太赫茲刺激聽(tīng)神經(jīng)的測(cè)試平臺(tái)搭建

譚曉軒 楊 霄 陳 碩 尹俊凱 馮逸飛 袁一方 吳開(kāi)結(jié)

（1）國(guó)防科技創(chuàng)新研究院太赫茲生物物理學(xué)創(chuàng)新工作站，北京 100071；2）中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心，北京 100094）

太赫茲（terahertz，THz）波介于微波和紅外之間，是電子學(xué)向光子學(xué)過(guò)渡的特殊區(qū)域。20 世紀(jì)90年代之前，太赫茲波段兩側(cè)的微波和紅外的研究相對(duì)已較成熟，但是由于缺乏太赫茲波段的發(fā)射源和檢測(cè)技術(shù)，這一波段一直被稱(chēng)為“太赫茲間隙”。隨著光學(xué)太赫茲技術(shù)在高頻段太赫茲波研究中取得的巨大進(jìn)步，以及微波技術(shù)向低頻段太赫茲波研究中的延伸，太赫茲源與檢測(cè)技術(shù)均取得了突破性的進(jìn)展，太赫茲波的應(yīng)用也迅速擴(kuò)展到了航空航天、環(huán)境科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域，尤其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，太赫茲波作為戰(zhàn)略性資源，將對(duì)生命科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)產(chǎn)生重大貢獻(xiàn)。與其他波段的電磁波相比，太赫茲波具有瞬態(tài)性、寬帶性、低能量性、對(duì)非極性物質(zhì)的高穿透性和極性分子的高吸收性等優(yōu)勢(shì)。生物大分子的轉(zhuǎn)動(dòng)和振動(dòng)頻率大多位于這一頻段內(nèi)，根據(jù)這一特性發(fā)展出來(lái)的太赫茲光譜分析技術(shù)已經(jīng)在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用［1-2］。在分子層面，由于極性分子對(duì)太赫茲波具有強(qiáng)烈的共振吸收，因此太赫茲波可用于檢測(cè)不同極性的氨基酸分子、DNA等信息［3］；在組織層面，可利用太赫茲波對(duì)水分敏感的特性檢測(cè)病變組織并辨別病變區(qū)域的大小和形態(tài)［4］；在器官層面，太赫茲波可有效檢測(cè)齲齒等器官病變［5］。

而在神經(jīng)調(diào)控領(lǐng)域，太赫茲技術(shù)仍處于起步階段。電磁波譜中其他波段電磁輻射與生物體的相互作用已有多年研究歷史，作為最后一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的電磁波段，太赫茲波在未來(lái)有著極大的應(yīng)用空間［6-8］。太赫茲波特殊生物效應(yīng)的利用將成為重要的研究領(lǐng)域，而神經(jīng)效應(yīng)的研究則是重中之重。由于神經(jīng)效應(yīng)的復(fù)雜性，以太赫茲波為主的電磁輻射引起的神經(jīng)系統(tǒng)應(yīng)答目前仍處于未知階段。麥克斯韋方程組的提出極大促進(jìn)了電磁場(chǎng)的研究，然而關(guān)于生物組織特別是神經(jīng)組織電磁特性的研究相對(duì)不足。有學(xué)者提出，生物神經(jīng)信號(hào)的物理場(chǎng)應(yīng)為太赫茲到紅外的高頻電磁場(chǎng)，最可能頻率范圍應(yīng)在THz 到百THz，生物神經(jīng)中電磁信號(hào)的產(chǎn)生、傳輸和耦合等是微納尺度上的，有些甚至是單分子結(jié)構(gòu)水平上的，應(yīng)符合電磁場(chǎng)和量子理論［9］。但一直以來(lái)，從分子、細(xì)胞到在體層面的電磁場(chǎng)活動(dòng)及其作用尚未得到充分研究。內(nèi)源性太赫茲波等高頻電磁信號(hào)神經(jīng)通訊或生理信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制則成為了更具顛覆性的值得驗(yàn)證的科學(xué)假說(shuō)［10-13］。太赫茲波等高頻電磁信號(hào)的神經(jīng)機(jī)制或神經(jīng)效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)和闡明，將成為腦科學(xué)領(lǐng)域顛覆性突破，將對(duì)生命科學(xué)基礎(chǔ)理論產(chǎn)生重構(gòu)性的影響，并引導(dǎo)眾多生物醫(yī)學(xué)學(xué)科的研究思路和技術(shù)方法變革。然而，要比較準(zhǔn)確地研究太赫茲輻射與神經(jīng)組織相互作用的機(jī)理以及指導(dǎo)未來(lái)采取醫(yī)學(xué)防護(hù)的措施，除了理論計(jì)算外［14-15］，還需要大量的在細(xì)胞、組織、在體等不同層面的實(shí)驗(yàn)?；谶@些需要，設(shè)計(jì)一些可以比較科學(xué)地測(cè)試不同強(qiáng)度、不同方式太赫茲輻射效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)裝置，同時(shí)結(jié)合傳統(tǒng)神經(jīng)科學(xué)檢測(cè)手段的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)十分必要。

1 系統(tǒng)構(gòu)成與搭建

1.1 細(xì)胞測(cè)試實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)

該系統(tǒng)主要包括可調(diào)頻太赫茲激光器、光束整形單元、多維度微調(diào)平臺(tái)和細(xì)胞培養(yǎng)箱等，其中，可調(diào)頻太赫茲激光器用于產(chǎn)生太赫茲波段的高頻電磁脈沖，光束整形單元用于將太赫茲波擴(kuò)束、整形并聚焦至細(xì)胞培養(yǎng)皿底部（反射鏡：金鏡，擴(kuò)束器：GBE10-E3，Thorlabs），多維度微調(diào)平臺(tái)用于調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)皿位置，將目標(biāo)區(qū)域和光斑微調(diào)對(duì)準(zhǔn)，細(xì)胞培養(yǎng)箱放置在輻照系統(tǒng)旁邊，方便細(xì)胞的取放和活性的維持，細(xì)胞培養(yǎng)皿放置在多維度微調(diào)平臺(tái)上，光束經(jīng)45°反射鏡后輻照到細(xì)胞培養(yǎng)皿底部，功率可達(dá)500 mW，光斑大小可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求利用光束整形單元進(jìn)行調(diào)節(jié)。細(xì)胞測(cè)試系統(tǒng)基本裝置如圖1，2所示。

1.2 膜片鉗電生理-太赫茲聯(lián)合檢測(cè)系統(tǒng)

該系統(tǒng)主要包括可調(diào)諧高峰值功率太赫茲輻照系統(tǒng)和膜片鉗電生理檢測(cè)系統(tǒng)。其中可調(diào)諧高峰值功率太赫茲輻照系統(tǒng)包括可調(diào)頻太赫茲激光器、光束整形單元、光纖耦合器、多維度微調(diào)平臺(tái)和光纖，可調(diào)頻太赫茲激光器和光束整形單元的作用與細(xì)胞測(cè)試實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)一致，光纖耦合器用于固定光纖輸入端，多維度微調(diào)平臺(tái)用于調(diào)節(jié)光纖耦合器位置，將光纖輸入端和光斑微調(diào)對(duì)準(zhǔn)，從而控制輸出功率，光纖輸入端接收太赫茲波，光纖輸出端將太赫茲波導(dǎo)入生物細(xì)胞或組織，光纖為柔性光纖，因此刺激靶點(diǎn)改變具有很好的靈活性。光纖位置和電生理檢測(cè)用電極的位置分別用不同電機(jī)控制（圖3），可以根據(jù)目標(biāo)細(xì)胞靈活調(diào)節(jié)兩者之間的相對(duì)位置，將可調(diào)諧高峰值功率太赫茲輻照系統(tǒng)和膜片鉗電生理檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行了一體化聯(lián)合和集成，可以實(shí)時(shí)檢測(cè)輻照前后神經(jīng)組織的各項(xiàng)生理活性。

Fig.1 Physical photo of cell testing system

Fig.2 Schematic diagram of terahertz optical path

1.3 雙光子-太赫茲聯(lián)合在體檢測(cè)系統(tǒng)

該系統(tǒng)主要包括可調(diào)諧高峰值功率太赫茲輻照系統(tǒng)和在體雙光子檢測(cè)系統(tǒng)?？烧{(diào)諧高峰值功率太赫茲輻照系統(tǒng)與膜片鉗電生理-太赫茲聯(lián)合檢測(cè)系統(tǒng)一致，包括可調(diào)頻太赫茲激光器、光束整形單元、光纖耦合器、多維度微調(diào)平臺(tái)和光纖。本課題組沿用了經(jīng)典的雙光子成像系統(tǒng)，在不改變光路結(jié)構(gòu)的前提下，將太赫茲光纖直接從電磁屏蔽罩上引入小鼠頭部暴露位置，太赫茲光纖、小鼠固定裝置和透鏡分別由不同的電極控制，可以隨意調(diào)節(jié)水平位置以及成像深度（圖4a）。還設(shè)計(jì)了小鼠頭部固定的專(zhuān)用裝置，可以將清醒狀態(tài)下小鼠皮層抖動(dòng)降至最低。圖4b 為大尺度成像視野下轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元接收輻照時(shí)的實(shí)物圖。

Fig.3 Physical photo(a)and schematic diagram(b)of patch-clamp electrophysiology-terahertz joint detection system

Fig.4 Physical photo of two-photo-terahertz joint detection system in vivo

1.4 聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)（auditory brainstem response，ABR）-太赫茲聯(lián)合檢測(cè)系統(tǒng)

該系統(tǒng)主要包括可調(diào)諧高峰值功率太赫茲輻照系統(tǒng)和ABR 檢測(cè)系統(tǒng)?？烧{(diào)諧高峰值功率太赫茲輻照系統(tǒng)與膜片鉗電生理-太赫茲聯(lián)合檢測(cè)系統(tǒng)一致，包括可調(diào)頻太赫茲激光器、光束整形單元、光纖耦合器、多維度微調(diào)平臺(tái)和光纖。ABR 測(cè)試使用的是傳統(tǒng)的聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)測(cè)試系統(tǒng)，使用聽(tīng)覺(jué)電生理測(cè)量裝置（TDT system，USA）來(lái)記錄并測(cè)量ABR。每次使用前進(jìn)行聲音強(qiáng)度校準(zhǔn)，一個(gè)麥克風(fēng)（Model 7016，ACO Pacific，Ⅰnc.，USA）接收到聲音信號(hào)并轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，由TDT 系統(tǒng)采集并傳送到計(jì)算機(jī)，經(jīng)計(jì)算確定實(shí)際聲壓級(jí)。使用閉合聲場(chǎng)來(lái)播放聲音，聲音由揚(yáng)聲器EC 1 發(fā)出，并通過(guò)一根聚合物材料制成的細(xì)管將聲音傳送到動(dòng)物耳朵，太赫茲波由光纖導(dǎo)入豚鼠耳蝸（圖5）。

Fig.5 Physical photo of ABR-terahertz combined detection system

2 使用與結(jié)果

2.1 細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)

太赫茲波與DNA、RNA、蛋白質(zhì)等重要生物大分子的轉(zhuǎn)動(dòng)和振動(dòng)能級(jí)最為吻合。根據(jù)“中心法則”，太赫茲波與生物大分子的相互作用結(jié)果，終將影響細(xì)胞乃至組織的功能和結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生太赫茲波獨(dú)有的生物效應(yīng)。通過(guò)對(duì)使用該系統(tǒng)輻照后的細(xì)胞進(jìn)行病理或生理上分子水平的檢測(cè)，可以獲得生物樣品經(jīng)太赫茲波作用后本身的變化，獲得生物性質(zhì)變化指標(biāo)，以研究太赫茲生物效應(yīng)及其安全性或開(kāi)發(fā)特殊的應(yīng)用方式，并且可以為神經(jīng)通訊、生理信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2.2 膜片鉗聯(lián)合檢測(cè)系統(tǒng)

由于膜片鉗系統(tǒng)對(duì)電磁屏蔽要求較高，為了驗(yàn)證膜片鉗電生理-太赫茲聯(lián)合檢測(cè)系統(tǒng)的工作能力，本文首先測(cè)試了系統(tǒng)噪音。該實(shí)驗(yàn)使用野生型C57小鼠（雌雄隨機(jī)），實(shí)驗(yàn)小鼠年齡為2～3個(gè)月。腹腔注射麻醉劑戊巴比妥鈉（注射量：10 mg/kg），深度麻醉后（無(wú)足痛反應(yīng)），迅速斷頭取腦并置于預(yù)冷至0℃的人工腦脊液中，使用振動(dòng)切片機(jī)（VT-1200s Leica）將腦組織切片，腦薄片厚度為250 μm，切片完成后，立即將切片轉(zhuǎn)移至充分充氧的人工腦脊液中進(jìn)行孵育，孵育溫度為34.5℃。時(shí)間為45～60 min，之后置于室溫待記錄。使用電壓鉗模式（圖6），將神經(jīng)元膜電位控制在靜息電位-70 mV 附近，記錄了10 s 神經(jīng)元的膜電位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聯(lián)合檢測(cè)系統(tǒng)記錄到的神經(jīng)細(xì)胞的電信號(hào)和電學(xué)性質(zhì)不會(huì)被噪音淹沒(méi)。

Fig.6 Cell membrane potential recorded when the terahertz laser is switched on

接下來(lái)使用該系統(tǒng)測(cè)試了太赫茲輻照對(duì)腦片中神經(jīng)元興奮性突觸后電流的影響，分別記錄了輻照前（黑色部分）和輻照時(shí)（紅色部分）的興奮性突觸后電流的發(fā)放情況（圖7），可見(jiàn)系統(tǒng)能穩(wěn)定長(zhǎng)時(shí)間記錄輻照前后電流發(fā)放的信號(hào)并比較輻照對(duì)神經(jīng)信號(hào)產(chǎn)生和傳導(dǎo)的影響。

Fig.7 Excitatory postsynaptic currents in neurons before(black)and after(red)terahertz irradiation

2.3 雙光子聯(lián)合檢測(cè)系統(tǒng)

該實(shí)驗(yàn)在普通C57 小鼠上進(jìn)行（雌雄隨機(jī)），實(shí)驗(yàn)小鼠年齡2～3個(gè)月。通過(guò)體外注射帶有鈣指示劑GCaMP的AAV病毒到目標(biāo)區(qū)域?qū)ι窠?jīng)元進(jìn)行標(biāo)記。在病毒攜帶的基因表達(dá)后，用鈣成像的方式對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行鈣活動(dòng)記錄，圖8為小鼠在輻照前、輻照時(shí)（橙色陰影部分）、輻照后自發(fā)活動(dòng)的對(duì)比。可以看到，此雙光子-太赫茲聯(lián)合在體檢測(cè)系統(tǒng)可以實(shí)時(shí)探測(cè)太赫茲波對(duì)神經(jīng)元鈣活動(dòng)影響的瞬時(shí)變化，反映太赫茲刺激對(duì)神經(jīng)活動(dòng)的影響［16］。

Fig.8 Calcium signal release during terahertz irradiation(between the red dotted lines)[16]

2.4 聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)檢測(cè)系統(tǒng)

該實(shí)驗(yàn)在普通成年豚鼠上進(jìn)行（雌雄隨機(jī)），體重250～350 g。首先進(jìn)行豚鼠耳后開(kāi)窗手術(shù)，然后進(jìn)行ABR 測(cè)試。測(cè)試前首先將豚鼠麻醉（腹腔注射2%戊巴比妥鈉0.1 ml），確認(rèn)動(dòng)物處于麻醉狀態(tài)后，將動(dòng)物置于加熱墊上，在動(dòng)物雙耳中點(diǎn)、耳后和大腿內(nèi)側(cè)皮膚下分別插入記錄電極、參比電極和接地電極，確保電極電阻小于1 KΩ。原始信號(hào)ABR采樣率為25 kHz，記錄300～3 000 Hz的信號(hào)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)動(dòng)物的呼吸、心跳、體溫等生命體征進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以確保動(dòng)物處于正常狀態(tài)，每個(gè)刺激連續(xù)進(jìn)行512次，以提高平均信噪比。所有的操作均在電磁屏蔽的隔音室中進(jìn)行。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，該系統(tǒng)的ABR 采集效果良好，成功得到了輻照期間豚鼠的ABR 信號(hào)（圖9），可以檢測(cè)太赫茲輻照對(duì)動(dòng)物聽(tīng)力閾值的影響，符合實(shí)驗(yàn)研究的要求。

Fig.9 ABR test results before and after irradiation

3 討 論

當(dāng)前國(guó)內(nèi)外針對(duì)電磁場(chǎng)的生物效應(yīng)研究主要集中在以微波、毫米波為代表的低頻電磁場(chǎng)和以紅外為代表的高頻電磁場(chǎng)所產(chǎn)生的對(duì)模式動(dòng)物影響的實(shí)驗(yàn)研究［17-19］，而幾乎所有的生物分子的轉(zhuǎn)動(dòng)和振動(dòng)躍遷都在介于毫米波和紅外之間的太赫茲波頻段表現(xiàn)出強(qiáng)烈的吸收和色散［20-22］。目前，國(guó)際上很多國(guó)家如美國(guó)、日本、俄羅斯等已經(jīng)開(kāi)始著手太赫茲輻射的生物效應(yīng)裝置、系統(tǒng)或樣機(jī)的研究，應(yīng)用對(duì)象包括細(xì)胞、組織、動(dòng)物等［23-25］，以期突破太赫茲輻射源技術(shù)和輻射條件對(duì)太赫茲生物效應(yīng)研究的限制，但均還處在初級(jí)階段。中國(guó)整體太赫茲技術(shù)和太赫茲應(yīng)用研究起步較晚，設(shè)計(jì)制作以太赫茲為主的電磁輻射裝置，研究太赫茲刺激對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響，將對(duì)神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域和醫(yī)療科技帶來(lái)突破性的進(jìn)展。

4 結(jié) 論

本文利用自主搭建的可調(diào)諧高峰值功率太赫茲輻照系統(tǒng)，分別在細(xì)胞、組織和在體層面研制了太赫茲生物效應(yīng)檢測(cè)系統(tǒng)，均已投入使用，經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試可以有效地在不同尺度上檢測(cè)太赫茲波對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)不同生理活動(dòng)的影響［16，26］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，該系統(tǒng)設(shè)計(jì)精巧、操作簡(jiǎn)單，而且應(yīng)用廣泛，不僅可以應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)的測(cè)試，還可以根據(jù)需求測(cè)試太赫茲波對(duì)其他組織（例如皮膚、血液、心肌細(xì)胞）的影響，有利于解析太赫茲波對(duì)不同生命活動(dòng)的效應(yīng)，以此探尋太赫茲波對(duì)生物多功能集群的影響。