槲皮素通過PI3K/Akt/mTOR通路促進(jìn)缺血性腦卒中小鼠康復(fù)的機(jī)制

李秋菊， 江毅， 趙仁超， 莊緒娟

(山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬青島醫(yī)院 & 青島市城陽區(qū)人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科， 山東 青島 266109)

缺血性腦卒中是因多種因素作用而導(dǎo)致的局部腦組織缺血缺氧性壞死，進(jìn)而造成神經(jīng)功能缺失，具有較高的臨床致殘率和致死率[1]。目前臨床對(duì)于缺血性腦卒中患者的治療主要為溶栓、血管介入及抗血小板聚集等綜合性治療，雖然能夠在一定程度上改善腦梗死患者梗死灶部位的血液供應(yīng)，但即使再通血管后，腦組織因缺血-再灌注而導(dǎo)致的損傷也會(huì)對(duì)患者遠(yuǎn)期腦功能恢復(fù)產(chǎn)生明顯的不良影響[2]。目前缺血性腦卒中的主要發(fā)病人群為18～50歲、且發(fā)病率逐年升高，導(dǎo)致社會(huì)主要?jiǎng)趧?dòng)力損失，社會(huì)負(fù)擔(dān)增大[3]。因此積極探究缺血性腦卒中發(fā)生的分子機(jī)制，并采集有效治療措施，對(duì)促進(jìn)患者腦功能恢復(fù)，降低臨床致殘率和致死率有十分重要的意義。槲皮素為具有抗氧化特性的天然膳食黃酮，既往研究中發(fā)現(xiàn)其能夠緩解炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕組織水腫，緩解臟器損傷[4]。楊青麗等[5]發(fā)現(xiàn)槲皮素可保護(hù)缺氧缺血性腦損傷神經(jīng)元細(xì)胞；黃超等[6]指出槲皮素具有拮抗炎癥反應(yīng)和降低氧化應(yīng)激反應(yīng)的效果，能夠?qū)ι窠?jīng)細(xì)胞凋亡途徑進(jìn)行抑制，可改善創(chuàng)傷性腦損傷患者的臨床療效；磷脂酰肌醇-3(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(acid，Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路為經(jīng)典生物信號(hào)通路，曾有學(xué)者通過激活該信號(hào)通路，提高了膿毒癥小鼠急性肺損傷的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制[7]，因此本文分析槲皮素通過PI3K/Akt/mTOR通路促進(jìn)缺血性卒中小鼠康復(fù)的效果，以期能為缺血性腦卒中的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只SPF級(jí)C57BL/6小鼠，均為雄性，6～8周，體質(zhì)量為20～25 g、平均(22.19±1.32) g，均由成都醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購入，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(川)2021-003。實(shí)驗(yàn)前7 d所有小鼠均進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，設(shè)置光照12 h/d，濕度為40%～55%，室內(nèi)溫度21～22 ℃，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.1.2主要儀器 電子顯微鏡(EM ACE900型，德國Leica公司)、蛋白電泳儀(1659001型，美國Bio-Rad公司)、手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(RM2125RTS型，德國Leica公司)、酶標(biāo)儀(Fax-20100型，美國INStat公司)凝膠成像儀(GIS-500型，杭州米歐儀器有限公司)。

1.1.3主要試劑 槲皮素(上海源葉生物科技有限公司)、NVP-BEZ235(美國BioVision)、酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)、β-actin鼠抗和十二烷基硫酸鈉(美國Sigma公司)、蛋白提取試劑盒及BCA蛋白定量試劑盒(北京中山金橋生物科技有限公司)、RIPA裂解液(上海碧云天公司)、PI3K、Akt、mTOR、磷酸化(phosphoric，p-)-PI3K、p-AKT、p-mTOR鼠抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗(美國Abcam公司)。

1.2 研究方法

1.2.1分組、給藥及線栓法建模 50只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、槲皮素組、通路抑制組及聯(lián)合組，每組10只；參考文獻(xiàn)[8]，槲皮素組每日灌胃200 mg/kg槲皮素，通路抑制組每日灌胃60 mg/kg NVP-BEZ235，聯(lián)合組每日灌胃200 mg/kg槲皮素和60 mg/kg NVP-BEZ235，模型組和對(duì)照組每日灌胃等體積生理鹽水，均給藥7 d；50只小鼠均術(shù)前禁食6 h，按照0.3 g/kg體質(zhì)量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，將小鼠以仰臥位固定，消毒后切開頸前正中，模型組、槲皮素組、通路抑制組及聯(lián)合組參考文獻(xiàn)[9]復(fù)制大鼠腦缺血再灌注損傷模型。對(duì)照組小鼠術(shù)前禁食6 h，按照0.3 g/kg體質(zhì)量腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，將小鼠以仰臥位固定，消毒后切開頸前正中，不對(duì)血管做任何操作。

1.2.2學(xué)習(xí)記憶能力Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測評(píng) (1)定位航行實(shí)驗(yàn)：將大鼠面向池壁由不同象限放入小鼠，開展Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，使小鼠尋找第1象限水平面下1 cm的平臺(tái)，其所消耗的時(shí)間為逃逸潛伏期，設(shè)置最大限時(shí)為120 s，超出者計(jì)為120 s，每只小鼠每日訓(xùn)練4次，共5 d，取平均值為學(xué)習(xí)成績。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)：Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)最后1 d，拆除平臺(tái)，將與平臺(tái)正對(duì)的象限作為小鼠入水點(diǎn)，并自由游泳120 s，記錄該時(shí)間內(nèi)各小鼠穿過平臺(tái)的次數(shù)和在目標(biāo)象限內(nèi)停留的時(shí)間，以此衡量記憶能力。

1.2.3腦功能缺陷評(píng)分 依據(jù)Vemuganti等[10]的方法對(duì)小鼠腦功能缺陷程度進(jìn)行5分制評(píng)估，1分為提尾左前肢屈曲，2分為行走向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，3分為向左側(cè)傾斜，4分為無法自發(fā)行走、意識(shí)減退，5分為缺血相關(guān)死亡。

1.2.4腦梗死灶體積 給藥7 d后，麻醉狀態(tài)下采用斷頭法處死小鼠，快速取出腦組織，制作厚度為1.5 mm的冠狀切片，將其置于2%氯化三苯基四氮唑內(nèi)37 ℃孵育15 min，染色后使用掃描儀對(duì)腦片進(jìn)行掃描，并使用Image pro plus軟件分析腦片內(nèi)梗死體積。

1.2.5炎性因子和氧化應(yīng)激因子 取小鼠海馬組織0.5 g，低溫融化后加入9倍體積預(yù)冷的PBS勻漿，13 000 r/min離心15 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測白細(xì)胞介素-6(interleukin- 6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平。

1.2.6PI3K/ Akt/ mTOR蛋白及p-PI3K、p-AKT、p-mTOR水平 采用Western blot法檢測，取海馬組織0.5 g，制備細(xì)胞懸液，以12 000 r/min離心10 min，取沉淀加入RIPA裂解液，重懸細(xì)胞，置于冰上裂解30 min，以12 000 r/min離心10 min，加入Loading Buffer緩沖液200 μL，置于100 ℃水浴內(nèi)煮沸10 min，采用BCA法測量蛋白濃度，采用SDS-PAGE電泳提取總蛋白，將蛋白移至PVDF膜后放入TBST溶液內(nèi)洗膜5 min，加一抗(1 ∶1 000)，4 ℃恒溫箱內(nèi)孵育過夜，TBST洗膜3次，加二抗(1 ∶2 000)，封閉，曝光，以β-actin為內(nèi)參，分析灰度值，獲得蛋白表達(dá)水平，每組均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶能力

與對(duì)照組比較，其余各組小鼠的穿越原平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比均減少，逃逸潛伏期均延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，通路抑制組小鼠穿越原平臺(tái)次數(shù)及目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比減少、逃逸潛伏期延長，槲皮素組小鼠穿越原平臺(tái)次數(shù)及目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比增加、逃逸潛伏期縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較Tab.1 Comparison of learning and memory ability in each group

2.2 腦功能缺陷評(píng)分和腦梗死灶體積

與對(duì)照組比較，其余各組小鼠腦功能缺陷評(píng)分均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，通路抑制組小鼠腦功能缺陷評(píng)分和腦梗死灶體積均升高、槲皮素組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠腦功能缺陷評(píng)分和腦梗死灶體積比較Tab.2 Comparison of brain function deficit scores and cerebral infarction volumes in each group

2.3 海馬組織炎性因子水平

與對(duì)照組相比，其余各組小鼠海馬組織IL-6、TNF-α水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，通路抑制組小鼠海馬組織IL-6、TNF-α水平均升高，槲皮素組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4 海馬組織氧化應(yīng)激因子水平

與對(duì)照組比較，其余各組小鼠海馬組織的MDA水平升高、SOD水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，通路抑制組小鼠海馬組織的MDA水平升高，SOD水平降低，槲皮素組則相反，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表3 各組小鼠海馬組織炎性因子水平比較Tab.3 Comparison of the levels of inflammatory factors in the hippocampus in each group

表4 各組小鼠海馬組織氧化應(yīng)激因子水平比較Tab.4 Comparison of oxidative stress factor levels in the hippocampus in each group

2.5 海馬組織PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，其余各組小鼠海馬組織的PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，通路抑制組小鼠海馬組織的PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)水平降低，槲皮素組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1和表5。

圖1 各組小鼠海馬組織PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)灰度值Fig.1 The protein expression levels of PI3K, AKT, and mTOR in mouse hippocampus in each group

表5 各組小鼠海馬組織PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)水平比較Tab.5 Comparison of the protein expression levels of PI3K, AKT and mTOR in mouse hippocampus among the following groups

2.6 海馬組織PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平

與對(duì)照組比較，其余各組小鼠海馬組織的p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，通路抑制組小鼠海馬組織的p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達(dá)水平降低，槲皮素組則相反，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2和表6。

圖2 各組小鼠海馬組織PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平灰度值Fig.2 The protein phosphorylation levels of PI3K, AKT, and mTOR in mouse hippocampus in each group

3 討論

缺血性腦卒中是僅次于缺血性心臟病的第2大人口死亡因素，患者發(fā)病后隨病情進(jìn)展表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而損傷腦組織，造成視聽覺消失、癱瘓、癡呆等行為，因此臨床中常將感覺、

表6 各組小鼠海馬組織PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平比較Tab.6 Comparison of PI3K, AKT, and mTOR protein phosphorylation levels in mouse hippocampus in each group

運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知等神經(jīng)功能異常行為作為了解缺血性腦卒中患者腦損傷程度的監(jiān)測指標(biāo)，通過給予血液恢復(fù)、溶栓等治療措施改善預(yù)后[11-12]。槲皮素近年來因其可抵抗腦缺血再灌注損傷而得到關(guān)注，因此本文就此展開相關(guān)研究。

本文結(jié)果顯示，各組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和腦功能與對(duì)照組比較均降低，其中PI3K/Akt/mTOR通路抑制組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和腦功能最差，提示抑制PI3K/Akt/mTOR通路會(huì)對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和腦功能產(chǎn)生明顯不良影響，而槲皮素組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和腦功能則優(yōu)于模型組、通路抑制組和聯(lián)合組，且腦梗死灶體積較各組明顯縮小，提示給予缺血性腦卒中小鼠槲皮素能夠縮小腦梗死體積，保護(hù)小鼠學(xué)習(xí)記憶功能和腦功能。進(jìn)一步探究中發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR通路抑制組小鼠的IL-6和TNF-α水平最高，提示抑制該通路會(huì)造成缺血性腦卒中小鼠機(jī)體炎性反應(yīng)加重，而槲皮素組小鼠海馬組織的IL-6和TNF-α水平明顯低于模型組、通路抑制組和聯(lián)合組，提示槲皮素可在一定程度上緩解炎性反應(yīng)。同樣監(jiān)測海馬組織內(nèi)MDA和SOD水平，可以發(fā)現(xiàn)槲皮素也能夠緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，是由于槲皮素能夠清除多余的活性氧，可通過激活線粒體自噬而發(fā)揮保護(hù)腦神經(jīng)和腦功能的作用，同時(shí)槲皮素還能夠抗血栓、抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，緩解腦卒中后的繼發(fā)性損傷，降低神經(jīng)元受損程度[13-15]。既往在部分學(xué)者對(duì)缺血性損傷動(dòng)物模型的研究中也發(fā)現(xiàn)[16-20]，槲皮素能夠提高內(nèi)源性抗氧化酶CU/Zn/錳超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶在海馬CA1椎體神經(jīng)元中的表達(dá)，具有較強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)功能，可有效緩解腦缺血。同時(shí)本文結(jié)果顯示，槲皮素組小鼠海馬組織的PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)水平和p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達(dá)水平升高，而通路抑制組小鼠的各蛋白表達(dá)及磷酸化表達(dá)水平均降低，提示槲皮素可能通過上調(diào)PI3K/Akt/mTOR通路而發(fā)揮腦功能保護(hù)作用，該通路通過逐級(jí)磷酸化下游蛋白，能夠?qū)C(jī)體多種細(xì)胞生物學(xué)過程進(jìn)行調(diào)控，如可通過調(diào)控細(xì)胞自噬而緩解缺血性卒中造成的炎性反應(yīng)和腦損傷[21-25]。

綜上所述，槲皮素可通過上調(diào)PI3K/Akt/mTOR通路改善缺血性卒中小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，提升腦功能，緩解腦部炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而促進(jìn)缺血性卒中小鼠康復(fù)。