miR-122在乙型肝炎病毒感染小鼠病毒復(fù)制與肝功能損傷中的作用*

李 莉，馬 紅

新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，新疆烏魯木齊 830000

乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球肝病流行的主要原因，HBV作為一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科，通過前基因組RNA反轉(zhuǎn)錄復(fù)制DNA[1]。HBV感染增加了慢性乙型肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌等疾病的發(fā)生風(fēng)險[2]，其中，慢性乙型肝炎對人類健康影響較大，根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的數(shù)據(jù)，全球約有2.4億人患有慢性乙型肝炎，其中20%～30%的患者會發(fā)展為肝硬化或肝細(xì)胞癌，導(dǎo)致患者肝衰竭[3]。目前，抗病毒療法是治療HBV感染相關(guān)疾病的有效方法。然而，由于停藥后復(fù)發(fā)和一些其他不良反應(yīng)等影響，使該療法的應(yīng)用受到限制[4]。因此，迫切需要闡明HBV感染后的發(fā)病機(jī)制并探索抑制或消除人體內(nèi)HBV的新型有效方法。微小RNA(miRNA)是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼功能性小RNA分子，長度為21～24個核苷酸，在許多生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，miRNA在HBV感染中發(fā)揮作用，在HBV感染期間，病毒復(fù)制和表達(dá)的產(chǎn)物導(dǎo)致內(nèi)源性miRNA出現(xiàn)異常表達(dá)，并使感染持續(xù)存在，從而促進(jìn)組織或機(jī)體損傷[5]；然而，宿主細(xì)胞內(nèi)也有一些miRNA，如miR-1231、miR-204和miR-1236[6-7]，可通過直接或間接機(jī)制抑制HBV的復(fù)制和表達(dá)。miR-122是在肝內(nèi)特異性高表達(dá)的一種miRNA，約占肝內(nèi)所有miRNA的70%，在調(diào)節(jié)肝細(xì)胞分化與功能維持中起著關(guān)鍵作用[8]。已有體外研究表明，miR-122能夠明顯抑制HBV的復(fù)制[9]，但關(guān)于miR-122在體內(nèi)HBV感染中作用的相關(guān)研究較少，為了進(jìn)一步揭示miR-122對HBV感染后病毒復(fù)制的影響，本研究通過構(gòu)建HBV感染小鼠模型，檢測給予miR-122處理后的病毒復(fù)制水平變化，并觀察其對肝功能損傷的影響，以期為HBV感染性疾病的診療研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選擇40只無特異病原體(SPF)級C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，雌雄各20只，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。小鼠分籠飼養(yǎng)，期間自由進(jìn)食、飲水，飼養(yǎng)室溫維持在 20～25 ℃，相對濕度為40%～60%，每日光照/黑暗各12 h交替。所有小鼠飼喂1周后進(jìn)行實驗。

1.2儀器與試劑 乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購于北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司，腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-2及IL-6 ELISA檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，Trizol試劑盒購于美國GIBCO公司，TaqMan MicroRNA assay試劑盒購于北京百奧萊博生物科技有限公司，HBV核酸提取試劑盒和HBV-DNA檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)購于北京索奧生物醫(yī)藥科技有限公司，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒和蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購于北京百奧萊博生物科技有限公司，Masson染色試劑盒購于上海貝博生物科技有限公司，小鼠抗人乙型肝炎核心抗原(HBcAg)單克隆抗體購于北京博爾西科技有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購于英國Abcam公司。rAAV8-1.3HBV重組腺病毒載體購于北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司，pAV.Ex1d-CMV miR-122慢病毒載體構(gòu)建與包裝均交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。SMT100V便攜式全自動生化分析儀購于南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司，LabServTMK3型酶標(biāo)儀購于美國Thermo Fisher Scientific公司，CFX96 Touch實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測系統(tǒng)購于美國BIO-RAD公司，XSP-1200光學(xué)顯微鏡購于上海光學(xué)儀器五廠有限公司。

1.3方法

1.3.1動物模型建立與分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只小鼠隨機(jī)分為對照組、HBV組、miR-NC組、miR-122組，每組各10只。除對照組外，其余小鼠均根據(jù)文獻(xiàn)[10]報道的方法建立HBV感染模型，給予小鼠尾靜脈高壓注射50 μL rAAV8-1.3HBV重組腺病毒載體(拷貝數(shù)5.0×1010copies/mL)，5 s內(nèi)注射完畢。對照組采用同樣方法注入等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)。注射后，miR-NC組小鼠經(jīng)尾靜脈注射50 μL空載體病毒，miR-122組小鼠經(jīng)尾靜脈注射50 μL含miR-122的慢病毒載體，對照組和HBV組分別注射等體積PBS，所有處理結(jié)束后將小鼠繼續(xù)分籠飼養(yǎng)。

1.3.2小鼠血清HBsAg、HBeAg、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平檢測 各組小鼠處理完畢飼養(yǎng)4周后，全身消毒，經(jīng)尾靜脈取血，靜置30 min，以12 000 r/min離心10 min后，收集上清液。各組小鼠血清HBsAg、HBeAg水平檢測采用ELISA試劑盒，AST、ALT水平檢測采用SMT100V便攜式全自動生化分析儀，具體步驟嚴(yán)格參照說明書進(jìn)行。

1.3.3ELISA檢測小鼠血清炎癥因子水平 取分離的各組小鼠血清，采用ELISA試劑盒檢測血清TNF-α、IL-2及IL-6水平，具體步驟嚴(yán)格參照說明書進(jìn)行。

1.3.4qRT-PCR檢測小鼠肝組織miR-122與血清HBV-DNA水平 取血后，處死各組小鼠并剪開腹腔獲取肝組織，在無菌環(huán)境下剪碎，加入液氮研磨，采用Trizol試劑盒提取肝組織RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板，采用qRT-PCR檢測肝組織內(nèi)miR-122表達(dá)水平，以U6作為內(nèi)參，具體根據(jù)TaqMan MicroRNA assay試劑盒說明書操作，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)30次；72 ℃ 1 min。取各組小鼠血清標(biāo)本，根據(jù)HBV核酸提取試劑盒說明書提取血清DNA，采用qRT-PCR檢測HBV-DNA水平，以GAPDH作為內(nèi)參，根據(jù)HBV-DNA檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)說明書進(jìn)行檢測，反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。各引物序列如下：miR-122上游引物5′-TGGAGTGTGACAATGGTG-3′，下游引物5′-GTCAGGGTCCGAGG-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCAC GAATTTGCGT-3′；HBV-DNA上游引物5′-ACCGACCTTGAGGCATACTT-3′，下游引物5′-GCCTACAGCCTCCTAGTACA-3′；GAPDH上游引物5′-ACCACAGCTCAAGCCATCAC-3′，下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTAT-3′。

1.3.5免疫組織化學(xué)染色法檢測小鼠肝組織HBcAg表達(dá)情況 取各組小鼠肝組織固定后，常規(guī)石蠟包埋，切片，烤箱內(nèi)烤片，脫蠟水化，利用檸檬酸鈉加熱修復(fù)抗原和0.3%過氧化氫液孵育以封閉過氧化物酶活性，PBS沖洗，10%山羊血清封閉，滴加小鼠抗人HBcAg單克隆抗體(1∶100)，4 ℃過夜，滴加對應(yīng)二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h。處理結(jié)束后用PBS沖洗，DAB顯色，予以蘇木素染色，脫水透明，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況并采集圖像，陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核呈棕色至棕褐色。隨機(jī)選擇5個視野，鏡下計數(shù)總細(xì)胞數(shù)與HBcAg陽性細(xì)胞數(shù)，計算HBcAg陽性細(xì)胞率。

1.3.6HE染色觀察小鼠肝組織病理形態(tài)變化 將制備的各組小鼠肝組織切片經(jīng)脫蠟后浸入梯度乙醇中處理。切片上加入Harris蘇木精染色5 min，流水沖洗，滴加1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流水沖洗，加入伊紅染色3 min，脫水透明，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝組織病理形態(tài)并采集圖像。

1.3.7Masson染色觀察小鼠肝組織纖維化情況 取制備的各組小鼠肝組織切片，脫蠟，再浸入梯度乙醇中處理。切片上加入weigert氏鐵蘇木精溶液染色10 min，流水沖洗，滴入1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗，再用Masson染液染色3 min，麗春紅酸性品紅液染色5 min，1%磷鉬酸水溶液處理3 min，苯胺藍(lán)染液染色5 min，采用1%冰醋酸水溶液浸泡后洗滌切片，脫水透明，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織內(nèi)藍(lán)染膠原表達(dá)情況并采集圖像。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠血清HBsAg、HBeAg、AST及ALT水平比較 對照組小鼠血清中未檢測到HBsAg和HBeAg，HBV組小鼠血清中均檢測到HBsAg和HBeAg，且二者水平較高，由此判斷建模成功。HBV組小鼠AST、ALT水平較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與HBV組比較，miR-122組小鼠血清HBsAg、HBeAg、AST、ALT水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而HBV組和miR-NC組小鼠AST、ALT水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組小鼠血清HBsAg、HBeAg、AST及ALT水平比較

2.2各組小鼠血清炎癥因子水平比較 HBV組小鼠血清TNF-α、IL-2及IL-6水平均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與HBV組比較，miR-122組小鼠血清TNF-α、IL-2、IL-6水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；HBV組和miR-NC組小鼠血清TNF-α、IL-2及IL-6水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3各組小鼠肝組織miR-122與血清HBV-DNA水平比較 與對照組比較，HBV組小鼠肝組織miR-122水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與HBV組比較，miR-122組小鼠肝組織miR-122水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而HBV組和miR-NC組小鼠肝組織miR-122水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1A。對照組小鼠血清中未檢測到HBV-DNA，檢測結(jié)果呈陰性；miR-122組小鼠血清HBV-DNA水平較HBV組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；HBV組和miR-NC組小鼠血清HBV-DNA水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1B。

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-2及IL-6水平比較

2.4各組小鼠肝組織HBcAg表達(dá)情況比較 在對照組小鼠肝組織內(nèi)未出現(xiàn)著色細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，而HBV組小鼠肝組織內(nèi)染色明顯加深，HBcAg陽性細(xì)胞率較高；與HBV組比較，miR-122組小鼠肝組織染色較淺，HBcAg陽性細(xì)胞率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而miR-NC組與HBV組HBcAg陽性細(xì)胞率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2、3。

注：A為各組小鼠肝組織miR-122水平比較；B為各組小鼠血清HBV-DNA水平比較；與對照組比較，*P<0.05；與HBV組比較，#P<0.05；與miR-NC組比較，△P<0.05。圖1 各組小鼠肝組織miR-122與血清HBV-DNA水平比較

圖2 各組小鼠肝組織HBcAg表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)染色，×100)

注：與HBV組比較，#P<0.05；與miR-NC組比較，△P<0.05。圖3 各組小鼠肝組織HBcAg陽性細(xì)胞率比較

2.5各組小鼠肝組織病理形態(tài)變化比較 對照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊且緊密；HBV組小鼠肝組織內(nèi)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，排列紊亂，有大量炎性細(xì)胞浸潤；miR-122組小鼠肝組織損傷程度較HBV組明顯減輕，組織內(nèi)細(xì)胞排列較為整齊，炎性細(xì)胞浸潤減少，而miR-NC組小鼠肝組織損傷現(xiàn)象與HBV組比較未發(fā)生改善，見圖4。

2.6各組小鼠肝組織纖維化情況比較 對照組小鼠肝組織內(nèi)藍(lán)染區(qū)域少，未發(fā)生明顯纖維化；相較于對照組，HBV組小鼠肝組織內(nèi)有大量藍(lán)染區(qū)域出現(xiàn)，組織發(fā)生明顯纖維化；miR-122組小鼠肝組織內(nèi)藍(lán)染區(qū)域較HBV組減少，組織纖維化現(xiàn)象減輕，而miR-NC組肝組織仍有大量纖維化，較HBV組未發(fā)生明顯改變，見圖5。

圖4 各組小鼠肝組織病理形態(tài)變化(HE染色，×100)

圖5 各組小鼠肝組織纖維化情況(Masson染色，×100)

3 討 論

HBV感染是引起肝臟疾病的主要原因之一，探討針對HBV的抗病毒途徑對開發(fā)嚴(yán)重肝臟疾病的有效預(yù)防及治療方法至關(guān)重要。HBV基因組長3.2 kb，包含4個基因：核心蛋白(HBc)、X蛋白(HBx)、表面蛋白(HBs)和P蛋白[1]。HBV作為一種非致細(xì)胞病變病毒，優(yōu)先在肝細(xì)胞中復(fù)制，其進(jìn)入肝細(xì)胞后，病毒DNA被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，形成共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)；cccDNA生成病毒RNA，包括復(fù)制中間體，稱為前基因組(pg)RNA和HBs、HBx的病毒mRNA。HBc、P蛋白和pgRNA組裝成核衣殼，P蛋白利用其反轉(zhuǎn)錄酶活性將pgRNA轉(zhuǎn)化為松弛環(huán)狀DNA，而成熟的核衣殼在作為感染性病毒體分泌之前最終與HBs結(jié)合[11]。然而，迄今為止，抗病毒免疫的機(jī)制和HBV感染的機(jī)制尚未完全闡明。近年來研究表明，miRNA可作為HBV感染機(jī)制中的一類新型調(diào)節(jié)因子，細(xì)胞 miRNA能夠通過直接或間接作用對HBV轉(zhuǎn)錄、復(fù)制及表達(dá)產(chǎn)生影響，并在HBV感染相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[12]。

目前，關(guān)于miRNA調(diào)節(jié)HBV復(fù)制和表達(dá)的研究越來越多，有研究表明，一些miRNA能夠抑制HBV復(fù)制，從而阻礙疾病進(jìn)展，例如，miR-130a可以通過靶向兩種宿主因子——過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和PPARγ共激活因子-1α的表達(dá)來抑制HBV復(fù)制和表達(dá)[13]；miR-98-5p通過靶向核因子-κB誘導(dǎo)激酶抑制HBV的復(fù)制與分泌，從而抑制HBV感染相關(guān)肝細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[14]；在HBV感染相關(guān)肝細(xì)胞癌的細(xì)胞和組織中miR-1271-5p表達(dá)均下調(diào)，過表達(dá)miR-1271-5p可通過靶向抑制水通道蛋白5來阻斷HBV復(fù)制以及其誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌進(jìn)展[15]。miR-122作為一種在肝臟中高表達(dá)的miRNA，其不僅在控制肝細(xì)胞生長和腫瘤轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，還參與調(diào)節(jié)代謝、肝硬化的發(fā)生與發(fā)展等[16-17]。關(guān)于miR-122在HBV感染后的表達(dá)與作用已有報道，miR-122在HBV感染相關(guān)肝細(xì)胞癌患者及HBV轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞系Huh7中表達(dá)明顯降低，miR-122能夠與HBV的pgRNA雙順反子mRNA的高度保守區(qū)域結(jié)合，阻止編碼HBV聚合酶和HBc，進(jìn)而抑制HBV表達(dá)和復(fù)制[18]；還有研究證實，miR-122通過間接調(diào)控靶基因或有關(guān)機(jī)制來影響HBV復(fù)制，例如增加人肝癌細(xì)胞系Huh7中miR-122的水平可通過介導(dǎo)p53信號通路來降低HBV RNA和DNA的表達(dá)[19]。但目前關(guān)于miR-122在體內(nèi)HBV感染后的作用機(jī)制相關(guān)研究相對較少，體內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制更加復(fù)雜，而動物實驗的有效結(jié)果是進(jìn)行臨床研究的支撐條件之一，鑒于此，本研究通過構(gòu)建 HBV感染小鼠模型，經(jīng)體內(nèi)注射miR-122并觀察模型小鼠HBV復(fù)制變化，結(jié)果顯示，miR-122能夠降低HBV感染小鼠血清HBsAg與HBeAg水平，下調(diào)血清HBV-DNA的表達(dá)，并抑制小鼠肝組織內(nèi)HBcAg的表達(dá)。HBsAg、HBeAg及HBcAg是評價HBV感染情況的常用標(biāo)志物，降低這些指標(biāo)水平是延緩 HBV感染相關(guān)疾病進(jìn)展的重要措施。HBsAg和HBeAg是HBV基因組編碼的兩種主要抗原，這兩種抗原存在不僅會導(dǎo)致免疫耐受，還會導(dǎo)致肝細(xì)胞癌發(fā)病率升高[20]。

HBV在體內(nèi)不斷復(fù)制可通過異常免疫攻擊介導(dǎo)肝臟炎癥反應(yīng)，使ALT和AST水平升高，影響肝功能，甚至導(dǎo)致肝衰竭[21]。本研究結(jié)果顯示，miR-122能夠降低HBV感染小鼠血清AST和ALT水平，減輕肝組織病理損傷與纖維化，提示miR-122對HBV感染小鼠的肝組織具有保護(hù)作用。此外，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，miR-122降低了HBV感染小鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-2及IL-6的水平。現(xiàn)已知HBV感染可誘導(dǎo)機(jī)體免疫失衡，使免疫細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子發(fā)生改變，從而參與HBV感染期間的肝臟炎癥反應(yīng)，最終促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展。炎癥因子TNF-α、干擾素-γ、IL-2、IL-6和IL-12等的釋放可促進(jìn)細(xì)胞間的相互作用，加重炎癥反應(yīng)[22]，因此，如何抑制炎癥因子的釋放以維持免疫平衡也是HBV感染相關(guān)疾病治療的關(guān)鍵步驟。由此推測，miR-122能夠調(diào)控HBV感染小鼠后炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)。

綜上所述，在HBV感染小鼠中，miR-122能夠明顯抑制HBV-DNA在體內(nèi)的復(fù)制與表達(dá)，并抑制炎癥因子的釋放，減輕肝組織損傷與纖維化，發(fā)揮良好的肝臟保護(hù)作用，該發(fā)現(xiàn)為HBV感染治療提供了新思路。但本研究未對miR-122作用的分子靶點及詳細(xì)機(jī)制進(jìn)行深入研究，后續(xù)將進(jìn)一步探究。