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    長鏈醇類和油類物質(zhì)洗滌液在磁珠法DNA和RNA共提取中的應(yīng)用

    2022-12-22 08:39:14李福剛陳華劍謝國明
    檢驗(yàn)醫(yī)學(xué) 2022年11期
    關(guān)鍵詞:洗滌液微流磁珠

    王 鼎, 李福剛, 羅 旺, 陳華劍, 張 珂, 謝國明

    (1.重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400042;2.上海奧普生物醫(yī)藥股份有限公司,上海 201399)

    快速、靈敏的病原體核酸檢測已經(jīng)成為防控公共衛(wèi)生事件的重要方法。從生物樣本中提取高純度的核酸在確保核酸檢測準(zhǔn)確性中起著極其重要的作用[1]。傳統(tǒng)的核酸提取方法需要復(fù)雜的設(shè)備,操作繁瑣,耗時(shí)長,容易引起交叉污染和核酸樣本損失。微流控技術(shù)具有集成化、自動(dòng)化的特點(diǎn),其完全密封的流體系統(tǒng)可避免核酸樣本的交叉污染和損失[2]。因此,將微流控技術(shù)應(yīng)用于核酸提取,有助于實(shí)現(xiàn)快速、高效、自動(dòng)化的核酸檢測,對(duì)于病原體感染的早期診斷和及時(shí)治療具有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值。目前,微流控核酸提取的主要問題在于傳統(tǒng)的70%乙醇洗滌液存在易揮發(fā)、易燃的缺點(diǎn),嚴(yán)重制約了其在微流控領(lǐng)域的應(yīng)用。此外,乙醇?xì)埩魧?duì)后續(xù)的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loopmediated isothermal amplification,LAMP)等檢測步驟,尤其是對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增有明顯的抑制作用。有研究結(jié)果顯示,一些無揮發(fā)性的油性物質(zhì),如硅油、FC-40、長鏈醇類均可作為核酸提取的洗滌液候選物,處理后的核酸回收率較高,且對(duì)后續(xù)的擴(kuò)增抑制作用很小,甚至無抑制作用[3]。另外,油性物質(zhì)還具有儲(chǔ)存條件寬松和儲(chǔ)存期較長的優(yōu)點(diǎn)。為此,本研究擬探討以8種長鏈醇類和油類物質(zhì)作為洗滌液在磁珠法核酸提取中的應(yīng)用價(jià)值,旨在克服微流控技術(shù)在臨床應(yīng)用中的局限性。

    1 材料和方法

    1.1 試劑和儀器

    硫氰酸胍、Tris-Base、氯化鈉、檸檬酸鈉、乙二胺四乙酸、二甲基硅油、十一醇、正癸醇、正辛醇、1-壬醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,2-十二烷醇、FC-40購自西寶生物科技(上海)股份有限公司。磁性微球購自蘇州為度生物技術(shù)有限公司。北京康為世紀(jì)生物科技有限公司MagBead Virus DNA/RNA Kit和北京啟研生物科技有限公司核酸提取/純化試劑盒。PCR master mix、RT-PCR master mix由上海奧普生物醫(yī)藥股份有限公司研發(fā)。PCR引物序列采用肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,Mp)基因:上游引物MP-F為5'-CAACATCTGGGACTGGACTGTA-3'、下游引物MP-R為5'-GCCCTATGATTTAGAGATTGCGG-3'、探針引物MP-P-FAM/BHQ為5'-CCTTCAGCCCCAAAACCATCACAGG-3'。RT-PCR所用引物序列采用呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)基因:上游引物RSV-F為5'- AACTCTGGGGCAAATAACAA-3'、下游引物RSV-R為5'-GCRTCTGTWCCATTACACTT-3'、探針引物RSV-P-ROX/BHQ為5'-GCAAAGGCTATCTTAGTGCTCT-3'。引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR所用的DNA模板為含引物基因片段的質(zhì)粒,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。RT-PCR所用的RNA模板為轉(zhuǎn)錄RNA,先由生工生物工程(上海)股份有限公司合成含引物匹配基因片段的質(zhì)粒,在基因序列前加入T7序列,再用HiScribe T7 Quick RNA Synthesis Kit(美國NEB公司)轉(zhuǎn)錄出RNA,并用RNeasy Mini kit(德國Qiagen公司)純化。Mp及培養(yǎng)基均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC),嚴(yán)格按菌株說明書進(jìn)行培養(yǎng)。Q5熒光定量PCR儀購自美國ThermoFisher Scientific公司。

    1.2 方法

    1.2.1 溶液配制 (1)吸附液:3.6 mol/L硫氰酸胍,10 mmol/L Tris-Base,800 mmol/L氯化鈉,200 mmol/L檸檬酸鈉,pH值5.2。(2)洗脫液:10 mmol/L Tris-Base,1 mmol/L乙二胺四乙酸,pH值8.4。

    1.2.2 核酸提取 取200 μL待提取的樣本,加入400 μL核酸提純吸附液,加入1.0 mg磁珠,在旋轉(zhuǎn)儀上以20 r/min搖勻5 min,用磁力架吸附磁珠,吸棄管中的液體;加入800 μL洗滌液,充分混勻后,用磁力架吸附磁珠,吸棄管中的液體;加入200 μL洗脫液,充分混勻后,在旋轉(zhuǎn)儀上以20 r/min搖勻解吸附5 min,用磁力架吸附磁珠,待磁珠全部被吸附后,吸出核酸提取物,作為擴(kuò)增模板。

    1.2.3 PCR和RT-PCR (1)反應(yīng)體系:PCR reaction master mix或RT-PCR reaction master mix 5 μL,10 μmol/L引物各1 μL,10 μmol/L探針各0.5 μL,待測樣本2 μL,用無核酸酶水補(bǔ)至總體積15 μL。(2)PCR擴(kuò)增條件:95 ℃ 2 min;94 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s,50個(gè)循環(huán)。RT-PCR在PCR擴(kuò)增條件前增加60 ℃ 5 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

    1.2.4 模擬臨床樣本制備 用咽拭子在健康人咽喉部采樣,在保存液中涮洗,取4 mL涮洗液加入100 μL Mp培養(yǎng)物,混勻,制成Mp模擬臨床樣本。95 ℃金屬浴5 min,熱裂解產(chǎn)物等量分裝,測試不同核酸提取方法的性能,并與商品化核酸提取試劑盒進(jìn)行比較。

    1.2.5 不同洗滌液對(duì)核酸提取的影響 (1)以102~105拷貝/μL的DNA和RNA混合物為待提取樣本,以5種長鏈醇類物質(zhì)(十一醇、正癸醇、正辛醇、1-壬醇、2-十二烷醇)和3種油類物質(zhì)(二甲基硅油、FC-40、石蠟油)為洗滌液,以70%乙醇為陽性對(duì)照,采用磁珠法進(jìn)行核酸提取,比較8種洗滌液的核酸提取性能。(2)在15 μL反應(yīng)體系中添加3 μL長鏈醇類或油類洗滌液,以3 μL ddH2O為陰性對(duì)照,分析8種洗滌液殘留對(duì)101~103拷貝/μL DNA和RNA模板擴(kuò)增的影響。(3)以二甲基硅油、FC-40和70%乙醇作為洗滌液,分別與濕式試劑、干式試劑配合使用,對(duì)103拷貝/μL DNA和RNA模板進(jìn)行提取,比較不同試劑狀態(tài)下的核酸提取性能。(4)以二甲基硅油、FC-40和70%乙醇作為洗滌液,分別采用渦旋混勻、移液槍混勻、顛倒混勻3種混勻方式,比較不同混勻方式下103拷貝/μL DNA和RNA模板的核酸提取性能。(5)分析以二甲基硅油、FC-40和70%乙醇為洗滌液的磁珠法對(duì)Mp模擬臨床樣本中病原體基因組DNA的提取性能,并與商品化核酸提取試劑盒A和試劑盒B進(jìn)行比較。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 8種洗滌液的核酸提取性能

    8種洗滌液中,二甲基硅油和FC-40均能成功提取102~105拷貝/μL的DNA和RNA,提取性能與70%乙醇比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。十一醇未能成功提取出102拷貝/μL DNA,其他5種洗滌液在提取102~104拷貝/μL DNA和RNA模板時(shí)均有不同程度的提取失敗。見表1。

    表1 8種洗滌液對(duì)102~105拷貝/μL DNA和RNA的提取性能

    2.2 8種洗滌液殘留對(duì)核酸擴(kuò)增的影響

    8種洗滌液中,二甲基硅油和FC-40殘留均能成功擴(kuò)增DNA和RNA,與陰性對(duì)照ddH2O比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其他6種洗滌液殘留對(duì)PCR和RT-PCR均有不同程度的抑制作用,尤其是低拷貝數(shù)的DNA和RNA的擴(kuò)增受到顯著抑制。見表2。

    表2 8種洗滌液殘留對(duì)核酸擴(kuò)增檢測的影響

    2.3 二甲基硅油和FC-40配合不同狀態(tài)試劑使用時(shí)對(duì)核酸提取性能的影響

    以二甲基硅油和FC-40作為洗滌液,無論是配合干式試劑還是濕式試劑,提取103拷貝/μL DNA和RNA模板的Ct值與70%乙醇洗滌液比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

    表3 不同狀態(tài)試劑結(jié)合油類洗滌液的核酸提取性能

    2.4 不同混勻方式對(duì)二甲基硅油和FC-40洗滌液的適用性

    無論采用哪種混勻方式,以二甲基硅油、FC-40為洗滌液提取103拷貝/μL DNA和RNA模板的Ct值與70%乙醇比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

    表4 不同混勻方式對(duì)二甲基硅油和FC-40洗滌液的適用性

    2.5 二甲基硅油和FC-40洗滌液對(duì)病原體樣本核酸的提取性能

    以二甲基硅油和FC-40為洗滌液,提取Mp模擬臨床樣本DNA的Ct值分別為32.34±0.18和31.87±0.03,與以70%乙醇為洗滌液的Ct值(32.28±0.20)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以二甲基硅油和FC-40為洗滌液的磁珠法提取DNA的Ct值低于商品化核酸提取試劑盒B(Ct值為35.48±0.01)(P<0.05);與商品化核酸提取試劑盒A(Ct值為31.81±0.30)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    3 討論

    感染性疾病的病原體種類多種多樣,準(zhǔn)確、快速的病原體的精準(zhǔn)檢測已成為疾病診療和防控的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的病原體培養(yǎng)法周期長,抗體法易受既往感染史影響,而核酸法可規(guī)避上述弊端,能從復(fù)雜的生物樣本中快速、準(zhǔn)確地檢測出特定病原體的基因組DNA或RNA,敏感性高,特異性好[4]。傳統(tǒng)的核酸檢測方法是實(shí)時(shí)熒光PCR,操作繁瑣,極易造成交叉污染,導(dǎo)致假陽性結(jié)果。分子微流控以微管道網(wǎng)絡(luò)為結(jié)構(gòu)特征,可制備成全封閉的、自動(dòng)化的設(shè)備,整合了核酸提取和擴(kuò)增檢測的全過程,可避免交叉污染,同時(shí)縮短了核酸檢測的時(shí)間,擴(kuò)大了核酸檢測的應(yīng)用范圍[5]。

    核酸檢測的性能很大程度上取決于核酸提取步驟。目前,主流的核酸提取方法——磁珠法具有簡便、快速、高通量、自動(dòng)化等優(yōu)勢[6],其使用的洗滌液為70%~80%的乙醇。由于乙醇易揮發(fā)、易燃,整合在微流控板卡中運(yùn)輸和儲(chǔ)存時(shí)存在一定的安全隱患;乙醇濃度降低還會(huì)導(dǎo)致核酸從磁珠上解吸附,造成核酸量的損失。此外,微流控產(chǎn)品具有體積小、重量輕、可常溫儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn),各反應(yīng)試劑需盡可能地制備成凍干品,以便常溫運(yùn)輸和儲(chǔ)存,但具有揮發(fā)性質(zhì)的乙醇既不能做成凍干品,也無法滿足上下游試劑凍干品在微流控組裝過程中的極干燥環(huán)境要求[3]。因此,乙醇無法用于微流控產(chǎn)品。近年來,研究者們采用基于水相-氣相-油相結(jié)構(gòu)的表面張力輔助的不混溶相過濾(immisciblefiltration assisted by surface tension,IFAST)體系來構(gòu)建微流控核酸提取和檢測系統(tǒng),洗滌液通常選用油類化合物[7]。HU等[8-9]構(gòu)建了IFAST體系,從全血和血漿樣本中迅速分離游離DNA(cell-free DNA,cfDNA),整個(gè)提取過程不超過15 min,后續(xù)又構(gòu)建了基于IFAST和LAMP的一體化核酸芯片,可在60 min內(nèi)完成cfDNA的提取和檢測,證實(shí)了油性洗滌液在微流控平臺(tái)上的潛在應(yīng)用價(jià)值。

    本研究對(duì)5種長鏈醇類和3種油類洗滌液在微流控平臺(tái)上的應(yīng)用進(jìn)行了分析,并針對(duì)病原體的基因組分DNA和RNA兩大類的特點(diǎn),探討了DNA、RNA共提取的方法,以便在微流控平臺(tái)上開展多種病原體的聯(lián)合檢測,結(jié)果顯示,8種洗滌液中,二甲基硅油和FC-40對(duì)DNA和RNA的提取性能與70%乙醇相比差異較小,在DNA和RNA模板量為102~105拷貝/μL時(shí)均能檢出,而其他6種洗滌液的提取效率相對(duì)較低,尤其是對(duì)于低濃度核酸模板而言,效率更低??紤]到微流控技術(shù)平臺(tái)無法模擬手工移液器的吸棄操作,難以實(shí)現(xiàn)洗滌液的完全去除,本研究特別檢測了各種油性洗滌液殘留對(duì)后續(xù)擴(kuò)增的影響,其中二甲基硅油和FC-40對(duì)PCR和RT-PCR均無抑制作用,而其他6種洗滌液對(duì)下游擴(kuò)增反應(yīng)均有程度不同的抑制。由此可見,二甲基硅油和FC-40可取代70%乙醇,作為核酸提取的洗滌液。

    針對(duì)微流控的特點(diǎn),本研究將吸附液、洗脫液制成干式試劑,復(fù)溶后結(jié)合二甲基硅油和FC-40洗滌液,其核酸提取性能與濕式試劑無差異,說明油類洗滌液配合干式試劑適用于微流控平臺(tái)。另外,油類洗滌液黏度較高,為探索適合微流控平臺(tái)的洗滌混勻方式,本研究對(duì)渦旋混勻、移液槍混勻、顛倒混勻3種不同的混勻方式進(jìn)行了探討,結(jié)果顯示,無論采用哪種混勻方式,以二甲基硅油、FC-40為洗滌液提取103拷貝/μLDNA和RNA模板的Ct值與70%乙醇比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明以二甲基硅油、FC-40為洗滌液時(shí),不同的混勻方式對(duì)核酸提取無影響。

    本研究結(jié)果還顯示,以二甲基硅油和FC-40為洗滌液,提取Mp模擬臨床樣本DNA后的Ct值與以70%乙醇為洗滌液時(shí)的Ct值比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);且與商品化核酸提取試劑盒A的DNA提取性能基本一致(P>0.05),提示油類洗滌液可用于臨床樣本的核酸提取。

    綜上所述,以二甲基硅油和FC-40為洗滌液,采用磁珠法對(duì)DNA和RNA進(jìn)行共提取的效率與傳統(tǒng)70%乙醇洗滌液等效,且具有不易揮發(fā)、安全的優(yōu)點(diǎn),適用于微流控產(chǎn)品的開發(fā)和臨床應(yīng)用。

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