hsa-miR-200c-3p的靶基因預(yù)測及生物信息學(xué)分析*

蘇 倩 鄭 宏 王 娟 王棟洋，2

1 湘南學(xué)院臨床學(xué)院，湖南省郴州市 423000； 2 湘南學(xué)院附屬醫(yī)院

MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈小分子RNA，通過與靶基因mRNA的3’端非編碼區(qū)結(jié)合降解靶基因mRNA或者阻礙其翻譯。近年來miRNA在人類疾病中的作用不斷被揭示，尤其是惡性腫瘤[1]。miR-200c-3p是miR-200家族的重要成員，現(xiàn)有文獻(xiàn)資料多支持它與腫瘤密切相關(guān)[2]。研究顯示, miR-200c-3p在腎癌[3]、甲狀腺癌[4]、胃癌[5]等腫瘤中表達(dá)異常，并參與腫瘤進(jìn)展，有望成為這些腫瘤的治療靶點(diǎn)及預(yù)后生物標(biāo)志物。然而，目前對miR-200c-3p的研究尚淺，涉及的生物學(xué)過程和信號(hào)通路不完全清楚，針對其功能和作用機(jī)制研究具有重大現(xiàn)實(shí)意義。因此，本研究通過生物信息學(xué)方法對miR-200c-3p的靶基因集合進(jìn)行功能注釋和信號(hào)通路分析，為后續(xù)驗(yàn)證靶基因及其作用機(jī)制研究提供思路。

1 資料與方法

1.1 保守性分析 miRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/)是一個(gè)可供檢索的已發(fā)表的miRNA序列和注釋數(shù)據(jù)庫。從數(shù)據(jù)庫中獲取miR-200c-3p的染色體定位、堿基序列等信息，進(jìn)行保守性分析。

1.2 hsa-miR-200c-3p在組織器官和疾病中的表達(dá)分析 miRGator 3.0數(shù)據(jù)庫(http://www.mirgator.kobic.re.kr/)是深度測序時(shí)代的microRNA門戶，包括microRNA多樣性、表達(dá)譜、靶關(guān)系和各種支持工具，收集了73個(gè)人類樣本的深度測序數(shù)據(jù)集，包含41億條短序列和25億條匹配過的序列。通過miRGator v3.0數(shù)據(jù)庫，獲取hsa-miR-200c-3p在不同組織器官和疾病中的表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.3 預(yù)測靶基因 選擇miRDB(http://mirdb.org)和TargetScan 7.2 (http://www.targetscan.org/ vert _72/)在線軟件預(yù)測hsa-miR-200c-3p靶基因，取其交集。從miRTarBase數(shù)據(jù)庫(https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/)提取已通過熒光素酶報(bào)告基因檢測、Western blot和qPCR等強(qiáng)有力證據(jù)驗(yàn)證的靶基因。將預(yù)測的靶基因數(shù)據(jù)交集與實(shí)驗(yàn)已證實(shí)的靶基因合并，最終確定的靶基因集合用于后續(xù)分析。

1.4 GO和KEGG通路富集分析 利用DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫對靶基因集合進(jìn)行功能富集分析和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析。借助數(shù)據(jù)庫軟件附帶的Fisher Exact Test計(jì)算P值，以P<0.05 為顯著性閾值得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生物學(xué)過程和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

2 結(jié)果

2.1 miR-200c-3p的定位及保守性分析 miRbase數(shù)據(jù)庫查詢結(jié)果顯示，miR-200c-3p位于人染色體12p13.31區(qū)域。人類miR-200c-3p與褐家鼠、家鼠、家兔、獼猴、斑馬魚等10個(gè)物種的miR-200c-3p在堿基序列“AAUACUGCCGGGUAAUGAUG”區(qū)域具有高度相似性，表明miR-200c-3p在不同物種間高度保守。見表1。

表1 不同物種miR-200c-3p的成熟序列

2.2 hsa-miR-200c-3p的表達(dá)情況 結(jié)果顯示hsa-miR-200c-3p在不同器官中存在表達(dá)差異，其中在膀胱、胃腸道、腦、四肢、肺、前列腺等組織中表達(dá)豐度較高(見圖1)。與正常組織相比，hsa-miR-200c-3p在膀胱癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌等疾病表達(dá)水平較高(見圖2)。

圖1 hsa-miR-200c-3p在器官中的表達(dá)情況

2.3 靶基因的篩選 miRDB和Targetscan 7.2軟件預(yù)測hsa-miR-200c-3p靶基因分別為1 244個(gè)和44個(gè)，取其交集共獲得27個(gè)基因。結(jié)合miRTarBase數(shù)據(jù)庫查詢的已通過雙熒光素酶報(bào)告基因、Western blot、qPCR方法中至少經(jīng)兩種實(shí)驗(yàn)證實(shí)的靶基因共53個(gè)，其中有1個(gè)靶基因(KDR)與上述預(yù)測靶基因重合，最終獲得79個(gè)無重復(fù)候選靶基因，用于后續(xù)分析。

圖2 hsa-miR-200c-3p在疾病中的表達(dá)情況

2.4 GO和KEGG通路富集分析 GO和KEGG通路富集分析顯示，這些靶基因主要參與了細(xì)胞形態(tài)調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、血管生成、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物學(xué)過程(見表2) ，涉及PI3K-Akt、Ras、Rap1、黏著斑、MAPK、VEGF等信號(hào)通路，以及前列腺癌、小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、腎癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等疾病相關(guān)通路(見表3)。

表2 hsa-miR-200c-3p 靶基因的 GO 功能分析(生物學(xué)過程)

3 討論

miRNA作為轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控因子，參與人類多種生理病理過程，包括腫瘤的發(fā)生、分化、增殖、凋亡和侵襲，在惡性腫瘤中具有潛在的診斷、治療和預(yù)后價(jià)值[6]。近年來研究人員普遍關(guān)注miRNA異常表達(dá)與癌癥的關(guān)系，有報(bào)道稱miR-200c-3p參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展[7]。本研究通過對多個(gè)物種miR-200c-3p堿基序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)miR-200c-3p在人、褐家鼠、家鼠及家兔等物種在基因位置上保守, 序列上也呈現(xiàn)出高度同源性。miR-200c-3p高度的保守性，表明它在生物體內(nèi)可能編碼一些重要蛋白。文獻(xiàn)資料證實(shí)miR-200c-3p在甲狀腺癌[4]、胃癌[5]、膀胱癌[8]、卵巢癌[2]等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)。miRGator數(shù)據(jù)庫查詢顯示，miR-200c-3p在膀胱、胃腸道、肺、前列腺、甲狀腺等器官表達(dá)豐度較高；與正常組織相比，在膀胱癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌等表達(dá)水平較高。本研究發(fā)現(xiàn)與已知文獻(xiàn)資料基本一致，進(jìn)一步證明了本實(shí)驗(yàn)研究過程和分析的正確性與可靠性。

在實(shí)驗(yàn)中利用靶基因預(yù)測軟件共獲得79個(gè)候選靶基因，GO功能和信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)miR-200c-3p靶基因主要參與細(xì)胞形態(tài)調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)、細(xì)胞增殖、血管生成、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程；miR-200c-3p存在于前列腺癌、小細(xì)胞肺癌、腎癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種癌癥相關(guān)信號(hào)通路中，提示miR-200c-3p與多種癌癥存在密切關(guān)聯(lián)。從生物信息學(xué)分析結(jié)果而言，miR-200c-3p在腫瘤形成、進(jìn)展過程中扮演著重要角色。而現(xiàn)有的關(guān)于其調(diào)控作用的研究報(bào)道，亦證實(shí)了這一觀點(diǎn)。在甲狀腺癌中miR-200c-3p負(fù)向調(diào)節(jié)ATP2A2促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[4]；miR-200c-3p下調(diào)后可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[5]。在腎細(xì)胞癌中miR-200c-3p過表達(dá)后通過調(diào)控wnt/β-catenin信號(hào)通路靶向SOX2抑制細(xì)胞增殖、遷移與侵襲[3]。Li等[9]發(fā)現(xiàn)miR-200c-3p在腎母細(xì)胞瘤呈低表達(dá)，靶向調(diào)節(jié)FRS2抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。文獻(xiàn)資料提示了miR-200c-3p可靶向調(diào)控一些關(guān)鍵基因從而影響腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。

本研究靶基因預(yù)測結(jié)果顯示，miR-200c-3p可能調(diào)控 IKBKB、E2F3基因。IKBKB是組成IKK復(fù)合物重要的催化亞基之一，其對核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活起到重要調(diào)控作用，此前已被證明對細(xì)胞凋亡、耐藥等有重要影響。本研究發(fā)現(xiàn)IKBKB基因可能參與了PI3K-Akt、Ras、mTOR、NF-κB多條信號(hào)通路及前列腺癌、小細(xì)胞肺癌、胰腺癌等癌癥相關(guān)通路，表明IKBKB與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。最近該領(lǐng)域的研究進(jìn)展也揭示了IKBKB與癌癥生物學(xué)行為的發(fā)生相關(guān)。在腎癌中miR-21抑制PDCD4的表達(dá)，激活A(yù)kt-IKBKB軸，從而促進(jìn)遷移和侵襲[10]。而IKBKB/NF-κB參與了雙酚A誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞遷移[11]；IKBKB過表達(dá)可恢復(fù)miR-503抑制的非小細(xì)胞肺癌的惡性特性[12]。文獻(xiàn)提示其與腫瘤關(guān)系密切，但miR-200c-3p是否直接靶向調(diào)控IKBKB發(fā)揮抑癌或促癌作用，有待進(jìn)一步的科學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。另外，E2F3作為一種轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)E2F3在乳腺癌中促進(jìn)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。在結(jié)腸癌中，E2F3的表達(dá)與腫瘤分期顯著相關(guān)，E2F3高表達(dá)的患者具有較低生存率[14]。在肺癌組織中E2F3亦呈高表達(dá)，E2F3過表達(dá)與抗凋亡因子Bcl-2的上調(diào)相關(guān)[15]。資料表明E2F3在惡性腫瘤中可能具有臨床意義，可作為判斷預(yù)后不良的潛在生物標(biāo)志物。本研究通過生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)IKBKB、E2F3等可能是miR-200c-3p的潛在靶向調(diào)控基因，而miR-200c-3p可能通過調(diào)控這些重要基因影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。鑒于目前國內(nèi)外尚缺乏明確且直接的研究證據(jù)證實(shí)兩者為miR-200c-3p的靶向調(diào)控基因，需要后期補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

表3 hsa-miR-200c-3p 靶基因集合的KEGG通路富集分析結(jié)果

本研究從生物信息學(xué)角度證實(shí)了miR-200c-3p功能廣泛,可能通過調(diào)控IKBKB、E2F3等一些重要基因參與人類生命活動(dòng)和疾病過程，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用不容忽視，為進(jìn)一步研究其在腫瘤的作用和發(fā)生機(jī)制提供了有效的生物信息學(xué)基礎(chǔ)。