抗A 抗B 血型定型試劑的質(zhì)量分析

胡澤斌 于婷 孫彬裕 薄淑英 曲守方 黃杰

按照臨床輸血的要求，ABO 血型的鑒定必須以正、反定型試驗(yàn)結(jié)果相互參照來(lái)確定［1-3］。所謂正定型是指用標(biāo)準(zhǔn)抗A 和抗B 血型定型試劑來(lái)測(cè)定紅細(xì)胞上的A 抗原和B 抗原；反定型是指用標(biāo)準(zhǔn)A 型細(xì)胞和B 型細(xì)胞來(lái)測(cè)定血清或血漿中有無(wú)相應(yīng)的抗A 和抗B 抗體。ABO 血型正定型用抗A抗B 血型定型試劑（單克隆抗體）被列為血液篩查類(lèi)體外診斷試劑，按照藥品中的生物制品進(jìn)行批簽發(fā)管理［4-6］。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了4 家國(guó)產(chǎn)和2 家進(jìn)口抗A 抗B 血型定型試劑（單克隆抗體），用于臨床ABO 血型正定型鑒定。

中國(guó)食品藥品檢定研究院負(fù)責(zé)對(duì)抗A 抗B 血型定型試劑（單克隆抗體）進(jìn)行批簽發(fā)工作的具體實(shí)施，對(duì)該品種按照《中國(guó)藥典》［7］進(jìn)行全部檢驗(yàn)。本研究對(duì)4 家國(guó)產(chǎn)A 抗B 血型定型試劑（單克隆抗體）近5 年來(lái)的產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)分析，梳理此品種的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)，為保障血篩診斷試劑批簽發(fā)工作提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

O 型、B 型、A 型、A1型、A2型、A2B 型紅細(xì)胞，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；4 家待檢測(cè)試劑抗A 抗B 血型定型試劑（單克隆抗體），分別來(lái)自北京金豪制藥股份有限公司、河北醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心、上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司、長(zhǎng)春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品

抗A 抗B 血型定型試劑效價(jià)測(cè)定用國(guó)家參考品，批號(hào)：280020-201702，抗A 參考品為藍(lán)色凍干品，抗B 參考品為黃色凍干品，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.1.3 儀器

澄明度檢測(cè)儀（生產(chǎn)廠(chǎng)家：天津市精拓儀器科技有限公司，型號(hào)：YB-2型）、離心機(jī)（生產(chǎn)廠(chǎng)家：北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司，型號(hào)：DT5-3）、久保田離心機(jī)（生產(chǎn)廠(chǎng)家：日本株式會(huì)社久保田制作所，型號(hào)：KA-2200）、恒溫培養(yǎng)箱（生產(chǎn)廠(chǎng)家：上海一恒科技有限公司，型號(hào)：GHP-9080）、秒表（生產(chǎn)廠(chǎng)家：上海金雀表業(yè)有限公司，型號(hào)：J9-2 II）、微量移液器（生產(chǎn)廠(chǎng)家：艾本德（上海）國(guó)際貿(mào)易有限公司，型號(hào)：10～100 μL，100～1 000 μL）。

1.2 方法

按照《中國(guó)藥典》2020 版三部生物制品通則中對(duì)抗A 抗B 血型定型試劑（單克隆抗體）的成品檢定要求，對(duì)4 家抗A 抗B 血型定型試劑（單克隆抗體）成品進(jìn)行全部性能指標(biāo)的檢測(cè)，包括外觀(guān)、特異性、親和力、效價(jià)測(cè)定、冷凝集素和不規(guī)則抗體測(cè)試、穩(wěn)定性試驗(yàn)。

1.2.1 外觀(guān)

取待檢試劑5 支，打開(kāi)外包裝。采用澄明度儀檢查法，選擇2200 lx 光照度，手持瓶頸部于遮光板邊緣處，輕輕旋轉(zhuǎn)和翻轉(zhuǎn)容器使溶液中可能存在的可見(jiàn)異物懸浮，分別在黑色和白色背景下，在明視距離（待檢試劑至人眼的清晰觀(guān)察距離，通常為25 cm）目視檢查20 s。肉眼觀(guān)察液體情況。

1.2.2 特異性

取A1、B、O 型紅細(xì)胞各3 例，分離紅細(xì)胞后混合，洗3 次后用生理氯化鈉溶液配成2%紅細(xì)胞懸液使用。將試管排2 行，第1 行每支加待檢試劑0.1 mL，第2 行每支加生理氯化鈉溶液，然后分別加入2%A1、A2B、B、O 型紅細(xì)胞懸液0.1 mL。置18～25℃15 min，1 000 r/min 離心1 min 離心半徑16.5 cm，肉眼觀(guān)察結(jié)果。生理氯化鈉溶液做紅細(xì)胞懸液對(duì)照。

1.2.3 親和力

取A1、A2、A2B、B 型紅細(xì)胞各3 例，分離紅細(xì)胞后混合，洗3 次后用生理氯化鈉溶液配成配成10%紅細(xì)胞懸液使用。取0.05 mL 待檢試劑置潔凈玻片上，加等體積10%紅細(xì)胞懸液立即混勻，面積直徑要求10 mm2以上，滴入紅細(xì)胞懸液同時(shí)，即刻記錄肉眼可見(jiàn)凝集出現(xiàn)時(shí)間及3 min 凝塊大小。

1.2.4 效價(jià)測(cè)定

取A1、A2、A2B 、B 型紅細(xì)胞各3 例，分離紅細(xì)胞后混合，洗3 次后用生理氯化鈉溶液配成2%紅細(xì)胞懸液使用。將試管排成2 行，每行10 支，每支加0.1 mL 生理氯化鈉溶液，將待檢試劑或國(guó)家參考品0.1 mL 二倍系列稀釋?zhuān)尤胂鄳?yīng)的2%紅細(xì)胞懸液0.1 mL。置18～25℃15 min，1 000 r/min 離心1 min 離心半徑16.5 cm，肉眼觀(guān)察結(jié)果。

1.2.5 冷凝集素和不規(guī)則抗體測(cè)定

每一待檢試劑排5 行試管，每行13 支，各加待檢試劑0.1 mL，前3 行的前10 管分別加入10 例O型2%紅細(xì)胞懸液0.1 mL，后3 管分別加入3 例A型或者B 型2%紅細(xì)胞懸液0.1 mL。第1 行置4℃，第2 行置18～25℃，第3 行置37℃，靜置2 h 觀(guān)察結(jié)果；第4 和第5 行，前10 管分別加入10 例O型5%紅細(xì)胞懸液0.1 mL，后3 管分別加入3 例A型或者B 型5%紅細(xì)胞懸液0.1 mL；第4 行置18～25℃，第5 行置37℃，靜置2 h 后觀(guān)察結(jié)果。

1.2.6 穩(wěn)定性

待檢試劑的有效期為1 年的在37℃加熱7 d，有效期為2 年的在37℃加熱14 d。按上述1.2.1-1.2.5 方法進(jìn)行外觀(guān)、特異性、親和力、效價(jià)測(cè)定、冷凝集素和不規(guī)則抗體測(cè)定項(xiàng)目的檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 外觀(guān)結(jié)果

對(duì)4 家國(guó)產(chǎn)抗A 抗B 血型定型試劑共336 批進(jìn)行外觀(guān)檢查，抗A 試劑均為透明的藍(lán)色液體，抗B 試劑均為透明的黃色液體，且均無(wú)搖不散的沉淀或異物。4 家企業(yè)的抗A 抗B 血型定型試劑的外觀(guān)項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果均符合《中國(guó)藥典》規(guī)定。

2.2 特異性結(jié)果

對(duì)4 家企業(yè)共336 批次的抗A 抗B 血型定型試劑進(jìn)行特異性檢查，結(jié)果表明，抗A 試劑與A1、A2B 紅細(xì)胞均產(chǎn)生凝集，與O 及B 型紅細(xì)胞均不凝集，抗B 試劑與B 紅細(xì)胞均產(chǎn)生凝集，與A1、O 紅細(xì)胞均不凝集，均無(wú)溶血和其他不易分辨的現(xiàn)象。4 家企業(yè)的抗A 抗B 血型定型試劑的特異性項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果均符合《中國(guó)藥典》規(guī)定。

2.3 親和力結(jié)果

對(duì)4 家企業(yè)共336 批次的抗A 抗B 血型定型試劑進(jìn)行親和力檢查，結(jié)果表明，抗A 試劑與A1、A2、A2B 紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集的時(shí)間均分別≤15 s、≤30 s、≤45 s，抗B 試劑與B 紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集的時(shí)間均≤15 s，且在3 min 內(nèi)凝集塊均達(dá)到1 mm2以上。見(jiàn)表1。4 家企業(yè)的抗A 抗B 血型定型試劑的親和力項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果均符合《中國(guó)藥典》規(guī)定。

表1 抗A 抗B 血型定型試劑親和力結(jié)果Table 1 Affinity results of anti-A and anti-B blood typing reagents

2.4 效價(jià)測(cè)定結(jié)果

效價(jià)滴度以產(chǎn)生“+”凝集的待檢試劑最高稀釋度計(jì)算，不計(jì)紅細(xì)胞懸液體積。對(duì)4 家企業(yè)共336 批次的抗A 抗B 血型定型試劑進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，結(jié)果表明，抗A 試劑與A1、A2、A2B 型紅細(xì)胞的凝集效價(jià)均不低于國(guó)家參考品的同步測(cè)定結(jié)果，抗B試劑與B 型紅細(xì)胞的凝集效價(jià)均不低于國(guó)家參考品的同步測(cè)定結(jié)果。見(jiàn)表2。4家企業(yè)的抗A抗B血型定型試劑的效價(jià)測(cè)定項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果均符合《中國(guó)藥典》規(guī)定。

表2 抗A 抗B 血型定型試劑效價(jià)測(cè)定結(jié)果Table 2 Titer results of anti-A and anti-B blood typing reagents

2.5 冷凝集素和不規(guī)則抗體測(cè)定結(jié)果

對(duì)4 家企業(yè)共336 批次的抗A 抗B 血型定型試劑進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，結(jié)果表明，抗A 試劑與2%的10 例非血緣性O(shè) 型紅細(xì)胞和3 例B 型紅細(xì)胞在4℃、18～25℃、37℃三個(gè)反應(yīng)條件下均不出現(xiàn)凝集反應(yīng)，也不發(fā)生溶血。抗B 試劑與2%的10 例非血緣性O(shè) 型紅細(xì)胞和3 例A 型紅細(xì)胞在4℃、18～25℃、37℃三個(gè)反應(yīng)條件下均不出現(xiàn)凝集反應(yīng)，也不發(fā)生溶血；抗A 試劑與5%的10 例非血緣性O(shè)型紅細(xì)胞和3 例B 型紅細(xì)胞在18～25℃、37℃兩個(gè)反應(yīng)條件下均不出現(xiàn)凝集反應(yīng)，也不發(fā)生溶血?？笲 試劑與5%的10 例非血緣性O(shè) 型紅細(xì)胞和3例A 型紅細(xì)胞在18～25℃、37℃兩個(gè)反應(yīng)條件下均不出現(xiàn)凝集反應(yīng)，也不發(fā)生溶血。4 家企業(yè)的抗A抗B 血型定型試劑的冷凝集素和不規(guī)則抗體測(cè)定項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果均符合《中國(guó)藥典》規(guī)定。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

4 家企業(yè)336 批次的抗A 抗B 血型定型試劑在37℃加熱7 d 或14 d 后，與4℃保存的試劑相比外觀(guān)沒(méi)有明顯變化，抗A 試劑仍為透明的藍(lán)色液體，抗B 試劑仍為透明的黃色液體，且均無(wú)搖不散的沉淀或異物；與4℃保存的試劑相比特異性沒(méi)有變化，抗A 試劑仍與A1、A2B 紅細(xì)胞凝集，與O 及B 型紅細(xì)胞不凝集，抗B 試劑仍與B 紅細(xì)胞產(chǎn)生凝集，與A1、O 紅細(xì)胞不產(chǎn)生凝集，且均無(wú)溶血和其他不易分辨的現(xiàn)象；與4℃保存的試劑相比，加熱后的抗A 抗B血型定型試劑與紅細(xì)胞出現(xiàn)的凝集時(shí)間略有0.50～1.50 s 延遲，但仍符合《中國(guó)藥典》規(guī)定；與4℃保存的試劑相比，加熱后的抗A 抗B 血型定型試劑的效價(jià)測(cè)定結(jié)果略低，但仍滿(mǎn)足國(guó)家參考品的要求；與4℃保存的試劑相比冷凝集素和不規(guī)則抗體測(cè)定結(jié)果沒(méi)有變化，全部試管均不出現(xiàn)非特異性凝集反應(yīng)，也未發(fā)生溶血。4 家企業(yè)336 批次的抗A 抗B血型定型試劑的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果均符合《中國(guó)藥典》規(guī)定。

3 討論

生物制品批簽發(fā)［8］，是指國(guó)家藥品監(jiān)督管理局對(duì)獲得上市許可的疫苗類(lèi)制品、血液制品、用于血源篩查的體外診斷試劑以及國(guó)家藥品監(jiān)督管理局規(guī)定的其他生物制品，在每批產(chǎn)品上市銷(xiāo)售前或者進(jìn)口時(shí)，經(jīng)指定的批簽發(fā)機(jī)構(gòu)進(jìn)行審核、檢驗(yàn)，對(duì)符合要求的發(fā)給批簽發(fā)證明的活動(dòng)。未通過(guò)批簽發(fā)的產(chǎn)品，不得上市銷(xiāo)售或者進(jìn)口。為規(guī)范生物制品批簽發(fā)行為，保證生物制品安全有效，根據(jù)新制修訂《藥品管理法》和《疫苗管理法》，2020 年12 月11 日國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局令第33 號(hào)《生物制品批簽發(fā)管理辦法》公布，本辦法自2021 年3 月1 日起施行。新《生物制品批簽發(fā)管理辦法》進(jìn)一步明確了批簽發(fā)職責(zé)分工和重大質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品查處程序，明確了批簽發(fā)機(jī)構(gòu)的職責(zé)，強(qiáng)調(diào)對(duì)于發(fā)現(xiàn)的質(zhì)量問(wèn)題、缺陷和風(fēng)險(xiǎn)及時(shí)進(jìn)行調(diào)查評(píng)估，采取必要措施處理。

中國(guó)食品藥品檢定研究院［9］是負(fù)責(zé)抗A 抗B血型定型試劑（單克隆抗體）的唯一批簽發(fā)機(jī)構(gòu)，一直非常重視該品種的產(chǎn)品質(zhì)量，堅(jiān)持對(duì)每一批試劑進(jìn)行全部檢測(cè)項(xiàng)目的質(zhì)量檢定。2018 年以來(lái)，中國(guó)食品藥品檢定研究院共簽發(fā)了336 批4 家國(guó)產(chǎn)抗A 抗B 血型定型試劑，簽發(fā)量達(dá)741 956 800 人份，對(duì)試劑成品進(jìn)行了外觀(guān)、特異性、親和力、效價(jià)測(cè)定、冷凝集素和不規(guī)則抗體測(cè)試、穩(wěn)定性試驗(yàn)等6 個(gè)項(xiàng)目的檢驗(yàn)，質(zhì)量全部合格?？傮w來(lái)講，北京金豪制藥股份有限公司、河北醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心、上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司、長(zhǎng)春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司4 家國(guó)產(chǎn)抗A抗B 血型定型試劑的質(zhì)量穩(wěn)定。

抗A 抗B 血型定型試劑（單克隆抗體）的批簽發(fā)工作主要有三個(gè)環(huán)節(jié)：資料審核、產(chǎn)品檢定、出具檢驗(yàn)報(bào)告及批簽發(fā)證明。產(chǎn)品檢定依據(jù)《中國(guó)藥典》進(jìn)行全部項(xiàng)目的檢定，包括外觀(guān)、特異性、親和力、效價(jià)測(cè)定、冷凝集素和不規(guī)則抗體測(cè)試、穩(wěn)定性試驗(yàn)共6 個(gè)項(xiàng)目?！吨袊?guó)藥典》每5 年進(jìn)行一次修訂，但是針對(duì)抗A 抗B 血型定型試劑（單克隆抗體）這個(gè)品種，2015 版［10］與2020 版的內(nèi)容沒(méi)有發(fā)生任何變化，所以2018 年以來(lái)對(duì)抗A 抗B 血型定型試劑（單克隆抗體）的產(chǎn)品檢定依據(jù)了相同的技術(shù)指標(biāo)和判定方法。

在6 個(gè)檢定項(xiàng)目中，效價(jià)是反映不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的抗A 抗B 血型定型試劑的靈敏度，是試劑檢出能力的關(guān)鍵評(píng)價(jià)指標(biāo)，在臨床輸血等ABO 血型鑒定中發(fā)揮重要作用［11-13］，因此，在效價(jià)測(cè)定中采用了抗A 抗B 血型定型試劑效價(jià)測(cè)定用國(guó)家參考品這樣一把標(biāo)尺來(lái)進(jìn)行統(tǒng)一評(píng)價(jià)［14-15］?！吨袊?guó)藥典》規(guī)定，抗A 抗B 血型定型試劑在半成品檢定中需要進(jìn)行特異性、效價(jià)測(cè)定、冷凝集素和不規(guī)則抗體測(cè)定、無(wú)菌檢查以及穩(wěn)定性試驗(yàn)，半成品的穩(wěn)定性試驗(yàn)同樣采用37℃加熱7 天（有效期1 年）或14 天（有效期2年）后進(jìn)行特異性、效價(jià)測(cè)定、冷凝集素和不規(guī)則抗體測(cè)定以及無(wú)菌檢查，在實(shí)際工作中企業(yè)對(duì)此反映較多，認(rèn)為半成品已經(jīng)進(jìn)行4 個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)的檢測(cè)，加熱之后再進(jìn)行一遍全部項(xiàng)目檢測(cè)，大大延遲了產(chǎn)品的放行，尤其是無(wú)菌檢查采用直接接種法需要14 天時(shí)間。是否有必要對(duì)半成品和成品均進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)，以及半成品加熱后是否必須再進(jìn)行一次無(wú)菌檢測(cè)，希望引起更多的討論與思考，在下一版藥典修訂時(shí)對(duì)此進(jìn)一步研判。