南酸棗乳酸菌飲料發(fā)酵條件的優(yōu)化

李若熙，王洋，康旭，袁先鈴，肖夏，葉陽(yáng)

（四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000）

南酸棗 [Choerospondias axillaris（Roxb.）Burtt et Hill]屬于漆樹(shù)科、南酸棗屬，又名五眼果、酸棗、酸醋果等[1]，含有維生素、原花青素和黃酮等生物活性物質(zhì)[2]。其中黃酮在人體內(nèi)不能直接合成，大多靠外界攝取，有抗腫瘤、抗氧化[3]、保護(hù)心血管[4]的作用。研究表明廣棗中的總黃酮含量[5]高于石榴、山楂、紅提等常見(jiàn)黃酮含量較高的水果。但是由于南酸棗鮮果味酸，不宜直接食用，常被加工成南酸棗糕[6]、軟糖、蜜餞[7]和果汁飲料[8]等。

近年來(lái)，隨著對(duì)乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中功能性物質(zhì)研究的不斷深入，越來(lái)越多的果蔬發(fā)酵飲品進(jìn)入大眾視野[9-11]，乳酸發(fā)酵飲品以其益生特性和獨(dú)特的風(fēng)味受到消費(fèi)者的青睞，不僅如此，乳酸菌在代謝過(guò)程中可釋放有機(jī)酸及細(xì)菌素抑制雜菌生長(zhǎng)從而延長(zhǎng)食品貨架期[12-13]。韓喜艷等[14]利用乳酸菌制備出一種椰子植物酸奶，風(fēng)味良好；周琦等[15]制備了一種黑木耳蕎麥復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飲料，并在其中添加了草莓汁，充分利用了水果資源；汪云陽(yáng)等[16]優(yōu)化了發(fā)酵枸杞飲料的工藝條件。鑒于南酸棗營(yíng)養(yǎng)豐富、口味獨(dú)特，相關(guān)學(xué)者對(duì)南酸棗的發(fā)酵飲料進(jìn)行研究，如羅登宏[17]以野生南酸棗泥為原料，利用嗜熱鏈球菌和保加利亞桿菌制備了南酸棗功能性發(fā)酵飲料；李俶等[18]測(cè)定了南酸棗飲料發(fā)酵前后的游離酚、游離黃酮含量，但都未提及發(fā)酵條件對(duì)南酸棗飲料品質(zhì)的影響。Adetuyi等[19]及左映平等[20]的研究表明不同發(fā)酵條件對(duì)果蔬汁的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)特別是總黃酮含量有顯著差異。因此，本研究以南酸棗為主要原料，并在感官評(píng)分的基礎(chǔ)上以最大程度保留南酸棗中的黃酮為目標(biāo)，探索不同發(fā)酵條件下南酸棗發(fā)酵飲料的黃酮含量、VC含量、總酸含量和pH值、糖度值及感官評(píng)分的變化，并得出最佳發(fā)酵工藝，以期對(duì)南酸棗發(fā)酵飲料的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南酸棗泥：四川宏野食品有限公司；白砂糖：市售；復(fù)合乳酸菌（植物乳桿菌N13、保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌、腸膜明串珠菌、嗜熱鏈球菌）：北京川秀科技有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、草酸、偏磷酸、乙醇（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；酚酞、抗壞血酸（均為分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；沒(méi)食子酸、無(wú)水碳酸鈉、福林酚、冰乙酸（均為分析純）：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；2，6-二氯靛酚鈉鹽（分析純）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

醫(yī)用低溫保存箱（DW-25L262）：青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；糖度計(jì)（0～32%）：邦西儀器科技（上海）有限公司；醫(yī)用離心機(jī)（TG16G）：鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2）：常州榮華儀器制造有限公司；破壁料理機(jī)（SP520）：浙江蘇泊爾股份有限公司；生化培養(yǎng)箱（LRH-250C）：韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（UV-19001）：島津儀器（蘇州）有限公司；臺(tái)式色差儀（UItraScanVIS）：美國(guó)HunterLab公司；自動(dòng)電位滴定儀（ZDJ-4A）：南京科環(huán)分析儀器有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S）：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵工藝流程

將南酸棗泥100 g、白砂糖30 g、蒸餾水120 mL混合搖勻，根據(jù)單因素試驗(yàn)條件不同，接種0.2%～1.0%的復(fù)合乳酸菌，35℃～39℃發(fā)酵12 h～60 h，每個(gè)梯度做3組平行。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 接種量

設(shè)定初始發(fā)酵溫度37℃、發(fā)酵時(shí)間48 h，設(shè)置5組不同的接種量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%），以總酸、pH值、糖度值、黃酮及VC含量和感官評(píng)分為指標(biāo)篩選最佳接種量。

1.3.2.2 發(fā)酵溫度

設(shè)定初始接種量0.4%、發(fā)酵時(shí)間48 h，設(shè)置5組不同的發(fā)酵溫度（35、36、37、38、39 ℃），以總酸、pH 值、糖度值、黃酮及VC含量和感官評(píng)分為指標(biāo)篩選最佳發(fā)酵溫度。

1.3.2.3 發(fā)酵時(shí)間

設(shè)定初始接種量0.4%、發(fā)酵溫度37℃，設(shè)置5組不同的發(fā)酵時(shí)間（12、24、36、48、60 h），以總酸、pH 值、糖度值、黃酮及VC含量和感官評(píng)分為指標(biāo)篩選最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.3.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乳酸飲料的黃酮含量及感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)，選取發(fā)酵時(shí)間、接種量、發(fā)酵溫度3個(gè)因素，采用L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.4 南酸棗發(fā)酵飲料黃酮含量的測(cè)定

采用分光光度法進(jìn)行測(cè)定，參照GB/T 20574—2006《蜂膠中總黃酮含量的測(cè)定方法分光光度比色法》[21]，并稍作修改，取30g南酸棗發(fā)酵飲料，加入30mL無(wú)水乙醇，用集熱式恒溫加熱磁力攪拌器攪拌30 min，在4℃、6 000 r/min條件下離心10 min，取上清液用中速定性濾紙進(jìn)行過(guò)濾，取4 mL濾液加入1 mL 30%的乙醇溶液定容至5 mL，再加入0.3 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，靜置5 min，加入0.3 mL10%的硝酸鋁溶液，靜置6 min，再加入2 mL1 mol/L的氫氧化鈉溶液，隨后用30%的乙醇溶液定容至10 mL，靜置15 min后用分光光度計(jì)測(cè)定在510 nm處的吸光度。

以吸光值（y）為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，經(jīng)線(xiàn)性擬合得回歸方程：y=1.113 6x-0.330 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.991 1。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算樣品中的黃酮含量，結(jié)果以mg/mL計(jì)。

1.3.5 南酸棗發(fā)酵飲料VC含量的測(cè)定

采用滴定法進(jìn)行測(cè)定，參照GB 5009.86—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中抗壞血酸的測(cè)定》[22]，并稍作修改，取5 g南酸棗發(fā)酵飲料，加入5 g 20 g/L的偏磷酸溶液或草酸溶液，搗成勻漿，繼續(xù)加入20 g/L的偏磷酸溶液或草酸溶液定容至100 mL，用中速定性濾紙過(guò)濾，取10 mL濾液于錐形瓶中，用標(biāo)定過(guò)的2，6-二氯靛酚溶液滴定，直至溶液呈粉紅色且15 s不褪色為止，同時(shí)做空白對(duì)照試驗(yàn)。VC含量計(jì)算公式如下。

式中：V為滴定樣品所消耗的2，6-二氯靛酚溶液的體積，mL；V0為滴定空白所消耗2，6-二氯靛酚溶液的體積，mL；T為2，6-二氯靛酚溶液的滴定度，即每毫升2，6-二氯靛酚溶液相當(dāng)于抗壞血酸的毫克數(shù)，mg/mL；A為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.6 南酸棗發(fā)酵飲料總酸的測(cè)定

采用酸堿滴指示劑定法進(jìn)行測(cè)定，參照GB12456—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總酸的測(cè)定》[23]，并稍作修改，將南酸棗發(fā)酵飲料用中速定性濾紙過(guò)濾，取20mL濾液于錐形瓶中，加入配制好的酚酞指示劑2滴～3滴，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定至微紅色且30 s不褪色，記錄用量，同時(shí)做空白對(duì)照試驗(yàn)?？偹岷坑?jì)算公式如下。

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的濃度，mol/L；V1為滴定樣品所消耗氫氧化鈉溶液的體積，mL；V2為滴定空白所消耗氫氧化鈉溶液的體積，mL；V3為樣品稀釋液總體積，mL；V4為滴定時(shí)吸取的樣液的體積，mL；K為換算為適當(dāng)酸的系數(shù)，即1 mol氫氧化鈉相當(dāng)于主要酸的克數(shù)，這里主要酸為乳酸，K=0.090。

1.3.7 南酸棗發(fā)酵飲料pH值的測(cè)定

使用自動(dòng)電位滴定儀測(cè)定進(jìn)行測(cè)定，參照GB 5009.239—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測(cè)定》[24]，將南酸棗發(fā)酵飲料在4℃、6 000 r/min條件下離心10 min，取上清液用中速定性濾紙過(guò)濾，取10 mL濾液在室溫下測(cè)定樣品pH值。

1.3.8 南酸棗發(fā)酵飲料糖度的測(cè)定

使用糖度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，參照魏利民等[25]的方法，取南酸棗發(fā)酵飲料1～2滴于糖度計(jì)，直接讀數(shù)。

1.3.9 南酸棗發(fā)酵飲料感官評(píng)價(jià)

參照NY 82.2—1988《果汁測(cè)定方法感官檢驗(yàn)》[26]的方法。根據(jù)發(fā)酵制品的甜度、酸度、香味、口感、色澤分別進(jìn)行品評(píng)打分，1分為最不喜歡，20分為最喜歡，如表1所示。

表1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory scoring criteria

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS26.0軟件完成統(tǒng)計(jì)處理，每個(gè)數(shù)據(jù)重復(fù)3次取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對(duì)南酸棗飲料品質(zhì)的影響

接種量對(duì)南酸棗飲料品質(zhì)的影響見(jiàn)圖1～圖2。

圖1 接種量對(duì)總酸、pH值、糖度和感官評(píng)分的影響Fig.1 Effects of inoculation amount on total acid，pH value，sugar content and sensory score

圖2 接種量對(duì)黃酮和VC含量的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on the content of flavonoids and vitamin C

如圖1～圖2所示，隨接種量的增加，VC、總酸及黃酮含量和感官評(píng)分整體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在接種量為0.4%時(shí)VC及黃酮含量明顯增加，此時(shí)VC含量、黃酮含量及總酸含量分別為9.2 mg/100 g、3.13 mg/mL、7.29 g/L，均達(dá)最大值，pH 值最低，為 3.47。這是由于南酸棗泥原液相比于其他水果發(fā)酵原液較為黏稠，溶氧量小[27-28]，在較低種劑量時(shí)乳酸菌便快速生長(zhǎng)代謝達(dá)到頂峰，而當(dāng)接種量超過(guò)0.4%時(shí)，VC、總酸及黃酮含量卻逐漸下降，在接種量為0.6%～1.0%時(shí)黃酮含量下降2.2%～5.1%。王玥等[29]的研究表明柿子乳酸菌發(fā)酵飲料的接種量在1%～3%時(shí)，乳酸含量和活菌數(shù)增幅度明顯，而在3%之后增幅放緩。這說(shuō)明接種量較大其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗也較快，限制了乳酸菌的生長(zhǎng)[30]，同時(shí)微生物代謝需要利用VC[31]，過(guò)多的菌株使VC的分解加劇。糖度值從接種量為0.2%的5.5%逐步下降，到接種量為1.0%時(shí)只有4.5%。綜合分析南酸棗發(fā)酵飲料的最佳接種量為0.4%。

2.2 發(fā)酵溫度對(duì)南酸棗飲料品質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度對(duì)南酸棗飲料品質(zhì)的影響見(jiàn)圖3～圖4。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)總酸、pH值、糖度和感官評(píng)分的影響Fig.3 Effects of fermentation temperature on total acid，pH value，sugar content and sensory score

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)黃酮和VC含量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the content of flavonoids and vitamin C

如圖3～圖4所示，隨著發(fā)酵溫度升高，VC含量呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明發(fā)酵溫度對(duì)VC的分解影響較大；總酸及黃酮含量和感官評(píng)分呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)溫度為37℃時(shí)黃酮含量明顯提高，達(dá)最大值，為3.38 mg/mL，此時(shí)是提取黃酮的最佳發(fā)酵溫度，高于吳振等[32]檢測(cè)的藍(lán)莓果汁的總黃酮含量，且由于此時(shí)乳酸含量逐漸增多所形成的酸性環(huán)境使VC含量的降幅也較小，較上一個(gè)溫度梯度僅下降4.1%。而當(dāng)溫度繼續(xù)升高為38℃和39℃時(shí)黃酮含量分別下降了3.3%和5.3%。王香君[33]等的研究表明溫度會(huì)使黃酮類(lèi)化合物的提取有顯著影響，當(dāng)溫度升高黃酮含量也隨之大幅增加，但是高溫會(huì)使細(xì)菌衰老加劇，發(fā)酵也停止較早，使最終的發(fā)酵產(chǎn)物變少。同時(shí)由于VC的熱不穩(wěn)定性[34]，高溫會(huì)加快其損耗。38℃時(shí)的VC含量降幅明顯增加，較上37℃下降了25.8%。高潔[35]利用酸漿果為試驗(yàn)原料，采用嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵，得到最適發(fā)酵溫度為37℃。38℃是總酸及感官評(píng)分的最優(yōu)發(fā)酵溫度，但與37℃相差不明顯，因此綜合分析南酸棗發(fā)酵飲料的最佳發(fā)酵溫度為37℃。

2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)南酸棗飲料品質(zhì)的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)南酸棗飲料品質(zhì)的影響見(jiàn)圖5～圖6。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)總酸、pH值、糖度和感官評(píng)分的影響Fig.5 Effects of fermentation time on total acid，pH value，sugar content and sensory score

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃酮和VC含量的影響Fig.6 Effect of fermentation time on the content of flavonoids and vitamin C

如圖5～圖6所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，總酸及黃酮含量呈上升趨勢(shì)，特別是36 h后黃酮含量明顯提高，而VC含量先減小，在36 h后趨于穩(wěn)定。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為60 h時(shí)南酸棗發(fā)酵飲料的黃酮含量達(dá)最大值，為3.25 mg/mL，較12 h上升了27%，高于田歡等[36]制備的紅提果汁及果酒的總黃酮含量。此時(shí)糖度值與pH值也最低，分別為4.6%與3.19。何夢(mèng)秀等[37]及李俊等[38]的研究表明在一定范圍內(nèi)，乳酸菌發(fā)酵飲料的總酸及黃酮含量隨時(shí)間增長(zhǎng)逐步升高。發(fā)酵時(shí)間過(guò)短，菌落還在繁殖前期，活菌數(shù)少，發(fā)酵不完全、產(chǎn)物較少[39]，因此在發(fā)酵前期總酸及黃酮含量都較低。雖然在60 h時(shí)發(fā)酵液質(zhì)地稍稀，感官評(píng)分低于發(fā)酵時(shí)間為48 h的發(fā)酵液，但是差異不明顯，但總酸和黃酮含量與發(fā)酵時(shí)間呈明顯的正相關(guān)。VC含量會(huì)因發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)損失增大，這是由于VC穩(wěn)定性較差且乳酸菌代謝會(huì)分解利用部分VC，但在36 h后VC的損耗逐漸趨于穩(wěn)定，這是由于36 h后發(fā)酵逐漸完全，產(chǎn)物增多，乳酸形成的酸性條件使VC的損耗變小[31]，因此綜合分析南酸棗發(fā)酵飲料的最佳發(fā)酵時(shí)間為60 h。

2.4 正交結(jié)果分析

南酸棗功能性益生菌飲料發(fā)酵條件的正交優(yōu)化結(jié)果及數(shù)據(jù)處理如表2和表3所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis of orthogonal test

由表2～表3可知，以黃酮含量為響應(yīng)值時(shí)，發(fā)酵時(shí)間、接種量及發(fā)酵溫度3個(gè)因素的極差關(guān)系：A>B>C，由此可見(jiàn)發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃酮含量的影響最大，接種量及發(fā)酵溫度次之，最佳發(fā)酵條件：A3B2C1，即發(fā)酵時(shí)間60 h、接種量0.4%、發(fā)酵溫度37℃時(shí)南酸棗乳酸菌飲料的黃酮含量最高。對(duì)發(fā)酵液感官評(píng)分的極差分析顯示，發(fā)酵時(shí)間、接種量及發(fā)酵溫度3個(gè)因素的極差關(guān)系：A=B>C，由此可見(jiàn)發(fā)酵時(shí)間及接種量對(duì)黃酮含量的影響較大，發(fā)酵溫度次之，最佳發(fā)酵條件：A3B2C2，即發(fā)酵時(shí)間60 h、接種量0.4%、發(fā)酵溫度38℃時(shí)，南酸棗乳酸菌飲料的感官評(píng)分最高，為88分。

綜合考慮黃酮含量、感官指標(biāo)及耗能問(wèn)題確定最優(yōu)發(fā)酵條件：發(fā)酵時(shí)間60 h、接種量0.4%、發(fā)酵溫度37℃。在此條件下檢測(cè)到黃酮含量為3.43 mg/mL，感官評(píng)分為86分。遠(yuǎn)高于李俶等[18]經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的南酸棗飲料的黃酮含量。

2.5 南酸棗乳酸菌飲料發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化

南酸棗乳酸菌飲料發(fā)酵前后成分變化見(jiàn)表4。

表4 南酸棗飲料發(fā)酵前后成分變化Table 4 Changes of components of Choerospondias axillaris beverage before and after fermentation

如表4所示，南酸棗飲料經(jīng)過(guò)乳酸菌發(fā)酵黃酮含量較發(fā)酵前提高40%，有研究表明微生物生物轉(zhuǎn)化可生成黃酮類(lèi)物質(zhì)或者改善其合成途徑[40]。而VC由于其對(duì)光、熱的敏感性及作為乳酸菌的代謝底物在發(fā)酵過(guò)程中被部分利用[41]，使得南酸棗飲料在經(jīng)過(guò)發(fā)酵后VC含量減少31.5%。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化得出發(fā)酵條件影響黃酮含量的順序：發(fā)酵時(shí)間>接種量>發(fā)酵溫度；影響感官評(píng)分的順序：發(fā)酵時(shí)間=接種量>發(fā)酵溫度。結(jié)果表明：當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為60 h、接種量為0.4%、發(fā)酵溫度為37℃時(shí)是南酸棗飲料的最優(yōu)發(fā)酵條件。該條件下黃酮含量為3.43 mg/mL，較發(fā)酵前提高40%，其口感潤(rùn)滑、質(zhì)地細(xì)膩、酸甜適中并具有濃郁的果實(shí)香氣。本試驗(yàn)制備的南酸棗乳酸菌發(fā)酵飲料在風(fēng)味口感良好的基礎(chǔ)上最大程度提高了黃酮含量，且總酸含量高、VC含量損耗較小。