外周血miR-197聯(lián)合胃蛋白酶原在胃早癌診斷中的價(jià)值研究*

譚志慧 李芳芳 郭旺源 李愛娟

湖南省郴州市第一人民醫(yī)院 423000

胃癌是全球第四大惡性腫瘤之一，其死亡率與發(fā)病率僅次于肺癌，位居第二[1-2]。研究表明，相對(duì)于中晚期胃癌，胃早癌患者若及時(shí)采取治療措施，其5年生存率可遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過90%。但早期胃癌病情隱匿，因此多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，失去最佳治療時(shí)機(jī)。故早診斷、早治療是決定胃癌預(yù)后的關(guān)鍵。目前，胃鏡活檢雖然是胃癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[3]，但是該方法具有患者耐受度低的局限性，無法成為胃早癌常規(guī)篩查方式。胃蛋白酶原(Pepsinogen，PG)以經(jīng)濟(jì)、簡單、無創(chuàng)等優(yōu)勢在胃早癌篩查中備受青睞[4-5]，20世紀(jì)90年代，日本便運(yùn)用PG聯(lián)合幽門螺桿菌檢測確定胃早癌高危人群[6]。但胃癌的發(fā)生是多因素、多步驟、多基因參與的結(jié)果。如遺傳、幽門螺桿菌感染、吸煙、飲酒等均是胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，而胃黏膜萎縮、腸化生等均被視為癌前病變階段。同時(shí)隨著分子信息學(xué)的進(jìn)步，各國研究者均發(fā)現(xiàn)，miR可調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、生長、遷徙、周期及凋亡，與腫瘤的發(fā)生存在密切關(guān)系。miR-197是miRNA家族中的一員。多項(xiàng)研究報(bào)道，肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤患者外周血miR-197水平均有所上升。但鮮少學(xué)者研究miR-197與早期胃癌之間的相關(guān)性。為提高早期胃癌實(shí)驗(yàn)室診斷水平，本研究將PG與miR-197聯(lián)合進(jìn)行檢測，研究結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧分析2019年1月—2021年4月在本院接受胃鏡篩查的500例疑似胃癌患者臨床資料。根據(jù)病理檢查結(jié)果將其中胃早癌患者分為研究組(254例)，另將其中萎縮性胃炎、腸化生等胃部疾病患者分為對(duì)照組(246例)。同時(shí)依據(jù)胃鏡及病理檢查結(jié)果將對(duì)照組患者分為萎縮性胃炎組(83例)、腸化生組(82例)、異型增生組(81例)。其中研究組男134例，女120例；年齡32～72歲，平均年齡(52.68±20.14)歲。對(duì)照組男125例，女121例；年齡32～73歲，平均(52.78±20.57)歲；病變類型：萎縮性胃炎(83例)、腸化生(82例)、異型增生(81例)。研究組與對(duì)照組性別、年齡等基本資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①存在反酸、噯氣、腹部脹痛等上消化系統(tǒng)癥狀者。②同意接受胃鏡、組織穿刺活檢及血清檢查者。③年齡>18歲，且<80歲者。④血清PG、miR-197胃鏡及相關(guān)病理檢查資料齊全者。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①曾經(jīng)胃鏡檢及相關(guān)病理檢查證實(shí)，具有消化性潰瘍、消化道腫瘤、食管及十二指腸病變者。②近1個(gè)月之內(nèi)使用質(zhì)子泵抑制劑、鉍劑或抗生素者。③有消化道手術(shù)史者。④近2周之內(nèi)，服用華法林、阿司匹林等抗凝藥物者。⑤具有胃鏡檢查禁忌者。⑥合并心腦血管、肝臟、腎臟等組織器官嚴(yán)重器質(zhì)性病變的患者。⑦其他部位伴有惡性腫瘤的患者。

1.3 方法 血清PG檢測：全部患者均于胃鏡檢查前，空腹?fàn)顟B(tài)下抽取外周靜脈血5ml,并將其保存于抗凝試管中。以3 000r/min的速度離心10min，取上清液待檢。運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)(試劑盒購自廣州市豐華生物工程有限公司)測定胃蛋白酶原Ⅰ(PepsinogenⅠ，PG)、胃蛋白酶原Ⅱ(Pepsinogen Ⅱ，PGⅡ)。外周miR-197檢測：(1)RNA提?。簩⒀鍢颖痉湃?℃離心機(jī)中以16 000g離心力離心10min，清除細(xì)胞碎片后，將樣本置于-80℃冰柜中待檢。將200μl血清放于37℃水溶鍋中，并加入1 000μl(5倍體積血清)的QIAzol試劑，將血清完全溶解。靜置5min后，加入3.5μl的外參物(秀麗隱桿線蟲miR-39)，同時(shí)加入200μl氯仿，震蕩15s后，靜置2～3min。用4℃的臺(tái)式離心機(jī)以12 000g離心力離心15min，用1.5ml的PE管收集上層透明液，并加入900μl(1.5倍體積)的無水乙醇。將混合液700μl加入miRNA提取試劑盒。再運(yùn)用常溫臺(tái)式離心機(jī)以≥8 000g離心力離心15s，去除底層離心液體。將剩余液體再次放入miRNA提取試劑盒，以同樣方式離心，去除底層液體后，依次加入700μ lRWT試劑、500μl RPE試劑、500μl的80%乙醇并分別進(jìn)行離心后，用2ml新的PE管收集旋轉(zhuǎn)柱，再次離心5min，并去除底層離心液體，最后用1.5ml新的PE再次收集旋轉(zhuǎn)柱，將14μl無酶水加入旋轉(zhuǎn)柱子正中心表面，全速離心1min后洗提RNA。并用上海美譜達(dá)MAPADA紫外分光光度儀測定RNA純度與濃度。(2)反轉(zhuǎn)錄—定量酶合反應(yīng)：將賽默飛世爾科技中國生產(chǎn)的miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒于冰上解凍。準(zhǔn)備好反轉(zhuǎn)錄試劑及無RNA酶EP管，通過輕微離心或混勻使樣本沉于管低。將反轉(zhuǎn)錄條件依次設(shè)為37min、60min、95℃、5min、4℃、Forever。獲得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物后，將其置于冰上，并同時(shí)制備PCR反應(yīng)試劑。將PCR條件設(shè)置為，2μl的PCR產(chǎn)物、6μl的無酶水、95℃、34s、95℃、3s、60℃、30s、40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算獲得miR-197相對(duì)表達(dá)。

1.4 觀察指標(biāo) 比較研究組與對(duì)照組外周血miR-197、PGⅠ、PGⅡ水平；比較研究組、萎縮性胃炎組、腸化生組及異型增生組不同病理分型患者外周血miR-197、PGⅠ、PGⅡ水平。分析miR-197、PGⅠ、PGⅡ水平及聯(lián)合指標(biāo)對(duì)胃早癌的診斷價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 研究組與對(duì)照組外周血miR-197、PGⅠ及PGⅡ水平比較 研究組miR-197顯著高于對(duì)照組(P<0.05),而PGⅠ及PGⅡ顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 研究組與對(duì)照組外周血miR-197、PGⅠ及PGⅡ水平比較

2.2 不同病理分組患者外周血miR-197、PGⅠ及PGⅡ水平比較 萎縮性胃炎組、腸化生組、異型增生組及研究組外周血miR-197、PGⅡ及PGⅠ比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)LSD-t事后多重比較顯示，不同病理分組組間外周血miR-197比較結(jié)果為:研究組>異型增生組>腸化生組>萎縮性胃炎組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而不同病理分組外周血PGⅠ及PGⅡ組間比較結(jié)果為,萎縮性胃炎組>腸化生組>異型增生組>研究組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同病理分型患者外周血miR-197、PGⅠ及PGⅡ水平比較

2.3 外周血miR-197、PGⅠ、PGⅡ及聯(lián)合檢測因子對(duì)胃早癌的診斷價(jià)值 經(jīng)ROC曲線分析得出，miR-197、PGⅠ、PGⅡ及聯(lián)合預(yù)測因子共4項(xiàng)對(duì)胃早癌有著較高的診斷價(jià)值，其中聯(lián)合檢測因子與PGⅠ對(duì)早期胃癌診斷效能高于miR-197及PGⅡ，且比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表3。

圖1 外周血miR-197、PGⅠ、PGⅡ及聯(lián)合預(yù)測因子對(duì)胃早癌的

表3 外周血miR-197、PGⅠ、PGⅡ及聯(lián)合檢測因子對(duì)胃早癌的診斷價(jià)值

3 討論

我國是胃癌高發(fā)大國，據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年約35%的胃癌患者發(fā)生在中國，且隨著人們飲食結(jié)構(gòu)與生活方式的轉(zhuǎn)變，胃癌的發(fā)病率及死亡率有逐漸攀高趨勢[7-8]。目前，胃癌以其高發(fā)病率及高死亡率成為威脅國民生命健康的難治疾病之一。其中局限于胃內(nèi)壁黏膜及黏膜下層的癌變組織稱為胃早癌。相對(duì)于中晚期胃癌，通常胃早癌可通過胃鏡或內(nèi)鏡下進(jìn)行病灶切除，術(shù)后無須放化療，且預(yù)后良好。但早期胃癌癥狀隱匿，僅有小部分患者具有消化道規(guī)律性疼痛等不典表現(xiàn)。因此多數(shù)胃癌患者被確診時(shí)，已進(jìn)入中晚期，無論采取手術(shù)、化療、放療等方式治療，預(yù)后效果均較差。故早診斷、早治療是影響胃癌預(yù)后的關(guān)鍵所在。目前，多采用胃鏡及組織穿刺活檢對(duì)胃癌進(jìn)行診斷，其中組織穿刺活檢準(zhǔn)確性極高，可視為胃癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。但上述檢查方式存在一定創(chuàng)傷性，且患者耐受度及接受度均較低，因此無法作為胃早癌的常規(guī)篩查手段。因此臨床尋求經(jīng)濟(jì)、安全、高效的方式對(duì)胃早癌進(jìn)行診斷具有十分重要的意義。

PG是胃蛋白酶前體，可分為PGⅠ及PGⅡ兩種不同亞群[9]。其中PGⅠ主要由黏液頸細(xì)胞及胃底主細(xì)胞分泌，而PGⅡ不但能通過上述兩種細(xì)胞分泌，還可通過胃竇幽門腺、賁門腺及Brunner腺細(xì)胞分泌。因此血清PG的濃度可反映機(jī)體胃部的狀態(tài)[10]。本研究結(jié)果顯示，研究組外周血PGⅠ及PGⅡ水平顯著低于對(duì)照組，且外周血PGⅠ及PGⅡ水平隨萎縮性胃炎、腸化生、異型增生及胃早癌等胃部病變進(jìn)展而降低。分析原因?yàn)椋篜G主要來源于胃黏膜組織，當(dāng)胃黏膜發(fā)生病變后，胃部腺體亦會(huì)發(fā)生功能障礙，且隨著病情進(jìn)展，萎縮加重、腸化生、異性增生及致癌因子出現(xiàn)，進(jìn)一步破壞胃部腺體細(xì)胞，同時(shí)也可造成PG基因突變，失去分泌PG功能，故隨著病情進(jìn)展，外周血PG水平均顯著下降。但因PGⅠ僅來源于黏液頸細(xì)胞及胃底主細(xì)胞，黏膜病變時(shí)主細(xì)胞減少，故PGⅠ下降更顯著，而PGⅡ來源范圍較廣泛，組織內(nèi)濃度可保持相對(duì)穩(wěn)定，因此PGⅡ下降幅度比較平緩。故臨床稱PGⅠ為胃早癌的“血清活檢”。本研究經(jīng)ROC曲線分析得出，PGⅠ對(duì)胃早癌診斷效能更高，與上述結(jié)論基本一致。

雖然血清PG檢查在胃早癌的診斷中具有經(jīng)濟(jì)、簡便、高效等特點(diǎn)，但胃癌是多種因素、多個(gè)步驟參與的結(jié)果。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制與胃癌癥的發(fā)生也存在密切關(guān)系。生物信息學(xué)分分析發(fā)現(xiàn)，miRNA是由22個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，可通過參與細(xì)胞分化、增殖、代謝及凋亡等過程而參與多種腫瘤發(fā)生過程。其中miR-197是miRNA家族中的一員，多項(xiàng)研究證實(shí)其異常表達(dá)與乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤存在顯著關(guān)系。本研究結(jié)果表明，研究組miR-197顯著高于對(duì)照組，且隨著萎縮性胃炎、腸異生等病情進(jìn)展，外周血miR-197顯著升高，同時(shí)ROC曲線分析得出miR-197對(duì)胃癌早癌具有較高診斷價(jià)值。分析原因如下，miRNA通過調(diào)節(jié)炎癥通路炎性因子水平而在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。而miR-19可能為IL-IF5基因中的rs2472188位點(diǎn)靶結(jié)合點(diǎn)，當(dāng)miR-19與之結(jié)合后上調(diào)IL-IF5表達(dá)水平，而IL-IF5可調(diào)控IL-I家族、腫瘤壞死因子、集落刺激因子、巨噬細(xì)胞遷徙抑制因子等多種與胃癌相關(guān)的炎性通路信號(hào)因子表達(dá)，在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。故miR-19可間接通與IL-IF5基因結(jié)合，調(diào)控胃癌相關(guān)炎性因子表達(dá)而參與胃癌的發(fā)生，因此miR-19對(duì)早期胃癌具有一定診斷價(jià)值。

綜上所述：外周血miR-197、PGⅠ及PGⅡ?qū)ξ冈绨┚哂休^高診斷價(jià)值，其中PGⅠ與聯(lián)合預(yù)測因子診斷效能更高。