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    新型冠狀病毒抗原檢測試劑性能評價相關(guān)研究進展

    2022-12-22 08:39:16方慧玲陳子齊朱宇清
    檢驗醫(yī)學(xué) 2022年11期
    關(guān)鍵詞:核酸試劑抗原

    方慧玲, 陳子齊, 朱宇清

    (上海市臨床檢驗中心,上海 200126)

    自2019年世界范圍內(nèi)的新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)疫情暴發(fā)以來,各國為應(yīng)對疫情采取了不同的防控策略。我國采取動態(tài)清零的防控政策。新型冠狀病毒核酸檢測陽性是COVID-19確診的首要標準,新型冠狀病毒特異性抗體檢測可作為未接種疫苗患者的診斷參考依據(jù)[1]。隨著疫情防控形勢的變化,相關(guān)部門規(guī)定了3類人群可以應(yīng)用抗原檢測進行自我檢測或人員篩查[2],作為核酸檢測能力不足時的補充。本文對我國新型冠狀病毒抗原檢測試劑盒性能和國內(nèi)外相關(guān)研究進行綜述。

    1 新型冠狀病毒病原學(xué)特征

    新型冠狀病毒屬于β冠狀病毒屬,是有包膜的單股正鏈RNA病毒,病毒的顆粒直徑約為100 nm。其基因組從5'端開始到3'端,分別有12個(ORF1a、ORF1b、S、ORF3a、E、M、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、N、ORF10)開放閱讀框和3'端多聚腺苷酸尾[3]。S、E、M、N分別編碼刺突(spike,S)蛋白、包膜(envelope,E)蛋白、膜(membrane,M)蛋白和核衣殼(nucleocapsid,N)蛋白4種結(jié)構(gòu)蛋白。因冠狀病毒的ORF1ab、N和E基因序列高度保守,現(xiàn)有的核酸檢測方法均選擇ORF1ab、N和E基因區(qū)域序列設(shè)計引物和探針。S基因是新型冠狀病毒高度可變的基因,其編碼的S蛋白(高度糖基化的Ⅰ型膜蛋白)通過與其受體結(jié)合進入宿主細胞[4],與病毒的傳染能力密切相關(guān)。N蛋白則與病毒基因組宿主RNA相互識別,參與基因組復(fù)制和細胞信號通路調(diào)節(jié)。因此,免疫學(xué)檢測系統(tǒng)通常選用針對N蛋白或S蛋白抗原表位的抗體進行系統(tǒng)構(gòu)建。

    2 新型冠狀病毒抗原檢測

    從病毒進入人體到在人體樣本中檢測到新型冠狀病毒抗原的這段時間被稱為抗原檢測的窗口期。人體在感染新型冠狀病毒的平均5~6 d后會出現(xiàn)相應(yīng)癥狀(部分人群無癥狀表現(xiàn)但也有傳染力),病毒大量繁殖,呼吸道樣本中病毒含量最高[5]。有文獻報道,冠狀病毒N蛋白抗原在臨床癥狀出現(xiàn)前1 d就可被檢測到[6]。有研究結(jié)果顯示,N蛋白抗原在患者出現(xiàn)癥狀的第2天開始顯著上升,并在出現(xiàn)癥狀的第2~7天達到峰值,隨后開始下降[7]。

    2.1 新型冠狀病毒抗原檢測技術(shù)

    病原微生物抗原檢測常用的方法有化學(xué)發(fā)光法(chemiluminescence immunoassay,CLIA)、電化學(xué)發(fā)光法(electrochemiluminescence assay,ECLIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、側(cè)向流免疫層析法(lateral flow immunochromatography assay,LFIA)。目前的新型冠狀病毒抗原快速檢測試劑主要是基于LFIA。

    LFIA是一種快速免疫層析方法,已被廣泛應(yīng)用于臨床多種病原微生物檢測,與其他免疫學(xué)檢測技術(shù)相比,其最大的特點就是快速、簡便。檢測卡主要由樣品墊、結(jié)合墊、醋酸纖維素膜、吸水墊,以及用于支撐的聚氯乙烯背板卡盒組成。結(jié)合墊上包被有不同示蹤技術(shù)的標記抗體,醋酸纖維素膜上有通過劃線靜電吸附的方式分別在測試線和對照線上包被單克隆抗體及抗標記抗體的二抗。當樣品從進樣孔進入樣品墊后,樣品中的新型冠狀病毒抗原通過毛細作用迅速移動,與結(jié)合墊上的標記抗體結(jié)合,并進一步移動,與測試線上的單克隆抗體結(jié)合,而過量的標記抗體則繼續(xù)移動,與控制線上的二抗結(jié)合。最終通過肉眼或特定儀器讀取測試線和控制線上標記物的信號強弱來判定結(jié)果。近年來,隨著量子點、上轉(zhuǎn)發(fā)光、碳納米管、納米酶等新型技術(shù)與材料科學(xué)的發(fā)展,LFIA與傳統(tǒng)的膠體金技術(shù)相比,檢測性能更加穩(wěn)定[8]。GRANT等[9]應(yīng)用half-strip LFIA技術(shù)檢測新型冠狀病毒抗原,靈敏度可達0.65 ng/mL。

    通過電化學(xué)、光學(xué)、微流控等生物傳感技術(shù)也可實現(xiàn)病毒抗原定量檢測。YAKON等[10]發(fā)明了一種新型紙基電化學(xué)傳感器,將其應(yīng)用于新型冠狀病毒S抗原檢測,最低檢測限可達0.11 ng/mL,該方法為非標記定量技術(shù),因此不需要依賴于任何抗體。材料科技的進步在大大提高生物樣本檢測靈敏度的同時也縮短了檢測時間。儀器尺寸的縮小使設(shè)備的應(yīng)用場景更為靈活,有學(xué)者研發(fā)出一種基于高密度導(dǎo)電納米線陣列的柔性免疫傳感器的智能口罩,小型化的阻抗電路和無線通信單元嵌入,以及<100 nm的納米線尺寸和相鄰納米線間距,可成功鎖定納米級別的病毒顆粒,有效識別從口腔呼出氣體中的冠狀病毒S蛋白;對霧化氣溶膠中冠狀病毒的檢測能力達到7 PFU/mL,耗時僅5 min[11]。

    2.2 新型冠狀病毒抗原檢測試劑性能

    盡管新型冠狀病毒快速檢測試劑具有簡單、快速等諸多優(yōu)點,但其臨床檢測性能一直存在爭議。SCOHY[12]等對106份新型冠狀病毒逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)檢測結(jié)果為陽性的鼻咽拭子樣本進行了抗原快速檢測,結(jié)果僅有32份(30.2%)陽性。而PORTE等[13]對82份鼻/口咽拭子樣本的比對結(jié)果顯示,其測試的快速檢測試劑的敏感性和特異性分別為93.9%和100.0%。全球創(chuàng)新診斷基金會(the Foundation for Innovative New Diagnostics,F(xiàn)IND)在一項全球范圍內(nèi)的新型冠狀病毒快速檢測試劑評估計劃中,評估了28個品牌的檢測試劑[14],其中包括14個中國企業(yè)研發(fā)的試劑盒,截至2022年3月16日,已經(jīng)完成評估的9家中國企業(yè)研發(fā)的10種試劑盒的評估數(shù)據(jù)顯示,抗原檢測試劑敏感度多為70.5%~92.1%,特異性多為98.3%~100%,≤7 d敏感度為74.2%~96.2%;檢測RT-PCR循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct)≤25的樣品的敏感性為80.3%~100.0%,檢測Ct值≤33的樣品的敏感性為76.3%~100.0%。德國聯(lián)邦疫苗及生物醫(yī)學(xué)研究所(Paul-Ehrlich Institute,PEI)的性能評估數(shù)據(jù)也反映了相似的結(jié)果[15],其中部分中國品牌的檢測試劑的驗證結(jié)果顯示,在Ct值≤25時,所驗證試劑的敏感度均>85%;但在Ct值為25~30時,僅有3個品牌的試劑敏感度>85%;而當Ct值≥30時,所有品牌試劑的驗證敏感度均<70%;各品牌試劑最終評估的總體臨床靈敏度為34%~92%。RT-PCR檢測的Ct值代表檢測樣本中的病毒載量,Ct值越低,說明檢測樣本中病毒載量越高,提示抗原檢測的窗口時間要長于核酸檢測;評估樣本中病毒載量越高,受評抗原快速檢測試劑的靈敏度也越高。FIND多中心研究數(shù)據(jù)[14]顯示,即使同一個品牌的檢測試劑,在不同的檢測點呈現(xiàn)的性能參數(shù)也不一致,如印度地區(qū)的檢測靈敏度比其他地區(qū)低,具體機制尚不明確,可能與印度地區(qū)的溫度和濕度有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),當試劑盒于37 ℃溫浴10 min后,再于37 ℃下進行檢測,45.5%的試劑盒靈敏度下降了90%,隨著時間的延長,靈敏度下降的試劑更多,而2~4℃環(huán)境則有可能使試劑盒的特異性降低[16]。值得注意的是,目前關(guān)于新型冠狀病毒抗原檢測試劑性能的研究均以核酸檢測方法為參比方法,但不同方法學(xué)的核酸檢測性能不盡相同,同一品牌的抗原檢測試劑以不同的核酸檢測方法為參比方法時,其性能評價結(jié)果也不同[17]。DINNES等[18]對新型冠狀病毒抗原快速檢測方法的相關(guān)研究進行了薈萃分析,發(fā)現(xiàn)不同品牌試劑盒的檢測靈敏度存在顯著差異。

    表1 中國品牌新型冠狀病毒抗原快速診斷試劑FIND的評估數(shù)據(jù)

    續(xù)表1

    3 新型冠狀病毒抗原檢測的應(yīng)用

    截至2022年4月13日,美國食品藥品監(jiān)督管理局緊急授權(quán)使用CLIA、ECLIA、LFIA、MIFA和生物傳感器等方法進行新型冠狀病毒抗原檢測的50個試劑,其中19個品牌試劑被授權(quán)用于家庭自測。我國國家藥品監(jiān)督管理局共批準了27個品牌新型冠狀病毒抗原檢測試劑作為國家應(yīng)急儲備。這27個品牌的抗原檢測試劑均為基于LFIA的快速檢測產(chǎn)品,均可在30 min內(nèi)給出檢測結(jié)果,差異在于部分試劑覆蓋識別的抗原表位和標記顯色技術(shù)不同。27種檢測試劑中,有15種通過了PEI的性能驗證,并被德國聯(lián)邦藥品和醫(yī)療器械管理局列入專業(yè)使用或家庭自測白名單。

    世界衛(wèi)生組織提出,新型冠狀病毒抗原快速檢測試劑在滿足最低檢測性能要求(敏感性80%,特異性97%)的情況下可用于有癥狀人群的檢測[19]。定性檢測方法的性能評價指標除靈敏度和特異性外,還包括檢出限、重復(fù)性、符合率、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值[20-21]。在方法開發(fā)過程中,增加靈敏度,就一定會損失一部分特異性,反之亦然。當靈敏度的增加幅度超過一定范圍時(1-特異性),陽性預(yù)測值就會增加,反之將下降。但在有更為“準確”的驗證方法的情況下,作為用于普通人群篩查的快速檢測試劑,首先應(yīng)該保證的是對“真陰性”人群的準確識別,提高其篩查的陰性樣本為陰性的可能性(陰性預(yù)測值)。選擇高靈敏度的檢測方法,可以最大限度地減少漏診活躍病例(假陰性)的可能性,快速切斷傳播鏈。而這些試劑在真實世界中檢測的陽性結(jié)果,對于不同的應(yīng)用場景,會有不同的解讀:在發(fā)病率(患病率)為1%的地區(qū)或人群中,用敏感性為85%、特異性為98.9%的檢測試劑對10 000人進行篩查,可檢出陽性184例,但其中真實陽性的僅有85例,另外99例均為假陽性,此時陽性預(yù)測值僅為46.20%;但當該試劑被應(yīng)用于發(fā)病率(患病率)為10%的地區(qū)或人群時,10 000人檢測的陽性結(jié)果將會有940例,其中真陽性為850例,假陽性為90例,陽性預(yù)測值為90.43%;此時的陽性結(jié)果對于疾病診斷的指示作用大幅提高[18]。因此,世界衛(wèi)生組織并不建議在預(yù)期患病率低的地區(qū)或人群中使用快速檢測試劑。

    2022年3—5月,新型冠狀病毒奧密克戎變異株在上海市流行,當?shù)卣畬Σ煌L(fēng)險區(qū)域采取了差異化的篩查方式,抗原快速檢測作為核酸檢測的補充,有效彌補了大規(guī)模核酸檢測耗時長的不足。對低風(fēng)險地區(qū)增加抗原篩查,利用抗原檢測速度快的特點,快速固定異常人群,以降低人員流動帶來的疾病傳播風(fēng)險,提高檢測效率。同時,在醫(yī)院門急診患者無有效核酸檢測報告的情況下,可根據(jù)現(xiàn)場抗原篩查的陰性結(jié)果先行救治,在提升就醫(yī)效率的同時,也避免產(chǎn)生醫(yī)患矛盾。

    4 討論

    現(xiàn)有的新型冠狀病毒檢測方法中,核酸檢測只針對特定病毒基因的特定片段進行擴增,從方法學(xué)來說,其特異性為100%,因此是新型冠狀病毒抗原檢測準確與否的“金標準”?,F(xiàn)有的核酸檢測方法靈敏度多為10~150拷貝/反應(yīng),已有研究報道部分檢測方法靈敏度可達到1拷貝/反應(yīng)[17],是抗原檢測的靈敏度的100~1 000倍。核酸檢測具有嚴格的環(huán)境與儀器設(shè)備要求,需要熟練的操作人員,樣本周轉(zhuǎn)時間為4~6 h,甚至更長。而抗原檢測快速、簡便,可大大提升檢測效率,推動防控哨點前移,在疾病流行時的人群篩查中有良好的輔助功能。對于抗原檢測試劑的應(yīng)用,有幾個方面的問題需要持續(xù)關(guān)注。

    (1)新型冠狀病毒的變異性。與更早的毒株相比,奧密克戎株(B.1.1.529型)發(fā)生了重大變異,50個變異位點中有超過30個氨基酸位點的變異發(fā)生在S蛋白處。有學(xué)者[22]評估了商品化新型冠狀病毒中和抗體對不同變異株的中和能力,發(fā)現(xiàn)44個中和抗體中,僅有6個單抗對奧密克戎毒株仍舊保持較強的中和能力,這6個單抗均識別奧密克戎或其他冠狀病毒保守的抗原位點。提示S蛋白作為病毒的豐富的跨膜蛋白具有很強的免疫原性,同時其氨基酸序列的多樣性也使其更容易與其他冠狀病毒區(qū)別開,試劑開發(fā)者和專業(yè)的檢測機構(gòu)有必要采取一些措施來降低與新型冠狀病毒突變相關(guān)的敏感性或無反應(yīng)性導(dǎo)致假陰性結(jié)果的潛在風(fēng)險。

    (2)醫(yī)學(xué)檢測實驗室開展抗原檢測的質(zhì)量保證。專業(yè)技術(shù)人員在項目開展前應(yīng)對試劑性能進行充分的評估,必須關(guān)注每個批次的試劑質(zhì)量。盡管快速抗原檢測試劑卡上設(shè)計了控制線,可對試劑卡的有效性進行判斷,但控制線呈反應(yīng)性僅代表標記抗體完成了從結(jié)合墊到吸水墊的層析過程,并不能保證層析過程中標記抗體-抗原-單克隆抗體的結(jié)合反應(yīng)。因此,專業(yè)技術(shù)人員面對大量檢測樣品時,應(yīng)采用第三方質(zhì)量控制產(chǎn)品確保實驗室檢測質(zhì)量。此外,實驗室應(yīng)加強其分析前質(zhì)量控制,規(guī)范技術(shù)人員樣本采集。采樣時,應(yīng)使用試劑配套的樣本保存液,不能使用被篩查人員核酸檢測樣本保存液內(nèi)的樣本進行抗原檢測。

    (3)自測人員應(yīng)仔細閱讀試劑說明書,按要求完成樣本采集和檢測。應(yīng)規(guī)范處理檢測產(chǎn)生的廢棄物,尤其是檢測結(jié)果為陽性時,應(yīng)作為醫(yī)療廢棄物交由專業(yè)人員處理。

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