苦豆子總堿對大鼠慢性酒精性肝損傷的保護作用研究

張 東 董佳妮 謝華祎 康松松 鄔國棟*

1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040

1965年，Lieber和他的同事的開創(chuàng)性工作證實了酒精的肝毒性作用[1]。在大多數(shù)工業(yè)化國家中，酒精是繼丙型肝炎之后最常見的慢性肝病病因[2]。酒精性肝病包括一系列疾病，如單純性脂肪變性、脂肪性肝炎、肝硬化和晚期肝細胞癌等[3]。酒精性肝病的預(yù)防及治療是迫切需要解決的問題。

苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)系豆科(Leguminosae)槐屬植物，藥用部位可以是全草，也可以是根及種子，是一種常用的中蒙藥材，主要成分有生物堿、黃酮和揮發(fā)油等，其中生物堿是其重要活性成分，本文稱為苦豆子總堿(total alkaloids of sophora alopecuroides，TASA)[4]。在我國，主要分布于內(nèi)蒙古、寧夏、新疆、甘肅、青海、西藏等地區(qū)，分布范圍較廣[5]。TASA具有抗炎、抗癌、抗菌和免疫調(diào)節(jié)等作用[6-8]。黃華等[9]研究發(fā)現(xiàn)苦豆子總堿對化學(xué)性肝損傷模型(如四氯化碳和D半乳糖氨所引起的)和免疫性肝損傷模型(卡介苗加脂多糖引起)具有保護作用，可使ALT和AST水平下降。本實驗擬應(yīng)用56%乙醇制備大鼠慢性酒精性肝損傷模型，從不同角度探討TASA對大鼠慢性酒精性肝損傷是否具有保護作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 Wistar雄性大鼠，體重200～220 g，從斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司購買，合格證號：SCXK(京)2016-0002。

1.1.2 藥品與試劑 苦豆子總堿(西安立森生物科技有限公司，含量為80%，批號20191107)；聯(lián)苯雙酯(萬邦德制藥集團股份有限公司，生產(chǎn)批號：A02J181109)；紅星二鍋頭(56°)(北京紅星股份有限公司，生產(chǎn)批號：0955101120180219)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT，生產(chǎn)批號：20191106)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST，生產(chǎn)批號：20191105)試劑盒、丙二醛(MDA，生產(chǎn)批號：20191108)試劑盒、超氧化物酶(SOD，生產(chǎn)批號：20191013)均購自南京建成生物工程研究所。白細胞介素6測定試劑盒(IL-6，生產(chǎn)批號：20191012),腫瘤壞死因子α測定試劑盒(TNF-α，生產(chǎn)批號：20191012)，購自中生北控生物科技股份有限公司。轉(zhuǎn)化生長因子β1試劑盒(TGF-β1，生產(chǎn)批號：E-30634)，購自北京奧維亞生物技術(shù)有限公司。γ干擾素試劑盒(IFN-γ，批號：20190803)，購自北京華英生物技術(shù)研究所。

1.1.3 主要儀器 AU640全自動生化分析儀( 日本奧林巴斯公司)，MultiSkan3酶標儀(賽默飛世爾科技有限責(zé)任公司)，Sartorius BSA224S-CW電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，TDZ5—WS多管架自動平衡離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)。

1.2 給藥方案與模型制備 48只大鼠隨機分為6組，分別是空白組，模型組，聯(lián)苯雙酯組2.4 mg·kg-1，苦豆子總堿14 mg·kg-1、28 mg·kg-1和56 mg·kg-1組，每組8只?？瞻捉M和模型組給予蒸餾水，其它組給予相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)8周。給藥1 h后，除空白組給蒸餾水外，其余各組均用 56° 的二鍋頭白酒灌胃，第1周8 mL·kg-1， 以后每周增加 1 mL，直至15 mL·kg-1，連續(xù)灌胃8周。

1.3 觀察指標

1.3.1 血清中相關(guān)生化指標測定 末次給酒和藥物后禁食不禁水12 h，脫臼處死，腹主動脈取血，分離血清， 根據(jù)試劑盒說明書測定ALT、AST、MDA和SOD。

1.3.2 肝臟指數(shù)的測定 摘取肝臟，用電子天平秤肝濕重，計算肝臟指數(shù)[肝臟指數(shù)(%)=肝臟質(zhì)量(g)/體重(g)×100%]。

1.3.3 IL-6、TNF-α、IFN-γ和TGF-β1含量檢測 采用 ELISA法檢測大鼠血清 TNF-α，IL-6、IFN-γ和TGF-β1含量。嚴格按試劑盒說明書步驟操作。

1.3.4 組織病理學(xué)檢查 每只鼠都摘取肝右葉，用4% 的甲醛固定，制備石蠟切片，HE 染色，進行病理組織學(xué)檢查。

2 結(jié)果

2.1 TASA對大鼠肝臟指數(shù)的影響 與空白組相比，模型組大鼠肝臟指數(shù)顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，TASA各組大鼠肝臟指數(shù)顯著減小(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見表1。

表1 TASA對慢性酒精性肝損傷大鼠肝臟指數(shù)的影響

2.2 TASA對慢性酒精性肝損傷大鼠肝功指標的影響 與空白組相比，模型組大鼠ALT和AST顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，TASA大、中劑量組ALT和AST顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 TASA對慢性酒精性肝損傷大鼠肝功指標的影響

2.3 TASA對慢性酒精性肝損傷大鼠血清MDA含量和SOD活性的影響 與空白組相比，模型組大鼠MDA含量顯著升高(P<0.01)，SOD活性顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，TASA大、中劑量組MDA含量顯著降低(P<0.01)，SOD活性顯著升高(P<0.01)。見表3。

表3 TASA對慢性酒精性肝損傷大鼠MDA含量和SOD活性的影響

2.4 TASA對慢性酒精性肝損傷大鼠細胞因子的影響 與空白組相比，模型組IL-6、TNF-α、IFN-γ和TGF-β顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，TASA給藥組可以顯著的降低IL-6、IFN-γ和TGF-β1的含量(P<0.05或P<0.01)，TNF-α有降低的趨勢。見表4。

表4 TASA對慢性酒精性肝損傷大鼠細胞因子的影響

2.5 TASA對慢性酒精性肝損傷大鼠肝組織病理學(xué)形態(tài)的影響 正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細胞排列整齊、有序，無細胞腫脹、脂肪變性、炎癥細胞浸潤等現(xiàn)象。酒精模型組肝細胞排列疏松，各結(jié)構(gòu)層次模糊不清，炎癥細胞浸潤，細胞中著色深淺不一。與酒精模型組相比，聯(lián)苯雙酯組，TASA高、中、低劑量組肝組織病理學(xué)形態(tài)有較大改善，肝細胞排列較為整齊，炎癥細胞浸潤等現(xiàn)象減輕。

3 討論

臨床上判斷肝功能是否受損及受損的程度通常以ALT及AST水平的變化作為主要指標，而酒精性肝損傷患者的肝功能水平也會發(fā)生變化，ALT及AST水平會升高[10]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠ALT和AST顯著升高，肝臟指數(shù)顯著增加，給予TASA組大鼠ALT、AST和肝臟指數(shù)顯著降低，說明TASA對慢性酒精性肝損傷具有保護作用。從病理學(xué)組織切片能看出模型組肝細胞排列疏松，各結(jié)構(gòu)層次模糊不清，炎癥細胞浸潤，細胞中著色深淺不一。與模型組相比，TASA各劑量組肝組織病理學(xué)形態(tài)有較大改善，肝細胞排列較為整齊，炎癥細胞浸潤等現(xiàn)象減輕。這也說明TASA對慢性酒精性肝損傷具有保護作用。

關(guān)于酒精性肝損傷的發(fā)病機理比較多，其中氧化應(yīng)激是導(dǎo)致酒精性肝損傷非常重要的發(fā)病機制之一，體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可以通過酒精來激活，從而使肝組織遭到破壞[11]。氧化應(yīng)激導(dǎo)致的肝損傷最終會產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物——MDA，所以可以用MDA反映組織過氧化損傷的程度，同時MDA還可以造成細胞代謝和功能障礙；酒精和它的代謝產(chǎn)物乙醛都可以引起肝細胞膜脂質(zhì)過氧化，進而產(chǎn)生MDA[12]。SOD是體內(nèi)的抗氧化酶，可以清除細胞內(nèi)自由基，降低 MDA 的產(chǎn)生，保護細胞免受氧化損傷，其活力可間接反映機體清除氧自由基的能力，SOD水平的高低是衡量機體抗氧化能力大小非常重要的一個指標[13]。由本實驗研究結(jié)果可知，TASA可以顯著降低慢性酒精性性肝損傷大鼠血清中MDA含量，顯著升高SOD活性，說明TASA可以降低慢性酒精性肝損傷的氧化應(yīng)激作用，降低酒精對肝細胞的損傷，這可能是TASA發(fā)揮肝臟保護作用的原因之一。

TNF-α具有雙重作用，在正常生理情況下，機體釋放適量 TNF-α參與自動防御，改善機體平衡狀態(tài)，起積極保護作用；但是在諸如肝功能異常、炎癥反應(yīng)和敗血癥等條件下，機體釋放大量 TNF-α，對機體產(chǎn)生細胞毒性作用[14]。TNF-α作為一種促進炎癥進展的因子，通常由肝臟活化的單核巨噬細胞產(chǎn)生，也是多種促炎因子及炎癥介質(zhì)異常釋放的關(guān)鍵因子，其主要清除部位位于肝臟[15]。有研究[16]表明，肝臟疾病患者血清TNF-α水平與肝損傷的生化指標具有正相關(guān)關(guān)系。本實驗結(jié)果也顯示肝損傷模型組TNF-α水平顯著升高。TNF-α除了可直接作用肝細胞而產(chǎn)生毒性，造成肝損傷、壞死，還可誘生IFN-γ及IL-6等炎癥因子[17]。這些因子又增強了TNF-α的作用,高水平的IL-6與TNF-α協(xié)同作用, 加重肝損傷[18]。所以血清中TNF-α和IL-6含量變化可敏感地反映出肝組織損傷的程度[19]。IFN-γ被認為是一把雙刃劍，因為它對病毒防御至關(guān)重要，但也可能導(dǎo)致肝臟損傷[20]。IFN-γ作為一種炎性細胞因子，可引起肝細胞的細胞周期阻滯和細胞凋亡[21]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠 TNF-α、IL-6和 IFN-γ較正常組大鼠顯著升高，表明TNF-α 、IL-6和 IFN-γ參與了慢性酒精性肝損傷過程，通過TASA干預(yù)后，IL-6和 IFN-γ均顯著降低，TNF-α水平有降低趨勢，提示TASA能減輕慢性酒精型性肝損傷的炎癥反應(yīng)，這也可能是TASA發(fā)揮對肝損傷保護作用機制之一。

TGFβ1 在復(fù)雜的纖維化過程扮演著非常重要的角色[22]。TGFβ1是一種多效性的細胞因子參與免疫反應(yīng)和肝纖維化的發(fā)展，導(dǎo)致肝星狀細胞的激活和增生，進一步激活肝星狀細胞分泌TGFβ1，增加膠原蛋白產(chǎn)生和促進肝纖維化進展，進而加重肝損傷[23]。由本實驗結(jié)果可知，模型組大鼠TGFβ1顯著升高，經(jīng)過TASA干預(yù)后，TGFβ1顯著下降，提示TASA可能通過降低TGFβ1水平，促進肝細胞再生，阻止纖維化進程，達到修復(fù)肝損傷的目的。

綜上所述，TASA對酒精引起的慢性肝損傷具有很好的保護作用，這種保護作用的發(fā)揮可能與TASA抗氧化應(yīng)激和抗炎作用以及促進肝細胞再生作用、阻止纖維化進程有關(guān)。