有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)睡眠剝奪大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬神經(jīng)元突觸可塑性的效果

李童，方志鵬，邵玉萍，王平

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢市 430065；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)體育健康學(xué)院，湖北武漢市 430065；3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)老年醫(yī)學(xué)研究所，湖北武漢市430065

0 引言

睡眠剝奪指人為干預(yù)睡眠-覺(jué)醒周期，通過(guò)減少睡眠時(shí)長(zhǎng)或改變睡眠時(shí)相，使機(jī)體處于亞健康或病理狀態(tài)，引起身心和行為異常。42.92%大學(xué)生每晚睡眠總時(shí)長(zhǎng)<6 h[1]。長(zhǎng)期處于睡眠剝奪不僅影響工作效率和生活質(zhì)量，還會(huì)導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能損傷[2]。

學(xué)習(xí)記憶的形成與鞏固離不開(kāi)神經(jīng)元及神經(jīng)元間的突觸連接。睡眠期間，機(jī)體能夠選擇性增強(qiáng)正在編碼記憶的突觸活動(dòng)，使記憶表征逐漸加強(qiáng)并鞏固存儲(chǔ)，形成長(zhǎng)期記憶[3]。睡眠剝奪減弱突觸活動(dòng)，影響海馬區(qū)神經(jīng)元激活，導(dǎo)致記憶損傷[4]。

突觸活動(dòng)受突觸結(jié)構(gòu)和突觸調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白調(diào)控。環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cyclic adenosine phos‐phate reactive element binding protein,CREB)/腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)信號(hào)通路是調(diào)節(jié)突觸活動(dòng)的重要通路[5]。磷酸化CREB(p-CREB)進(jìn)入神經(jīng)元細(xì)胞核，促進(jìn)BDNF 表達(dá)，上調(diào)突觸后致密蛋白95 (postsynaptic density protein 95,PSD95)、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43 (growth-associated protein 43,GAP43)、突觸素1 (synapsin I,SYN1)和小GTP 酶Rac1 等蛋白表達(dá)，促進(jìn)樹(shù)突棘發(fā)育，增強(qiáng)突觸活動(dòng)，減緩學(xué)習(xí)記憶損傷[6-11]。有氧運(yùn)動(dòng)在調(diào)節(jié)突觸活動(dòng)、緩解學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能損傷方面有良好效果，能激活CREB/BDNF 信號(hào)通路，上調(diào)PSD95、GAP43、SYN1 和Rac1 等相關(guān)蛋白表達(dá)，增強(qiáng)突觸活動(dòng)，緩解學(xué)習(xí)記憶受損。

睡眠剝奪損傷樹(shù)突棘發(fā)育，抑制突觸活動(dòng)，與有氧運(yùn)動(dòng)的作用機(jī)制相似。本研究觀察有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)睡眠剝奪大鼠學(xué)習(xí)記憶表現(xiàn)的效果，并從CREB/BDNF 信號(hào)通路角度來(lái)探討可能性的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性Sprague-Dawley大鼠48只，SPF 級(jí)，8周齡，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)買于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)SCXK(遼)2020-0001，飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)動(dòng)物房，恒溫恒濕，12 h 光照/12 h黑暗周期交替，自由進(jìn)食與飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，電腦生成隨機(jī)數(shù)，分為對(duì)照組、模型組、模型運(yùn)動(dòng)組和運(yùn)動(dòng)組，每組12只。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)倫理審查，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格遵循《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。

1.2 主要儀器及試劑

ZH-PT 型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)、ZH0065 Morris 水迷宮：安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司。自制睡眠剝奪箱。RM2016 切片機(jī)：德國(guó)LEICA 公司。ECLIPSE E100正置光學(xué)顯微鏡：日本尼康公司。T8-1 磁力攪拌器：江蘇省金壇市中大儀器廠。WB D-9413C 凝膠成像分析系統(tǒng)：北京六一儀器廠。H8070 蘇木素-G1100 伊紅(HE)染色液：索萊寶公司。G1069 高爾基染色套裝：武漢賽維爾生物科技有限公司。20665-1-AP 兔多抗PSD95、20258-1-AP 兔多抗SYN1：武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。DF7766 兔多抗GAP43、AF4200 兔多抗Rac1、DF6387 兔多抗BDNF、AF6188 兔多抗CREB：AFFINITY BIOSCIENCES公司。AB-P-R001兔多抗GAPDH：杭州賢至生物科技有限公司。9198S兔單抗p-CREB：CST 公司。BA1054 HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗：武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

模型運(yùn)動(dòng)組和運(yùn)動(dòng)組采用六道動(dòng)物跑臺(tái)進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。跑臺(tái)坡度0°，速度15 m/min，15 min 一個(gè)小節(jié)，小節(jié)結(jié)束后休息5 min，共4 周[12]。第1、2 周每天訓(xùn)練2 小節(jié)，第3 周每天訓(xùn)練3 小節(jié)，第4 周每天訓(xùn)練4小節(jié)。正式訓(xùn)練開(kāi)始前，適應(yīng)性訓(xùn)練3 d，每天10 min。對(duì)照組和模型組置于運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)中相同時(shí)間，但不進(jìn)行訓(xùn)練。

有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，采用多平臺(tái)水環(huán)境法對(duì)模型組和模型運(yùn)動(dòng)組連續(xù)睡眠剝奪72 h[13]。設(shè)備為本實(shí)驗(yàn)室自制。每箱5 只大鼠，置于70×50×40 cm 水箱中，水箱內(nèi)置直徑6.5 cm、高9 cm、間隔16 cm 的連體金屬圓形平臺(tái)。箱內(nèi)注水，使水面低于平臺(tái)1 cm，大鼠可在平臺(tái)上活動(dòng)；當(dāng)其進(jìn)入快動(dòng)眼睡眠時(shí)相時(shí)，會(huì)因肌張力下降而落水驚醒。對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)組在平臺(tái)上放置金屬網(wǎng)板，讓其在箱內(nèi)自由活動(dòng)，不進(jìn)行睡眠剝奪。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)其進(jìn)行適應(yīng)性睡眠剝奪3 d，每天1 h。

1.4 Morris水迷宮

有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)束后第1 天開(kāi)始，進(jìn)行Morris 水迷宮訓(xùn)練7 d。Morris 水迷宮為直徑120 cm 的圓形水池，以及直徑10 cm、高18 cm 的站臺(tái)，設(shè)備正上方的攝像頭記錄并分析大鼠行為。分析系統(tǒng)自動(dòng)將圓形水池劃分為4個(gè)象限，站臺(tái)放在第四象限。

定位巡航實(shí)驗(yàn)中，將大鼠分別從4 個(gè)象限背對(duì)站臺(tái)放入水中，每次入水的位置固定；若大鼠90 s 內(nèi)找到平臺(tái)，讓其自行在站臺(tái)上停留10 s，記錄潛伏期；若未找到平臺(tái)，則引導(dǎo)其在站臺(tái)停留10 s，潛伏期記為90 s。記錄最后一天的潛伏期和游泳總距離。

定位巡航實(shí)驗(yàn)結(jié)束后2 h，撤去平臺(tái)，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠在90 s 內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)及大鼠在平臺(tái)所在象限停留時(shí)間和距離。

1.5 樣本采集

空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠以10%水合氯醛3 mg/kg 腹腔注射麻醉，冰上剝離全腦。取3 只于4%多聚甲醛中固定；3只于高爾基染液中固定，常溫保存；6只分離海馬各區(qū)，無(wú)菌凍存管中凍存。

1.5.1 HE染色

4%多聚甲醛固定腦組織梯度酒精脫水，浸蠟、包埋、修整。切片機(jī)切片，厚4 μm；二甲苯和酒精脫蠟，蘇木素染色，伊紅復(fù)染。酒精、二甲苯脫水，中性樹(shù)脂封片，經(jīng)典海馬處切片光學(xué)顯微鏡觀察。

1.5.2 高爾基染色

高爾基固定液固定的腦組織采用蒸餾水、80%冰醋酸、30%蔗糖處理。切片機(jī)切片，厚4 μm，過(guò)夜，避光，晾干。濃氨水、蒸餾水、酸性堅(jiān)膜定影液處理，甘油明膠封片。正置熒光顯微鏡200 倍視野下觀察，選取海馬區(qū)2 個(gè)結(jié)構(gòu)清晰的神經(jīng)元，以其從胞體伸出的樹(shù)突第一次分支進(jìn)行標(biāo)記，1 000 倍下觀察樹(shù)突棘形態(tài)和密度[14]。

1.5.3 Western blotting

凍存組織剪碎，加入去污劑和裂解液，勻漿，冰上裂解30 min，離心取上清液。BCA 法檢測(cè)目標(biāo)蛋白濃度，上清液中加入4 倍體積5×蛋白還原緩試液，沸水10 min 變性。制備5%濃縮膠和12%分離膠，依序上樣、分離、轉(zhuǎn)移，封閉液搖床封閉。加入PSD95(1∶2000)、SYN1(1∶4000)、GAP43(1∶1500)、Rac1(1∶600)、BDNF(1∶1000)、p-CREB(1∶1000)、CREB(1∶1000)和GAPDH(1∶1000)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，洗去多余一抗，封閉液稀釋二抗(1∶10000)，封閉搖床孵育。加入增強(qiáng)液與穩(wěn)定液，待熒光條帶明顯后，去掉多余底液，加入顯影液，凝膠成像儀拍攝條帶并分析，計(jì)算與GAPDH的相對(duì)灰度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以()表示，采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮

與對(duì)照組比較，模型組潛伏期和游泳總距離延長(zhǎng)(P<0.05)，運(yùn)動(dòng)組潛伏期和游泳總距離有所降低(P>0.05)；與模型組比較，模型運(yùn)動(dòng)組潛伏期和游泳總距離降低(P<0.05)。

與對(duì)照組比較，模型組穿越平臺(tái)次數(shù)、停留目標(biāo)象限的時(shí)間和距離減少(P<0.05)，運(yùn)動(dòng)組穿越平臺(tái)次數(shù)、停留目標(biāo)象限的時(shí)間與距離都有上升趨勢(shì)(P>0.05)；與模型組比較，模型運(yùn)動(dòng)組穿越平臺(tái)次數(shù)、停留目標(biāo)象限的時(shí)間和距離增加(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果

2.2 HE染色

與對(duì)照組比較，模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)不完整，數(shù)量減少，排列疏散，分布紊亂，胞質(zhì)深染，胞核固縮；運(yùn)動(dòng)組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)完整，排列緊密，胞質(zhì)和胞核正常；與模型組比較，模型運(yùn)動(dòng)組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)相對(duì)完整，數(shù)量較多，排列相對(duì)緊密，分布相對(duì)均勻，胞核固縮現(xiàn)象有所減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)

2.3 高爾基染色

與對(duì)照組比較，模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突一級(jí)分支上樹(shù)突棘總密度，以及成熟型、不成熟型、絲狀偽足型樹(shù)突棘密度都下降(P<0.05)，運(yùn)動(dòng)組有所上升(P>0.05)；與模型組比較，模型運(yùn)動(dòng)組樹(shù)突棘總密度，以及成熟型、不成熟型、絲狀偽足型樹(shù)突棘密度增加(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 各組海馬神經(jīng)元棘比較

表2 各組海馬神經(jīng)元棘密度 單位：（10 μm）-1

2.4 突觸相關(guān)蛋白

與對(duì)照組相比，模型組海馬區(qū)PSD95、SYN1、GAP43、Rac1蛋白均下降(P<0.05)，運(yùn)動(dòng)組所有蛋白有所增加(P>0.05)；與模型組相比，模型運(yùn)動(dòng)組大鼠海馬區(qū)所有蛋白增加(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表3。

表3 各組海馬突觸相關(guān)蛋白表達(dá) 單位：%

圖3 各組海馬突觸相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5 CREB/BDNF信號(hào)通路

與對(duì)照組相比，模型組海馬區(qū)BDNF、p-CREB和CREB 蛋白表達(dá)下降(P<0.05)，而運(yùn)動(dòng)組各蛋白均有所增加(P>0.05)；與模型組相比，模型運(yùn)動(dòng)組海馬區(qū)各蛋白增加(P<0.05)。見(jiàn)圖4、表4。

表4 各組海馬CREB/BDNF信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 單位：%

圖4 各組海馬CREB/BDNF信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

記憶是指將直接或間接獲得的信息或經(jīng)驗(yàn)在大腦中進(jìn)行編碼、鞏固和讀取的過(guò)程[15]。睡眠由快動(dòng)眼睡眠和非快動(dòng)眼睡眠兩種睡眠時(shí)相組成，在快動(dòng)眼睡眠時(shí)相，海馬體以θ 節(jié)律方式促進(jìn)記憶形成和鞏固[16]。多平臺(tái)水環(huán)境能特異性剝奪大鼠快動(dòng)眼睡眠時(shí)相，干擾海馬體神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)，影響學(xué)習(xí)記憶的形成和鞏固[17]。規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)學(xué)習(xí)記憶形成和鞏固有良好的促進(jìn)作用。Gomes da Silva 等[18]的研究顯示，有氧運(yùn)動(dòng)能影響大腦發(fā)育，促進(jìn)空間學(xué)習(xí)記憶形成，并增強(qiáng)后期機(jī)體喚起空間記憶的能力。本研究顯示，睡眠剝奪明顯損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶，而有氧運(yùn)動(dòng)能有效改善睡眠剝奪大鼠和正常大鼠的學(xué)習(xí)記憶。與以前的結(jié)果一致[19]。Kojima 等[20]借助近紅外光譜測(cè)量發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)可以緩解成年人睡眠剝奪導(dǎo)致的認(rèn)知損傷。

腦神經(jīng)元是學(xué)習(xí)記憶形成和鞏固的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究顯示，睡眠剝奪大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷，而有氧運(yùn)動(dòng)可以減輕損傷程度。

腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)由神經(jīng)元間的突觸連接，突觸結(jié)構(gòu)由神經(jīng)元樹(shù)突或軸突分支形成杯狀或球狀能與多個(gè)神經(jīng)元胞體或樹(shù)突接觸的末端膨大樹(shù)突棘組成[21]。樹(shù)突棘從形態(tài)上分為成熟型、不成熟型和絲狀偽足型3 種，其形態(tài)和密度是動(dòng)態(tài)變化的，這是突觸可塑性的前提[22]。樹(shù)突棘密度增加，突觸可塑性隨之增強(qiáng)[23]。Guo 等[24]發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期皮下注射辛伐他汀會(huì)導(dǎo)致小鼠海馬區(qū)樹(shù)突棘發(fā)育異常，成熟型樹(shù)突棘減少，學(xué)習(xí)記憶損傷。Miletínová 等[25]梳理發(fā)現(xiàn)，睡眠能夠通過(guò)突觸結(jié)構(gòu)促使學(xué)習(xí)記憶形成。Zhou等[26]發(fā)現(xiàn)，剝奪小鼠快動(dòng)眼睡眠時(shí)相，海馬區(qū)樹(shù)突狀鈣尖峰下降，成熟型樹(shù)突棘減少，學(xué)習(xí)記憶損傷。Feng 等[27]發(fā)現(xiàn)，8 周有氧運(yùn)動(dòng)能緩解卵巢切除小鼠海馬區(qū)樹(shù)突棘發(fā)育，增加成熟型樹(shù)突棘數(shù)量，緩解學(xué)習(xí)記憶損傷。本研究顯示，睡眠剝奪大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷以及有氧運(yùn)動(dòng)逆轉(zhuǎn)其學(xué)習(xí)記憶受損的機(jī)制，與突觸可塑性改變有關(guān)。

樹(shù)突棘的發(fā)育及密度變化受PSD95、GAP43、Rac1 等蛋白調(diào)控。PSD95 是突觸后膜的腳手架蛋白，能促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育，影響樹(shù)突棘形成；降低大鼠腦內(nèi)PSD95 蛋白表達(dá)，大鼠海馬區(qū)樹(shù)突棘形態(tài)異常，單位長(zhǎng)度棘密度下降，并伴有學(xué)習(xí)記憶水平下降[28-29]。SYN1 是與神經(jīng)元發(fā)育密切相關(guān)的磷蛋白，能調(diào)控樹(shù)突棘生長(zhǎng)與形成，并與神經(jīng)元細(xì)胞骨架蛋白相互作用，維持樹(shù)突棘形態(tài)[30]。12 周有氧運(yùn)動(dòng)可以上調(diào)學(xué)習(xí)記憶損傷小鼠海馬和前額葉SYN1 表達(dá)，增加樹(shù)突棘密度，逆轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)記憶受損[31]。GAP43 廣泛分布于神經(jīng)元中，在樹(shù)突棘生長(zhǎng)發(fā)育階段增加，與樹(shù)突棘形態(tài)和密度線性相關(guān)[32]。GAP43 在樹(shù)突棘局部積累后，通過(guò)鈣調(diào)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織改變，調(diào)節(jié)樹(shù)突棘生長(zhǎng)，并維持其形態(tài)和密度，促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶形成和鞏固[33]。Rac1 為神經(jīng)元關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)蛋白，可作用于肌動(dòng)蛋白核相關(guān)蛋白2/3 (actin-related proteins,Arp2/3)，驅(qū) 動(dòng)Arp2/3 活性，使神經(jīng)元肌動(dòng)蛋白骨架重排，導(dǎo)致樹(shù)突棘形成。當(dāng)Rac1缺失或抑制時(shí)，阻礙海馬區(qū)樹(shù)突棘形成，損傷長(zhǎng)時(shí)程促進(jìn)，降低突觸傳遞活性[34-35]。本研究顯示，有氧運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)樹(shù)突棘形態(tài)及密度的機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)PSD95、SYN1、GAP43和Rac1等蛋白表達(dá)有關(guān)。

CREB/BDNF 信號(hào)通路是調(diào)節(jié)突觸可塑性的常見(jiàn)通路[36-37]。CREB 作為一種核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，在腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞核中廣泛分布，常需要多種蛋白激酶在絲氨酸129、133 或142 位點(diǎn)上使其磷酸化，才能進(jìn)行核內(nèi)轉(zhuǎn) 錄[38]。Wu 等[39]發(fā)現(xiàn)，8 周有氧運(yùn)動(dòng)能促使CREB 磷酸化，調(diào)節(jié)BDNF 表達(dá)，增強(qiáng)大鼠學(xué)習(xí)記憶。BDNF作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素的一種，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成前體BDNF，經(jīng)呋喃或其他前轉(zhuǎn)化酶在跨高爾基網(wǎng)絡(luò)或分泌顆粒中轉(zhuǎn)化為成熟的BDNF，在維護(hù)和完善涉及學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)元回路方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[40]。BDNF是PSD95、SYN1、GAP43 和Rac1 等樹(shù)突棘調(diào)節(jié)蛋白的上游調(diào)節(jié)蛋白[6-7]。Zagrebelsky 等[8]發(fā)現(xiàn)，BDNF 可通過(guò)擴(kuò)大微管，增加PSD95 表達(dá)，使肌動(dòng)蛋白在樹(shù)突棘處募集，從而促進(jìn)樹(shù)突棘成熟，并維持其形態(tài)。Lu 等[10]發(fā)現(xiàn)，BDNF能通過(guò)去乙?；?調(diào)節(jié)SYN1表達(dá)，影響樹(shù)突棘形態(tài)。Gong 等[9]發(fā)現(xiàn)，給予BDNF 后，能增加GAP43 表達(dá)，促進(jìn)樹(shù)突棘生長(zhǎng)。Hedrick 等[11]發(fā)現(xiàn)，BDNF能調(diào)節(jié)Rac1表達(dá)，影響樹(shù)突棘結(jié)構(gòu)。本研究顯示，有氧運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)PSD95、SYN1、GAP43 和Rac1 等蛋白表達(dá)的機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)CREB/BDNF 信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，有氧運(yùn)動(dòng)能緩解睡眠剝奪大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷，可能與調(diào)控睡眠剝奪大鼠海馬CREB/BDNF信號(hào)通路，改善其突觸可塑性有關(guān)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。