慢性腦缺血模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙與腦白質(zhì)神經(jīng)纖維、周細(xì)胞變化相關(guān)性分析

黃 佳，王夢雪，倪靜蕾，梁勝祥，林冰冰

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122；

2 福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)產(chǎn)業(yè)研究院，福建 福州 350122

血管性認(rèn)知障礙（vascular cognitive impairment，VCI）是腦血管病變及其危險(xiǎn)因素導(dǎo)致的血管性腦損傷［1］，是除了阿爾茨海默病外最常見的癡呆癥亞型［2］。VCI患者常伴有記憶功能下降，這將影響患者日常生活活動能力［3］。在血管性疾病發(fā)生時(shí)，如何及時(shí)預(yù)測或診斷認(rèn)知障礙的發(fā)生是臨床亟需解決的問題。研究顯示，髓鞘丟失和血管周圍間隙擴(kuò)張等病理變化可在一定程度上預(yù)測血管性認(rèn)知障礙［4］，但新的預(yù)測靶標(biāo)及其作用機(jī)制仍然是目前研究的熱點(diǎn)。

研究顯示，持續(xù)腦血流的慢性下降是VCI發(fā)展的主要機(jī)制［5］，腦血流灌注減少與癡呆癥的嚴(yán)重程度密切相關(guān)［6］。多項(xiàng)臨床研究顯示，慢性腦缺血導(dǎo)致彌漫性白質(zhì)纖維的改變與認(rèn)知障礙密切相關(guān)［7-8］，但其分子機(jī)制尚未完全明確。雙側(cè)頸總動脈阻斷建立的慢性腦缺血模型已被廣泛用于研究VCI［9-13］。本研究采用慢性腦缺血模型模擬血管性認(rèn)知障礙損害，通過彌散張量成像（diffusion tensor imaging，DTI）觀察海馬腦區(qū)和胼胝體白質(zhì)神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)病理變化，分析學(xué)習(xí)記憶障礙中與白質(zhì)神經(jīng)纖維損害相關(guān)的髓鞘堿性蛋白和周細(xì)胞血小板衍生生長因子受體β（platelet-derived growth factor receptor beta，PDGFR-β）變化，旨在闡明慢性腦缺血所致認(rèn)知障礙與白質(zhì)神經(jīng)纖維損傷的相關(guān)性，探討VCI的預(yù)測分子靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選擇24只SPF級Sprague Dawley雄性大鼠，體質(zhì)量（280±30）g，實(shí)驗(yàn)動物購自上海斯萊克公司。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005。實(shí)驗(yàn)動物由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)［許可證號：SCXK（閩）2020-0002］，每籠≤5只，給予充足、自由飲食。所有實(shí)驗(yàn)程序均嚴(yán)格按照動物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)章進(jìn)行。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備

動物用青霉素鈉（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格：160萬單位）；異氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司，批號：R510-22）；戊巴比妥鈉（美國默克Sigma公司，批號：CQ6125000）；堅(jiān)牢藍(lán)（luxol fast blue，LFB）染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號：G3245）；Bicinchoninic acid蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）；1∶3 000兔抗髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）抗體（美國Proteintech公司，批號：10458-1-AP）；1∶600兔抗PDGFR-β抗體（英國Abcam公司，批號：ab32570）；1∶5 000山羊抗兔抗體（英國Abcam公司，批號：ab6721）；Morris水迷宮（上海欣軟信息科技有限公司，型號：XR-XM101）；小動物核磁共振成像儀（德國BRUKER公司，型號：MiniMR-60 MRI system 7.0 T）；小動物呼吸麻醉機(jī)（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；小動物生理檢測儀（美國型號：Smiths Medical公司，SurgiVet V3395TPR）；Western blot系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物模型制備

24只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、術(shù)后28 d組、術(shù)后56 d組，每組8只。參考FARKAS［14］雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎造模方法模擬VCI慢性腦缺血病理狀態(tài)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動物模型構(gòu)建。所有大鼠術(shù)前均禁食12 h，隨后對大鼠稱取體質(zhì)量，用2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）進(jìn)行腹腔注射麻醉，醫(yī)用膠帶固定大鼠四肢，使其在手術(shù)保溫墊上處于仰臥位，進(jìn)行頸部酒精消毒、剃毛備皮，沿大鼠頸正中線切開，分離淺表組織，分別從左、右兩邊的胸骨舌骨肌、胸鎖乳突肌和肩胛舌骨肌交叉點(diǎn)處向下找到兩側(cè)頸總動脈，分離頸總動脈與其旁邊伴行的迷走神經(jīng)。假手術(shù)組大鼠僅分離雙側(cè)頸總動脈，不進(jìn)行結(jié)扎。術(shù)后28 d組和術(shù)后56 d組大鼠在雙側(cè)頸總動脈充分暴露后，先用不可吸收的外科縫合線結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，5 min后再結(jié)扎右側(cè)頸總動脈，隨后縫皮、清潔創(chuàng)口。所有大鼠在縫皮后腹腔注射20萬單位/mL動物用青霉素鈉溶液（0.05 mL/100 g）。

1.4 觀察指標(biāo)

分別在造模成功后第28、56天進(jìn)行以下指標(biāo)評價(jià)。

1.4.1學(xué)習(xí)記憶能力 采用Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)評估3組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。在Morris水迷宮（直徑150 cm×高50 cm）中，充滿適宜溫度（25±3）℃ 的水，水迷宮分為4個象限，在第3象限放入平臺（直徑10 cm×高30 cm），高出水平面5 cm；大鼠頭部朝向池壁，從4個不同的象限中點(diǎn)放入水中，讓大鼠在水中自由游動，大鼠自行登上平臺或?qū)嶒?yàn)者引導(dǎo)大鼠至平臺后，讓大鼠在平臺上停留30 s，共訓(xùn)練4 d。實(shí)驗(yàn)第5天進(jìn)行空間探索測驗(yàn)，移走平臺，大鼠在90 s內(nèi)尋找原平臺置放的目標(biāo)區(qū)域，記錄大鼠進(jìn)入目標(biāo)區(qū)域（第3象限）的次數(shù)、在目標(biāo)區(qū)域（第3象限）停留時(shí)間以及逃避潛伏期、路徑、平均速度。將攝像機(jī)與Super Maze動物行為學(xué)視頻采集分析系統(tǒng)連接，攝像機(jī)安裝在水迷宮上方監(jiān)測大鼠游泳動態(tài)。實(shí)驗(yàn)后將大鼠用吸水紙吸干體表的水分，必要時(shí)采用白熾燈烘干后，放回籠中。

1.4.2大鼠胼胝體和海馬腦區(qū)的白質(zhì)神經(jīng)纖維的變化 采用DTI檢測3組大鼠胼胝體和海馬腦區(qū)的白質(zhì)神經(jīng)纖維的變化情況。3組大鼠用3%異氟烷在氧氣和空氣混合氣體（1∶4）中誘導(dǎo)麻醉，并用100 μg/mL的鹽酸美托嘧啶（0.15 mL/300 g）經(jīng)下肢肌內(nèi)注射以誘導(dǎo)大鼠深度麻醉。掃描時(shí)，大鼠置于核磁共振掃描床上呈俯臥位，頭部置于大鼠專用頭部表面線圈（掃描架內(nèi)徑16 cm，使用內(nèi)徑38 mm）內(nèi)，以牙鉤和雙側(cè)耳桿固定其頭部，掃描過程中維持2%異氟烷氣體麻醉，水循環(huán)加熱系統(tǒng)維持大鼠體溫相對恒定。整個過程中通過小動物生理檢測儀實(shí)時(shí)監(jiān)測大鼠體溫、呼吸頻率、心率。DTI掃描參數(shù)如下：回波時(shí)間（time of echo，TE）＝32.25 ms，重復(fù)時(shí)間（time of repetition，TR）＝12 000 ms，視野（field of view，F(xiàn)OV）＝32 mm×32 mm，分割（segment）＝4，平均次數(shù)（averages）＝1，圖像大小（image size）＝128×128，層數(shù)（slices）＝48，彌散敏感系數(shù)b＝1 000 s/mm2，層厚（slice thickness）＝0.56 mm，無層間隙（no slice gap），時(shí)間（time）＝28 min。

采用FMRIB's Software Library（http：//fmrib.ox.ac.uk/fsl）和ITK-SNAP軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。首先，進(jìn)行渦流校正、顱骨剝離，得到全腦掩膜圖像；然后，計(jì)算大鼠全腦各向異性分?jǐn)?shù)（fractional anisotropy，F(xiàn)A）和平均彌散率（mean diffusivity，MD）參數(shù)圖，手動確定胼胝體和海馬腦區(qū)感興趣區(qū)，提取感興趣區(qū)FA和MD平均值。

1.4.3大鼠胼胝體白質(zhì)髓鞘脫失情況 采用堅(jiān)牢藍(lán)（luxol fast blue，LFB）染色法檢測大鼠胼胝體白質(zhì)髓鞘脫失情況。用2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，0.9% NaCl溶液和4%多聚甲醛經(jīng)心內(nèi)灌注，腦組織行石蠟包埋，冠狀位切片，切片厚度為5 μm；經(jīng)脫蠟脫水后，加入0.1% LFB溶液，于室溫密封浸染24 h；腦片經(jīng)蒸餾水清洗后，由95%乙醇、0.05%碳酸鋰水溶液、70%乙醇分色，直至顯微鏡下觀察灰質(zhì)和白質(zhì)部位區(qū)分清晰，背景無色為止；中性樹膠封片。每組隨機(jī)選擇3只大鼠，在正置顯微鏡下觀察并拍照，每只大鼠取2張腦片，通過LFB染色法評價(jià)大鼠胼胝體白質(zhì)髓鞘脫失情況。評分標(biāo)準(zhǔn)如下，① 0級：正常；② 1級：神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)紊亂；③ 2級：明顯空泡形成；④ 3級：有髓神經(jīng)纖維消失。

1.4.4大鼠胼胝體和海馬腦區(qū)的髓鞘堿性蛋白MBP和周細(xì)胞標(biāo)志物PDGFR-β蛋白表達(dá) 采用免疫印跡法檢測大鼠胼胝體和海馬腦區(qū)的髓鞘堿性蛋白MBP和周細(xì)胞標(biāo)志物PDGFR-β蛋白表達(dá)。用2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，0.9% NaCl溶液經(jīng)心內(nèi)灌注，閘刀斬?cái)啻笫箢i椎，在冰面上鈍性剝離腦組織，分別剝離胼胝體和海馬腦區(qū)，并迅速放入液氮中冷凍，用組織剪將其剪碎放入勻漿機(jī)，加入等同于組織體積10倍的裂解液，充分裂解后離心30 min，取上清液，Bicinchoninic acid定量調(diào)齊濃度（5 μg/μL）并高溫變性（95～100 ℃，5 min）。配制分離膠，經(jīng)上樣、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、聚偏二氟乙烯膜濕轉(zhuǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜后，Tris鹽酸緩沖鹽溶液加吐溫漂洗5 min，用5%脫脂乳在室溫下封閉膜1 h，在4 ℃的環(huán)境下分別加入相應(yīng)的一抗孵化過夜。Tris鹽緩沖液洗膜4次（5 min/次），37 ℃環(huán)境下用二抗避光孵育1 h。最后用紅外成像系統(tǒng)對曝光后的膠片掃描存檔，利用Image J軟件對目標(biāo)帶灰度值進(jìn)行定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布者，數(shù)據(jù)以（xˉ±s）表示，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測量方差分析；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時(shí)采用LSD-t法，方差不齊時(shí)采用Tamhane'sT2法；采用Pearson相關(guān)性分析MD與穿越平臺次數(shù)的相關(guān)性。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

DTI數(shù)據(jù)分析步驟如下：① 使用MRIcroN軟件將DICOM格式的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為NIFTI格式；② 對DTI圖像進(jìn)行渦流校正處理；③ 提取顱內(nèi)掩模圖像，計(jì)算b0像和全腦FA像；④ 基于一般線性模型，采用單因素方差分析，對平滑后數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.005，團(tuán)簇＞10為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組學(xué)習(xí)記憶能力比較

Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，術(shù)后28 d組第2～4天逃避潛伏期均明顯延長，術(shù)后56 d組第3天逃避潛伏期明顯延長，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，術(shù)后28 d組和術(shù)后56 d組大鼠穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限時(shí)間占比均明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1～2及圖1。

圖1 3組大鼠水迷宮測試期游行軌跡圖Figure 1 The trajectories of rats during probe test in the Morris water maze

表1 3組逃避潛伏期比較（xˉ±s） sTable 1 Comparison of escape latency in three groups （xˉ±s） s

表2 3組穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限時(shí)間占比和速度比較（xˉ±s）Table 2 Comparison of crossing platforms times，target quadrant time ratio and speed in three groups （xˉ±s）

2.2 3組胼胝體和海馬腦區(qū)白質(zhì)神經(jīng)纖維變化比較

與假手術(shù)組比較，術(shù)后28 d組、術(shù)后56 d組左、右側(cè)胼胝體和左、右側(cè)海馬腦區(qū)白質(zhì)神經(jīng)纖維變化的MD值均明顯降低（P＜0.05）。與術(shù)后28 d組比較，術(shù)后56 d組MD值有下降趨勢，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 3組胼胝體和海馬FA、MD值比較（xˉ±s）Table 3 Comparison of FA，MD values of the callous corpus and hippocampus in three groups （xˉ±s）

2.3 3組胼胝體和海馬腦區(qū)MD值與學(xué)習(xí)記憶能力的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，3組雙側(cè)胼胝體、海馬腦區(qū)MD值與穿越平臺次數(shù)均呈正相關(guān)關(guān)系，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r＝0.832，P＜0.01；r＝0.777，P＜0.01）。見圖2。

圖2 3組胼胝體、海馬腦區(qū)MD值與穿越平臺次數(shù)相關(guān)性分析Figure 2 Correlation analysis between MD values of the callous corpus and hippocampus and the number of crossing platforms in three groups

2.4 3組胼胝體髓鞘改變比較

研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，術(shù)后28 d組、術(shù)后56 d組大鼠胼胝體部位著色程度均較淺，髓鞘結(jié)構(gòu)紊亂明顯，甚至出現(xiàn)空洞。見圖3。通過對髓鞘紊亂分級進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，術(shù)后28 d組和術(shù)后56 d組髓鞘紊亂分級均明顯升高（P＜0.05）；與術(shù)后28 d組比較，術(shù)后56 d組大鼠髓鞘紊亂分級差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

圖3 3組大鼠胼胝體LFB染色圖（×100）Figure 3 LFB staining figure of the callous corpus of rats in three groups (×100)

圖4 髓鞘紊亂分級值統(tǒng)計(jì)圖Figure 4 Statistical plot of graded values of myelin sheath disorders

2.5 3組胼胝體和海馬腦區(qū)MBP和PDGFR-β蛋白表達(dá)含量變化比較

研究結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，術(shù)后28 d組、術(shù)后56 d組大鼠胼胝體、海馬腦區(qū)的髓鞘堿性蛋白MBP蛋白表達(dá)水平均明顯下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后28 d組胼胝體PDGFR-β表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），術(shù)后28 d組、術(shù)后56 d組海馬腦區(qū)PDGFR-β表達(dá)水平均明顯下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與術(shù)后28 d組比較，術(shù)后56 d組胼胝體PDGFR-β表達(dá)水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5、表4。

表4 3組胼胝體和海馬腦區(qū)MBP、PDGFR-β蛋白表達(dá)比較（xˉ±s）Table 4 Comparison of MBP，PDGFR-β proteins expression of the callous corpus and hippocampus in three groups （xˉ±s）

圖5 胼胝體和海馬腦區(qū)MBP、PDGFR-β蛋白條帶圖Figure 5 Bands of MBP, PDGFR-β proteins in the corpus callosum and hippocampus

3 討 論

3.1 慢性腦缺血模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙與胼胝體、海馬腦區(qū)白質(zhì)神經(jīng)纖維及微結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)

慢性腦缺血所致VCI會出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能下降和日常生活活動能力減退等癥狀［12-13］。本研究Morris水迷宮結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，術(shù)后28 d組、術(shù)后56 d組大鼠逃避潛伏期均明顯延長，穿越平臺次數(shù)和目標(biāo)象限時(shí)間占比均明顯減少，提示慢性腦缺血模型大鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能障礙。這與FANG等［9-11，14］研究結(jié)果一致。

白質(zhì)纖維完整性的喪失是慢性腦缺血所致腦損傷的突出病理特征［15-16］。既往研究發(fā)現(xiàn)，DTI參數(shù)變化（FA、MD）是能夠反映白質(zhì)神經(jīng)纖維的影像學(xué)指標(biāo)，輕度認(rèn)知障礙患者胼胝體、穹隆等腦區(qū)FA、MD發(fā)生明顯變化［17-18］，胼胝體作為溝通兩側(cè)半球的重要信息通道，其功能降低會直接影響雙側(cè)海馬腦區(qū)的信息交流［19-20］。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，術(shù)后28 d組、術(shù)后56 d組大鼠胼胝體、海馬腦區(qū)MD值均明顯下降；雙側(cè)胼胝體和雙側(cè)海馬腦區(qū)MD值均與穿越平臺次數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系。這提示慢性腦缺血模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙與胼胝體、海馬腦區(qū)白質(zhì)神經(jīng)纖維破壞有關(guān)。此外，本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，術(shù)后28 d組、術(shù)后56 d組大鼠胼胝體、海馬腦區(qū)FA值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能是由于體素中交叉纖維的存在導(dǎo)致各向異性降低，限制了FA檢測白質(zhì)神經(jīng)纖維損傷的能力。這與既往研究發(fā)現(xiàn)海馬腦區(qū)和胼胝體內(nèi)的微結(jié)構(gòu)改變可以預(yù)測認(rèn)知功能的恢復(fù)情況，MD是相對于FA更可靠的檢測微結(jié)構(gòu)變化參數(shù)的觀點(diǎn)相似［21］。

本研究采用LFB染色法和免疫印跡法驗(yàn)證慢性腦缺血對白質(zhì)神經(jīng)纖維微結(jié)構(gòu)損傷的影響。研究結(jié)果顯示，慢性腦缺血會導(dǎo)致胼胝體白質(zhì)神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)紊亂，髓鞘排列疏松，隨著時(shí)間進(jìn)展，出現(xiàn)白質(zhì)神經(jīng)纖維松解和空泡，胼胝體和海馬腦區(qū)中髓鞘堿性蛋白的減少。這提示慢性腦缺血導(dǎo)致白質(zhì)纖維完整性發(fā)生改變與學(xué)習(xí)記憶功能下降密切相關(guān)。這與既往研究結(jié)果一致［12］。

3.2 PDGFR-β可能是反映慢性腦缺血模型大鼠胼胝體和海馬腦區(qū)白質(zhì)神經(jīng)纖維破壞的關(guān)鍵分子

本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，術(shù)后28 d組胼胝體PDGFR-β明顯升高，術(shù)后28 d組、術(shù)后56 d組海馬腦區(qū)PDGFR-β均明顯降低；與術(shù)后28 d組比較，術(shù)后56 d組胼胝體PDGFR-β明顯降低，海馬腦區(qū)PDGFR-β雖有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示PDGFR-β可能是反映慢性腦缺血模型大鼠胼胝體和海馬腦區(qū)白質(zhì)神經(jīng)纖維破壞的關(guān)鍵分子。這可能與以下因素有關(guān)：① 當(dāng)出現(xiàn)慢性腦缺血時(shí)，胼胝體會出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，術(shù)后28 d組胼胝體PDGFR-β應(yīng)激性增加。這與既往研究發(fā)現(xiàn)“PDGFR-β在腦缺血應(yīng)激性增加”的結(jié)果一致［22］。② PDGFRβ蛋白是周細(xì)胞重要的標(biāo)志物，周細(xì)胞體數(shù)量和PDGFR-β反應(yīng)性存在強(qiáng)相關(guān)性［23］。周細(xì)胞作為血腦屏障和中樞神經(jīng)系統(tǒng)毛細(xì)血管的重要組成部分，在調(diào)節(jié)腦血流低灌注和白質(zhì)微結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)中起著重要作用［24-25］。

4 小 結(jié)

慢性腦缺血會導(dǎo)致胼胝體和海馬腦區(qū)白質(zhì)神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)損傷，其中胼胝體PDGFR-β變化可能是預(yù)測慢性腦缺血所致認(rèn)知障礙的關(guān)鍵靶標(biāo)，這將有助于闡明VCI病情進(jìn)展的相關(guān)神經(jīng)機(jī)制。但本研究仍存在一些局限性：① 實(shí)驗(yàn)對象僅涉及慢性腦缺血大鼠，嚙齒類動物雙側(cè)頸總結(jié)扎模型與人類VCI仍有一定差距；② 僅觀察了雙側(cè)頸總結(jié)扎大鼠造模成功后28、56 d的部分病理變化。下一步研究仍需延長觀察時(shí)間，以探討慢性腦缺血后胼胝體和海馬腦區(qū)白質(zhì)神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)損傷的連續(xù)性變化情況，為VCI治療最佳時(shí)機(jī)選擇相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。