絞股藍(lán)中黃酮類成分HPLC指紋圖譜研究*

臧淦榮 向 文王 莉# 周 寧

1 長興縣中醫(yī)院 浙江 長興 313100

2 湖州市食品藥品檢驗研究院 浙江 湖州 313000

絞股藍(lán)為葫蘆科植物絞股藍(lán)Gynostemma pentaphyllum(Thunb)Makino的干燥地上部分，目前關(guān)于絞股藍(lán)化學(xué)成分的研究主要集中皂苷類成分，對其中的黃酮類成分的研究較少。對絞股藍(lán)總黃酮含量的測定目前主要有分光光度法、三波長-光譜法和高效液相色譜法。本實驗采用高效液相色譜法建立絞股藍(lán)黃酮類成分指紋圖譜，并進(jìn)行相似度評價、聚類分析和主成分分析，旨在為絞股藍(lán)的質(zhì)量評價和資源的充分利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器：高效液相色譜儀（美國Waters公司）；十萬分之一分析天平［XS205DU，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司］；KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料：乙腈為色譜純（德國Merck公司）；甲醇分析純（南京化學(xué)試劑股份有限公司）；磷酸色譜純（南京化學(xué)試劑股份有限公司）；對照品：蘆?。?1086-202012，91.6%）、槲皮素（100081-201610，99.1%）、山柰素（山柰酚）（11086-202013，93.2%）均購自中國食品藥品檢定研究院；安徽和浙江兩省23批絞股藍(lán)樣品來源信息見表1，經(jīng)湖州市食品藥品檢驗研究院陳敏主任中藥師鑒定，均為葫蘆科佛手瓜族絞股藍(lán)屬絞股藍(lán)亞屬絞股藍(lán)原變種G.pentaphyllum var.pentaphyllum的地上部分。

表1 23批絞股藍(lán)樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備：取絞股藍(lán)樣品粉碎，過二號篩，精密稱取0.25g，置于150mL三角瓶中，精密加入80%乙醇25mL，密閉，稱重，加熱回流45min，冷卻，再稱重，用80%乙醇補(bǔ)足失重，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 對照品溶液的制備：取蘆丁、槲皮素、山柰素對照品精密稱定，置25mL棕色量瓶中，加80%乙醇制成每毫升含蘆丁332.30μg，槲皮素88.07μg，山 柰 素42.11μg的混合溶液，即為混合對照品溶液。

2.3 色譜條件：色譜柱：Ultimate Plus C18（250×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.01%磷酸溶液（B）；梯度洗脫：0～8min，15%→20%A；8～30min，20%→35%A；30～35min，35%→40%A；35～40min，40%→70%A；40～45min，70%→100%A；45～50min，100%A；50～55min，100%→15%；檢測波長：368nm；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.4 方法學(xué)考察：分述如下。

2.4.1 精密度試驗：取絞股藍(lán)樣品S1，采用“2.1”項下的方法制備成供試品溶液，按“2.3”項下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣分析6次，以3號蘆丁色譜峰為參照峰(S)，計算得到各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.55%，相對峰面積RSD均小于1.95%；采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”進(jìn)行處理，與對照指紋圖譜相似度均大于0.995，表明該儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗：取絞股藍(lán)樣品S1，采用“2.1”項下的方法制備6份供試品溶液，按“2.3”項下的色譜條件進(jìn)樣分析，以3號蘆丁色譜峰為參照峰(S)，計算得到各共有峰相對保留時間RSD均小于0.95%，相對峰面積RSD均小于2.75%；采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”進(jìn)行處理，與對照指紋圖譜相似度均大于0.990，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗：取絞股藍(lán)樣品S1，采用“2.1”項下的方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24、36、48h進(jìn)樣測定，以3號蘆丁色譜峰為參照峰(S)，計算得到各共有峰的相對保留時間RSD小于1.95%，相對峰面積RSD均小于3.75%；采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”進(jìn)行處理，計算得到其與對照指紋圖譜相似度均大于0.992，表明供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 加樣回收率實驗：取已知含量的絞股藍(lán)藥材樣品S1（24.32mg/g），稱定6份樣品份0.25g，精密稱定，每份分別精密加入6mg的蘆丁對照品，采用“2.1”項下的方法制備供試品溶液，按“2.3”項下的色譜條件進(jìn)樣分析計算，蘆丁的平均回收率為98.23%，RSD為0.86%，表明該方法回收率良好。

2.5 指紋圖譜的建立與評價：分述如下。

2.5.1 指紋圖譜的建立：取23批絞股藍(lán)樣品，采用“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。將所有數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”，以樣品S1色譜圖為參照圖譜，設(shè)定時間窗寬度為0.2min，選擇平均數(shù)法生成對照圖譜，運(yùn)用多點(diǎn)校正法對色譜峰進(jìn)行匹配，生成疊加圖譜及對照圖譜。以S23樣品圖譜為參照進(jìn)行指紋匹配，確定共有峰39個。通過對照品比對指認(rèn)了3個色譜峰：蘆丁、槲皮素、山柰素。

2.5.2 相似度評價：將23批絞股藍(lán)樣品色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”，進(jìn)行相似度評價，結(jié)果如表2所示。23批絞股藍(lán)樣品與對照圖譜的相似度為0.928～0.995，說明不同產(chǎn)地間絞股藍(lán)樣品的質(zhì)量存在一定的差異。安徽產(chǎn)地的絞股藍(lán)樣品相似度的RSD為2.23%，浙江產(chǎn)地的絞股藍(lán)樣品相似度的RSD為1.35%，表明同一產(chǎn)地絞股藍(lán)樣品也存在差異，浙江產(chǎn)地絞股藍(lán)樣品比安徽產(chǎn)地相對穩(wěn)定。

表2 23批絞股藍(lán)樣品與生成對照圖譜相似度評價結(jié)果

2.5.3 聚類分析：將23批絞股藍(lán)樣品色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 23.0軟件，采用組間連接法，以余弦距離法作為樣品間距離計算方法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果當(dāng)判別距離為5時，23批絞股藍(lán)樣品被分為4大類：安徽滁州S22、安徽旌德S23、安徽宣城S18、安徽黃山S14、浙江磐安S12、安徽六安S13、安徽新杭S15、安徽郎溪S16、安徽定遠(yuǎn)S21為一類，安徽蕪湖S17一類，浙江諸暨S05和浙江臨安S09為一類，其余11批樣品被聚為一類。從整體來看，這23批絞股藍(lán)的質(zhì)量與產(chǎn)地相關(guān)性較小、組間距離較小，同一省份絞股藍(lán)也可分在不同的組，與相似度評價結(jié)果一致。

2.5.4 主成分分析：利用SPSS 23.0軟件對峰面積進(jìn) 行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，對23批絞股藍(lán)樣品指紋圖譜所得的共有峰中峰面積較大的39個共有峰進(jìn)行主成分分析，計算相關(guān)矩陣的特征值及方差貢獻(xiàn)率，見表3和表4。提取了6個因子的累計方差貢獻(xiàn)率為93.93%，特征值均大于1，可代表絞股藍(lán)指紋圖譜39個共有峰的大部分信息，來計算主成分得分。對主成分載荷值進(jìn)行計算，得出各主成分的線性模型：成分綜合總得分M=0.29×Z峰1+0.31×Z峰2+0.45×Z峰3（蘆?。?0.25××Z峰4+0.47×Z峰5+0.23×Z峰6+0.64×Z峰7+0.46×Z峰8+0.49×Z峰9+0.58×Z峰10+0.49×Z峰11+0.31×Z峰12+0.73×Z峰13+0.16×Z峰14+0.30×Z峰15+0.77×Z峰16+0.37×Z峰17（槲皮素）+0.62×Z峰18+0.01×Z峰19+0.63×Z峰20+0.63×Z峰21（山柰素）+0.50×Z峰22+0.57×Z峰23+0.94×Z峰24+0.69×Z峰25+0.65×Z峰26+0.74×Z峰27+0.81×Z峰28+0.85×Z峰29+0.56×Z峰30-0.14×Z峰31+0.69×Z峰32+0.44×Z峰33+0.51×Z峰34+0.23×Z峰35+0.34×Z峰36+0.31×Z峰37+0.63×Z峰38-0.15×Z峰39，其中M代表綜合主成分，Z峰1→Z峰39分別對應(yīng)39個色譜峰峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。綜合得分越高說明質(zhì)量越好，絞股藍(lán)樣品綜合得分情況如表5所示，浙江省的麗水、樂清、龍游、臨安、磐安等地絞股藍(lán)的評分較高，浙江省的湖州、江山、安徽省的宣城、定遠(yuǎn)等地絞股藍(lán)評分均較低。從整體來看，安徽產(chǎn)地絞股藍(lán)樣品的得分分布相對集中，絞股藍(lán)樣品質(zhì)量相對一致；浙江產(chǎn)地的分布區(qū)間較大，絞股藍(lán)樣品質(zhì)量變化較大。

表3 主成分特征值及累計方差百分比

表5 絞股藍(lán)樣品綜合得分表

以23批絞股藍(lán)樣品指紋圖譜的39個共有峰峰面積為變量，采用SIMCAD 13.0軟件進(jìn)行偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）分析，結(jié)果標(biāo)記出6個貢獻(xiàn)較大的成分，依次為17（槲皮素）、27、28、29、30、37、38號色譜峰，導(dǎo)致了絞股藍(lán)成分含量上的差異，因此在制定絞股藍(lán)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時，采用多指標(biāo)成分進(jìn)行質(zhì)量控制。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化：①檢測波長的選擇：絞股藍(lán)中黃酮類有蘆丁、山柰素（山奈酚）、商陸素、商陸苷、槲皮素、異鼠李素等。黃酮類成分的紫外吸收波段為300～400nm，通過二極管陣列檢測器DAD全波段比較分析發(fā)現(xiàn)368nm下絞股藍(lán)出峰較為豐富，各色譜峰響應(yīng)值較高，基線較平，因此選擇368nm作為絞股藍(lán)高相液相指紋圖譜的檢測波長。②流動相：分別考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸溶液和乙腈-0.1%醋酸酸溶液4種流動相體系，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相時，色譜圖基線較平穩(wěn)，峰分離度較好。再次分別考察乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液3種流動相體系，最終選擇乙腈-0.1%磷酸溶液為絞股藍(lán)高相液相指紋圖譜的流動相。

3.2 供試品溶液制備條件的優(yōu)化：以蘆丁、槲皮素、山柰素的提取率為指標(biāo)，采用正交響應(yīng)面法來確定絞股藍(lán)樣品的供試品溶液的制備方法。稱樣量：0.10g→25mL、0.20g→25mL、0.30g→25mL、0.50g→25mL；提取溶劑：甲醇、80%甲醇、50%甲醇、乙醇、80%乙醇、50%乙醇；提取方式：超聲處理15min、超聲處理30min、超聲處理60min、加熱回流15min、加熱回流30min、加熱回流60min。將試驗結(jié)果通過方差分析找出最優(yōu)組合為：稱取絞股藍(lán)樣品0.25g，精密加入80%乙醇25mL，加熱回流45min。

3.3 指紋圖譜相似度評價：葫蘆科絞股藍(lán)屬植物基源復(fù)雜、品類繁多，全球共有16種2變種，其中我國有14種2變種，是絞股藍(lán)屬植物中分布最廣變化最大的一個種，有3小葉、5～7小葉和9小葉的類型，產(chǎn)陜西南部和長江以南各省區(qū)。來自浙江和安徽兩省的23批絞股藍(lán)樣品與對照圖譜的相似度為0.928～0.995，說明不同產(chǎn)地間絞股藍(lán)樣品的質(zhì)量存在差異。但是所收集絞股藍(lán)樣品涵蓋的地域范圍較廣數(shù)量有限，接下來研究中集中一定區(qū)域內(nèi)的絞股藍(lán)并結(jié)合絞股藍(lán)皂苷類成分研究來用于絞股藍(lán)的質(zhì)量評價。

3.4 聚類分析：根據(jù)23批絞股藍(lán)樣品色譜圖和含量測定結(jié)果可知，絞股藍(lán)黃酮類成分和含量差異較大，僅通過相似度的比較尚不能完全體現(xiàn)絞股藍(lán)品質(zhì)的差異性，還進(jìn)行聚類分析和主成分分析。同一省份絞股藍(lán)也可分在不同的組，浙江產(chǎn)的絞股藍(lán)分布在3個組中，安徽的也分布3個組其中有個產(chǎn)地單獨(dú)為一組（安徽蕪湖S17），與相似度評價結(jié)果一致。