可引起蛻膜變性壞死，影響胚胎的正常發(fā)育，導(dǎo)致自然流產(chǎn)[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)[13]，蛻膜細(xì)胞發(fā)生凋亡時Bcl-2 與Bax 保持一個相對平衡，當(dāng)Bcl-2 過量表達(dá)時，則細(xì)胞存活；反之則導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。由此，研究者推測蛻膜細(xì)胞Bcl-2/Bax 比值降低會影響妊娠結(jié)局[14]。Caspase 蛋白酶也可通過線粒體途徑介導(dǎo)Bax 表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C 從線粒體釋放出來，激活Caspase-3，引發(fā)Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，引起蛻膜細(xì)胞凋亡[15]。

中醫(yī)認(rèn)為，自然流產(chǎn)與脾腎功能不足有關(guān)，名醫(yī)羅元愷教授根據(jù)“腎主生殖”理論提出“腎-天癸-沖任-子宮軸”概念，和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“下丘腦-垂體-卵巢軸”相似[16]。據(jù)此羅頌平教授團隊首創(chuàng)以羥基脲和米非司酮制備腎虛-黃體抑制（病證結(jié)合）流產(chǎn)大鼠模型[17-18]。該模型模擬了臨床上妊娠期腎虛和黃體抑制導(dǎo)致自然流產(chǎn)的病理狀態(tài)，表現(xiàn)出腎虛癥狀、外周血孕酮水平下降、蛻膜孕激素受體表達(dá)被抑制等，均符合腎虛和黃體不健的早期先兆流產(chǎn)臨床表現(xiàn)。研究證實[19-20]，灸法可改善卵巢儲備功能減退大鼠卵巢臟器指數(shù)及組織學(xué)形態(tài)，調(diào)整大鼠動情周期、血清性激素和炎癥因子水平，并可降低先兆流產(chǎn)患者外周血Th17水平和Th17/Treg 比值，改善其妊娠結(jié)局。并可雙向調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)[21-22]。其機制是通過光熱傳導(dǎo)刺激神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)發(fā)揮效應(yīng)，是多靶點、多通道、多機制的綜合網(wǎng)絡(luò)效果[23]。本研究所選穴位足三里及太溪具有補腎健脾之功，在動物實驗中發(fā)現(xiàn)[24-25]，二者對Bcl-2/Bax 比值及Caspase-3 蛋白表達(dá)均具有雙向調(diào)節(jié)作用。

本研究結(jié)果示，與正常組比較，模型組Bax、Bcl-2和Caspase-3 蛋白表達(dá)異常，其凋亡細(xì)胞明顯增多，提示腎虛-黃體抑制模型大鼠流產(chǎn)與蛻膜組織細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。艾灸足三里和太溪穴可明顯改善其流產(chǎn)情況和相關(guān)指標(biāo)，且可達(dá)到與地屈孕酮相似的效果，提示艾灸足三里和太溪穴可通過上調(diào)腎虛-黃體抑制流產(chǎn)孕鼠蛻膜組織Bcl-2 蛋白表達(dá)并下調(diào)其Bax和Caspase-3 蛋白過量表達(dá)，降低其AI 值，從而調(diào)控母胎界面細(xì)胞凋亡，發(fā)揮干預(yù)早期流產(chǎn)的作用。灸法無痛、無創(chuàng)傷的特點在臨床上接受性強，依從性高，具有很好的臨床價值。因此，后續(xù)大樣本的臨床研究具有重要的臨床意義。而對于艾灸發(fā)揮其他的作用如調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌功能、調(diào)節(jié)免疫因子功能、改善胎盤微循環(huán)障礙等機制有待作者在以后的研究工作中繼續(xù)闡明。