基于RBL-2H3模型分析過(guò)敏反應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞激活的差異基因

劉 艷，谷福蝶，陳慧瑩，李 焱，周 鈺，張 軍，劉 紅，曹敏杰，劉光明，劉慶梅

（集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021）

過(guò)敏性疾病被世界衛(wèi)生組織列為21世紀(jì)重點(diǎn)防治的三大疾病之一，是世界上最常見的慢性疾病之一[1]。常見的過(guò)敏性疾病包括食物過(guò)敏、支氣管哮喘、變應(yīng)性鼻炎、特應(yīng)性皮炎等，其特征主要是IgE介導(dǎo)的超敏反應(yīng)[2-3]。IgE介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)能夠引起效應(yīng)細(xì)胞激活，釋放組胺、蛋白酶和細(xì)胞因子等，從而誘發(fā)全身性過(guò)敏反應(yīng)癥狀[4]。

肥大細(xì)胞是過(guò)敏反應(yīng)中的重要效應(yīng)細(xì)胞，大量存在于機(jī)體屏障組織中，如皮膚、呼吸道和胃腸道黏膜[5-7]。肥大細(xì)胞可通過(guò)多種表面受體被激活，包括高親和力受體、干細(xì)胞因子受體和細(xì)胞因子受體等。大鼠嗜堿性粒細(xì)胞（rat basophilic leukemia，RBL）-2H3表面高表達(dá)IgE高親和力受體（high affinity IgE receptor，F(xiàn)cεRI），通常作為肥大細(xì)胞模型用于大通量的抗過(guò)敏藥物篩選以及I型過(guò)敏反應(yīng)的機(jī)理研究[8]，該方法簡(jiǎn)便快捷、重復(fù)性高且經(jīng)濟(jì)成本低。Wang Chongyang等[9]通過(guò)RBL-2H3細(xì)胞模型探究了紫檀芪可通過(guò)調(diào)控腫瘤抑制因子LKB1/腺苷酸活化蛋白激酶AMPK信號(hào)分子抑制FcεRI通路；Ma Jing等[10]發(fā)現(xiàn)果膠寡糖能抑制RBL-2H3細(xì)胞的脫顆粒以及炎癥因子的釋放，可以作為治療過(guò)敏性疾病的潛在藥物；本課題組也用RBL-2H3細(xì)胞模型挖掘天然活性產(chǎn)物，為治療食物過(guò)敏的食/藥用原材料開發(fā)提供參考[11-13]。但是目前對(duì)于該細(xì)胞模型的機(jī)理探究還不夠深入。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)是通過(guò)反轉(zhuǎn)錄從RNA中獲得互補(bǔ)DNA序列的高通量測(cè)序技術(shù)[14]。RNA-seq是近年來(lái)轉(zhuǎn)錄組學(xué)中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，它可以揭示遺傳改變與復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程之間的關(guān)系[15]。通過(guò)RNA-seq技術(shù)，Kanagaratham等[16]研究了奧美拉唑?qū)せ詈蠓蚀蠹?xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)情況的影響，該藥物能抑制過(guò)敏相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，為肥大細(xì)胞特異性的藥理靶點(diǎn)提供參考；Dong Na等[17]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析差異基因（differential expressed genes，DEGs）發(fā)現(xiàn)黃芪多糖通過(guò)調(diào)控核因子（nuclear factor kappa-B，NF-κB）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路抑制脂多糖LPS誘導(dǎo)的豬上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子。已有學(xué)者探究過(guò)敏反應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞的某些信號(hào)通路[16,18]，但針對(duì)RBL-2H3細(xì)胞激活的轉(zhuǎn)錄組信息全面分析還鮮見報(bào)道。因此本研究以IgE介導(dǎo)的RBL-2H3細(xì)胞為過(guò)敏反應(yīng)模型，通過(guò)RNA-seq技術(shù)對(duì)RBL-2H3細(xì)胞激活后表達(dá)差異顯著的基因及其參與的信號(hào)通路進(jìn)行分析，以期為IgE介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)潛在靶點(diǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RBL-2H3細(xì)胞 上海復(fù)祥生物技術(shù)有限公司；最低必需液體培養(yǎng)基（Eagle’s minimum essential medium，EMEM） 美國(guó)HyClone公司；胎牛血清 美國(guó)Gemini生物科技公司；抗二硝基苯單克隆抗體 美國(guó)Sigma公司；二硝基苯偶聯(lián)牛血清白蛋白（dinitrophenol-bovine serum albumin，DNP-BSA）、氟代五氯丙酮 美國(guó)Biosearch公司；組胺酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 德國(guó)IBL公司；小鼠白細(xì)胞介素4/6 ELISA試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-αELISA試劑盒 美國(guó)Perprotech公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

分別稱取NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、NaHCO31.0 g以及NaH2PO40.05 g，加蒸餾水溶解，接著加入CaCl20.2 g及MgCl20.1 g，經(jīng)磁力攪拌均勻后定容至1 L。量取50 mL的上述緩沖液加入50 mg葡萄糖，充分溶解后經(jīng)0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌后使用（臺(tái)式緩沖液）；量取50 mL臺(tái)式緩沖液加入50 μL的Triton-X 100，振蕩均勻后待用（細(xì)胞裂解液）。

1.2 儀器與設(shè)備

Forma 3111 CO2培養(yǎng)箱 德國(guó)Memmert公司；SG-403生物安全柜 美國(guó)的Baker公司；Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀 德國(guó)Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 RBL-2H3細(xì)胞的培養(yǎng)與模型構(gòu)建

RBL-2H3細(xì)胞按照5×105個(gè)/孔培養(yǎng)于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的EMEM培養(yǎng)液（2 mL培養(yǎng)液/孔）中。所使用的6 孔板置于5% CO2、37 ℃的CO2培養(yǎng)箱，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板80%（2～3 d）后進(jìn)行傳代。

參照Liu Qingmei等[12]的方法，將抗二硝基苯單克隆抗體anti-DNP-IgE（終質(zhì)量濃度為100 ng/mL）加入含有RBL-2H3細(xì)胞懸液的10% FBS-EMEM培養(yǎng)液中，充分混合后將細(xì)胞懸液移入96 孔板中（細(xì)胞數(shù)5×104個(gè)/孔）。12～16 h后棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖溶液洗滌后，接著用臺(tái)式緩沖液繼續(xù)培養(yǎng)，加入不同質(zhì)量濃度的DNP-BSA（終質(zhì)量濃度分別為0、100、200、500、1 000 ng/mL，其中未添加DNP-BSA為陰性對(duì)照組），刺激RBL-2H3細(xì)胞，15 min后收集部分上清液，通過(guò)ELISA測(cè)定組胺的釋放量。1 h后回收細(xì)胞上清液，再加細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞；最后用25 μL上清液或細(xì)胞裂解液分別加入96 孔板，每孔加100 μL 1.2 mmol/L的氟代五氯丙酮試劑，37 ℃反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定熒光值（激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm）。

根據(jù)β-氨基己糖苷酶確定合適的DNP-BSA質(zhì)量濃度（500 ng/mL），用500 ng/mL終質(zhì)量濃度的DNP-BSA處理IgE敏化后的RBL-2H3細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，通過(guò)ELISA測(cè)定IL-4（培養(yǎng)4 h）以及TNF-α（培養(yǎng)6 h）的產(chǎn)生量[19]。

1.3.2 RNA-seq技術(shù)

按照1.3.1節(jié)方法，RBL-2H3細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后棄去上清液，用磷酸鹽緩沖溶液洗兩次，每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液，充分裂解細(xì)胞后將裂解液轉(zhuǎn)移到2 mL的無(wú)RNA酶離心管，在室溫下靜置5 min，置于-80 ℃保存，用于RNA-seq。在IgE介導(dǎo)的RBL-2H3細(xì)胞激活模型中，其中未經(jīng)過(guò)DNP-BSA刺激，即是正常的RBL-2H3細(xì)胞，釋放極少的顆粒物質(zhì)和組胺、細(xì)胞因子等，即定義為陰性組；而陽(yáng)性組中的RBL-2H3細(xì)胞經(jīng)DNP-BSA（500 ng/mL）刺激，細(xì)胞能夠脫顆粒，釋放組胺和細(xì)胞因子，呈現(xiàn)強(qiáng)烈的過(guò)敏反應(yīng)。陰性組（陰性1、2、3）及陽(yáng)性組（陽(yáng)性1、2、3）2 組樣品，每組設(shè)置3個(gè)平行。

收集上述樣品委托美吉生物醫(yī)藥公司進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)樣品進(jìn)行文庫(kù)富集和聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增以便于后續(xù)Illumina平臺(tái)上機(jī)測(cè)序[20-21]。為了保證后續(xù)生物信息分析的準(zhǔn)確性，對(duì)原始數(shù)據(jù)raw reads處理得到高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)clean reads[22]。使用TopHat2軟件將測(cè)序數(shù)據(jù)和參考基因組（大鼠基因組）進(jìn)行定量比對(duì)分析。以顯著性P值和差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）作為DEGs的篩選條件（|log2FC|≥0.585以及P＜0.05），分析基因表達(dá)水平的差異[23-24]?；谥毕低吹鞍追纸M比對(duì)（Evolutionary Genealogy of Genes: Non-supervised Orthologous Groups，EggNOG）數(shù)據(jù)庫(kù)和基因本體論（Gene Ontology，GO）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs進(jìn)行功能分類分析，利用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）對(duì)DEGs進(jìn)行Pathway注釋和富集分析[25]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 RBL-2H3 細(xì)胞激活模型的建立

通過(guò)探究DNP-BSA的最適質(zhì)量濃度建立了IgE介導(dǎo)的RBL-2H3細(xì)胞激活模型，測(cè)定β-氨基己糖苷酶釋放率以及組胺釋放量，結(jié)果如圖1A、B所示，在DNPBSA質(zhì)量濃度低于500 ng/mL時(shí)，β-氨基己糖苷酶釋放率以及組胺釋放量與DNP-BSA質(zhì)量濃度呈正相關(guān)趨勢(shì)。DNP-BSA終質(zhì)量濃度1 000 ng/mL與DNP-BSA終質(zhì)量濃度500 ng/mL相比，β-氨基己糖苷酶的釋放有顯著差異，但組胺釋放差異不顯著，說(shuō)明當(dāng)使用500 ng/mL DNP-BSA后，RBL-2H3的激活已基本飽和，從成本的角度考慮，最終確定DNP-BSA的最適質(zhì)量濃度為500 ng/mL。此外，過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生后，效應(yīng)細(xì)胞不僅脫顆粒和釋放組胺等過(guò)敏介質(zhì)，也會(huì)分泌大量的細(xì)胞因子（TNF-α及IL-4）誘發(fā)炎癥反應(yīng)，使用500 ng/mL DNP-BSA構(gòu)建IgE介導(dǎo)的RBL-2H3細(xì)胞激活模型，測(cè)定TNF-α以及IL-4的分泌情況，結(jié)果如圖1C所示，TNF-α產(chǎn)生量從120.08 pg/mL增加到253.69 pg/mL，IL-4的釋放量從15.77 pg/mL增加到77.32 pg/mL，結(jié)果表明當(dāng)RBL-2H3細(xì)胞被激活時(shí)炎癥因子明顯增多，說(shuō)明500 ng/mL DNP-BSA刺激RBL-2H3后，細(xì)胞發(fā)生了強(qiáng)過(guò)敏反應(yīng)，過(guò)敏介質(zhì)及相關(guān)細(xì)胞因子均顯著上調(diào)，模型構(gòu)建成功。該過(guò)敏反應(yīng)細(xì)胞模型的構(gòu)建能夠?yàn)樾?yīng)細(xì)胞激活的分子機(jī)制探究奠定基礎(chǔ)，也可用于抑制過(guò)敏反應(yīng)的天然產(chǎn)物或藥物的篩選及機(jī)理分析。本課題組也利用該模型對(duì)海洋的天然活性物質(zhì)的抗過(guò)敏活性進(jìn)行了初篩，并且使用該模型對(duì)篩選出的活性物質(zhì)以及紅藻中提取的多糖等進(jìn)行了抗過(guò)敏機(jī)理的研究[5,11,26]。

圖1 RBL-2H3細(xì)胞β-氨基己糖苷酶釋放率（A）、組胺釋放量（B）以及TNF-α、IL-4釋放量（C）Fig. 1 Release rates of β-hexaminosidase (A), histamine release (B) and TNF-α and IL-4 release (C) from RBL-2H3 cells

2.2 DEGs RNA-seq數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

對(duì)RBL-2H3細(xì)胞激活后細(xì)胞樣本進(jìn)行RNA-seq，得到相應(yīng)的原始測(cè)序數(shù)據(jù)raw reads，經(jīng)過(guò)濾得到質(zhì)控后的數(shù)據(jù)clean reads。對(duì)質(zhì)控后的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，根據(jù)表1結(jié)果可知，樣品中Q20均高于98%，Q30均高于94%（Q20、Q30分別指測(cè)序質(zhì)量在99%和99.9%以上的堿基占總堿基的百分比，一般Q20在85%以上，Q30在80%以上），這一結(jié)果表明測(cè)序的6個(gè)樣本clean reads質(zhì)量良好，沒(méi)有存在污染的情況，能夠達(dá)到RNA-seq的要求，可以用于后續(xù)分析[27]。

表1 陽(yáng)性組與陰性組DEGs RNA-seq數(shù)據(jù)Table 1 Transcriptome sequencing data for positive and negative groups

2.3 DEGs表達(dá)水平分析

為了探究RBL-2H3細(xì)胞激活前后基因表達(dá)水平的數(shù)量以及動(dòng)態(tài)變化，通過(guò)每百萬(wàn)次讀取的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了不同樣品間的DEGs分析。得到有關(guān)陽(yáng)性組和陰性組樣品之間DEGs的Venn圖（圖2A），其中檢測(cè)到10 880個(gè)DEGs共同表達(dá)，而在陽(yáng)性組中特異表達(dá)的DEGs有199個(gè)，陰性組特異表達(dá)的DEGs有185個(gè)。為進(jìn)一步了解RBL-2H3細(xì)胞激活前后DEGs的差異變化，利用DESeq2軟件分析獲得兩組間發(fā)生差異表達(dá)的基因，結(jié)果如圖2B、C所示，共有232個(gè)DEGs，其中表達(dá)量顯著下調(diào)的基因18個(gè)，表達(dá)顯著上調(diào)的基因214個(gè)。由此可見，RBL-2H3細(xì)胞激活主要體現(xiàn)在DEGs的上調(diào)表達(dá)，如Tnfaip3、Tnfsf8、Fos等，RBL-2H3細(xì)胞的激活會(huì)發(fā)生細(xì)胞脫顆粒，產(chǎn)生大量的包括TNF-α在內(nèi)的炎癥因子，在一定程度上說(shuō)明了顯著上調(diào)的DEGs與炎癥因子的產(chǎn)生有必然關(guān)系。在其他研究中，也發(fā)現(xiàn)效應(yīng)細(xì)胞激活會(huì)導(dǎo)致信號(hào)通路下游蛋白迅速磷酸化從而釋放炎癥因子[16,18]。

2.4 DEGs的生物學(xué)功能分析

2.4.1 DEGs的GO功能分類統(tǒng)計(jì)

圖3為GO分析中DEGs參與的生物學(xué)過(guò)程。涉及生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能，其中歸屬于生物過(guò)程的最多（25個(gè)），主要集中在細(xì)胞過(guò)程、生物調(diào)節(jié)和生物過(guò)程調(diào)節(jié)等；涉及細(xì)胞組分有14個(gè)生物學(xué)過(guò)程，主要集中在細(xì)胞部分、細(xì)胞和細(xì)胞器；分子功能富集到的生物學(xué)過(guò)程有11個(gè)，主要集中在結(jié)合。

圖2 陽(yáng)性與陰性組DEGs的Venn圖（A）、火山圖（B）和聚類分析（C）Fig. 2 Venn diagram (A), volcano map (B) and cluster analysis (C) of DEGs in between positive and negative groups

圖3 陽(yáng)性組與陰性組DEGs的GO生物學(xué)功能分析Fig. 3 GO biological function analysis of DEGs between positive and negative groups

2.4.2 DEGs的EggNOG功能注釋

將DEGs注釋到EggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)DEGs的功能進(jìn)行分類。由圖4可知，有127個(gè)DEGs注釋到EggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)，占總DEGs的54.74%，注釋后的DEGs分配至13 類功能中，在不同的功能分類存在明顯差異，其中細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸（占比最多（15.95%），其次是翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶占比9.48%，而轉(zhuǎn)錄占比7.76%，其余基因功能注釋數(shù)目占比均在5%以下。根據(jù)注釋結(jié)果得知RBL-2H3細(xì)胞激活后，轉(zhuǎn)錄因子細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸活躍，轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核中與DNA進(jìn)行結(jié)合，使得胞內(nèi)炎癥介質(zhì)等迅速生成與釋放。Wang Chongyang等[9]的結(jié)果表明RBL-2H3細(xì)胞被激活后，一些炎癥因子及介質(zhì)分泌顯著增多，而本課題組前期[26,28-29]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在經(jīng)過(guò)DNP-BSA激活后，效應(yīng)細(xì)胞的β-氨基己糖苷酶、IL-4以及TNF-α等分泌明顯增加。

圖4 陽(yáng)性組與陰性組DEGs的EggNOG功能分類統(tǒng)計(jì)Fig. 4 COG function classification statistics of DEGs between positive and negative groups

2.5 DEGs的KEGG信號(hào)通路分析

2.5.1 DEGs的KEGG通路富集分析

圖5 陽(yáng)性組與陰性組DEGs的KEGG富集通路散點(diǎn)圖Fig. 5 Scatter plot of KEGG enrichment pathway analysis of DEGs between positive and negative groups

為探尋DEGs參與的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生化代謝途徑，進(jìn)行KEGG通路富集分析，圖5展示了部分信號(hào)通路，其中改變較為明顯的KEGG通路為TNF信號(hào)通路、Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子（Janus Kinase-signal transducer and activator of transcription，Jak-STAT）信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路以及Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）信號(hào)通路等。根據(jù)富集結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，效應(yīng)細(xì)胞激活作用能夠提高M(jìn)AP3K8、Junb、Nfkbia、Jun、Fos等基因表達(dá)水平，促進(jìn)TNF信號(hào)通路及下游基因表達(dá)（圖5、表2），這可能是RBL-2H3細(xì)胞激活后釋放炎癥因子的重要原因之一。有研究證明，MAP3K8能夠作為治療過(guò)敏性疾病的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)[30]。Chen Siyan等[31]找到與Junb相關(guān)的去泛素酶，能針對(duì)哮喘等過(guò)敏性疾病。通過(guò)KEGG通路的富集說(shuō)明MAP3K8等轉(zhuǎn)錄因子在過(guò)敏性疾病中能夠起到關(guān)鍵性作用，為后續(xù)尋找靶向這些轉(zhuǎn)錄因子藥物提供一定的理論依據(jù)。

表2 與RBL-2H3激活相關(guān)的DEGsTable 2 DEGs associated with RBL-2H3 cell activation

2.5.2 DEGs的主要信號(hào)通路分析

MAPK信號(hào)通路（圖6A）、Jak-STAT信號(hào)通路（圖6B）、TNF信號(hào)通路（圖6C）以及TLR信號(hào)通路（圖6D）4 條信號(hào)通路的DEGs在陽(yáng)性組和陰性組之間均顯示不同的表達(dá)量，與陰性組對(duì)比，陽(yáng)性組的基因表達(dá)均有所上調(diào)。MAPK是炎癥反應(yīng)中的典型下游信號(hào)通路[18]，TNF-α在激活的RBL-2H3細(xì)胞中能檢測(cè)到明顯升高[9]。當(dāng)RBL-2H3細(xì)胞被激活時(shí)，MAPK等信號(hào)通路的信號(hào)分子發(fā)生磷酸化，炎癥因子得以產(chǎn)生并釋放，這些信號(hào)通路是過(guò)敏反應(yīng)中效應(yīng)細(xì)胞激活的關(guān)鍵因素，相關(guān)信號(hào)分子有望成為抑制過(guò)敏反應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。例如，Motojima等[32]報(bào)道毛蕊花糖苷能夠通過(guò)下調(diào)嗜堿性粒細(xì)胞中Ca/NFAT等基因，并且通過(guò)降低JNK的磷酸化抑制MAPK信號(hào)通路，發(fā)揮減弱過(guò)敏反應(yīng)的作用；Kang等[33]也研究發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）信號(hào)通路，減少促炎因子的表達(dá)，從而抑制人源肥大細(xì)胞的激活；此外，也有報(bào)道稱白藜蘆醇可以抑制STAT3的磷酸化，從而影響人腸組織中肥大細(xì)胞的激活[34]；Xiong Wei等[35]發(fā)現(xiàn)右旋美托咪啶預(yù)處理能夠通過(guò)下調(diào)TLR信號(hào)通路，降低心肌肥大細(xì)胞的活化，抑制炎癥反應(yīng)。通過(guò)本研究轉(zhuǎn)錄組信息分析和前人的相關(guān)研究，能夠得知MAPK、Jak-STAT、TNF以及TLR信號(hào)通路在過(guò)敏反應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞的激活中起到了重要作用，相關(guān)信號(hào)分子有望作為防治過(guò)敏性疾病的潛在靶點(diǎn)。

圖6 MAPK（A）、Jak-STAT（B）、TNF（C）以及TLR（D）的DEGs情況Fig. 6 DEGs related to MAPK (A), Jak-STAT (B), TNF (C) and TLR (D) signaling pathways

2.5.3 DEGs的TNF信號(hào)通路圖

根據(jù)KEGG富集的結(jié)果選取差異較顯著的信號(hào)通路，其中差異最為明顯的為TNF信號(hào)通路，TNF在維持免疫穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)疾病發(fā)展中發(fā)揮重要的雙重作用[36]。針對(duì)TNF信號(hào)通路，繪制具體的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制圖，如圖7所示，DNP-BSA能激活TNF信號(hào)通路，大致過(guò)程為在炎癥反應(yīng)中當(dāng)TNF與其受體TNFR1結(jié)合后，通過(guò)招募TRAF2/5連接蛋白誘導(dǎo)下游的NIK等基因活化，使得轉(zhuǎn)錄因子AP-1產(chǎn)生量增加，而AP-1會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA結(jié)合，促進(jìn)TNF等炎癥因子的釋放量增加，進(jìn)而產(chǎn)生嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)。有研究表明TNF是關(guān)鍵的炎癥調(diào)節(jié)因子，其通過(guò)激活2個(gè)主要信號(hào)通路，即NF-κB和MAPK實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能[37]，對(duì)于過(guò)敏反應(yīng)及炎癥反應(yīng)都相當(dāng)重要。Ling Yi等[38]發(fā)現(xiàn)，作為雷公藤的有效成分，山柰酚能夠作用于TNF信號(hào)通路，參與調(diào)控Jun、TNFR1、TNFR2、TNF-α的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用；Huang Linlin等[39]發(fā)現(xiàn)南瓜果膠多糖通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路減少TNF-α的分泌，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性。這說(shuō)明可以將TNF信號(hào)通路作為治療過(guò)敏性疾病潛在的靶點(diǎn)。

圖7 DNP-BSA激活RBL-2H3細(xì)胞TNF信號(hào)通路Fig. 7 DNP-BSA promotes TNF signaling in RBL-2H3 cells

3 結(jié) 論

利用RNA-seq手段結(jié)合GO、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)IgE介導(dǎo)的RBL-2H3細(xì)胞體外過(guò)敏模型進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，IgE介導(dǎo)的RBL-2H3細(xì)胞激活后，轉(zhuǎn)錄水平上體現(xiàn)出多數(shù)基因的上調(diào)表達(dá)，共篩選得到232個(gè)表達(dá)量有顯著差異的基因，其中顯著上調(diào)基因214個(gè)，而顯著下調(diào)的基因僅有18個(gè)；此外，DEGs的KEGG富集分析顯示，RBL-2H3細(xì)胞激活參與調(diào)控的主要為TNF、MAPK和Jak-STAT等信號(hào)通路，其中TNF信號(hào)通路富集的DEGs數(shù)量最多。雖然本研究找到一些重要的轉(zhuǎn)錄因子，如MAP3K8、Junb、Nfkbia、Jun、Fos等，仍然缺乏足夠的研究可以闡述過(guò)敏反應(yīng)和這些轉(zhuǎn)錄因子之間的直接關(guān)系，這需要今后深入研究。本研究探討了RBL-2H3細(xì)胞激活的分子機(jī)制，挖掘了過(guò)敏反應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞激活的重要信號(hào)通路，為IgE介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)的防控研究提供理論依據(jù)。