三峽消落帶落羽杉莖段外植體擴(kuò)繁技術(shù)研究

陳雪梅，陳春樺，楊治華，袁中勛，陳張婷，李昌曉

1. 西南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 重慶 400715；2. 重慶市北碚區(qū)王樸中學(xué)校， 重慶 400717

三峽工程完全建成后， 在“冬蓄夏排”的水位調(diào)度方式下， 形成了垂直落差達(dá)30 m的消落帶． 庫區(qū)消落帶原有的植物因受到長(zhǎng)時(shí)間反季節(jié)水淹而大量消亡， 進(jìn)而導(dǎo)致消落帶生物多樣性降低， 水土流失加劇， 生態(tài)屏障功能減退． 研究表明人工植被修復(fù)與重建是恢復(fù)消落帶植被的有效方法． 落羽杉Taxodiumdistichum(L.) Rich.耐水淹能力強(qiáng)， 在三峽消落帶的生長(zhǎng)表現(xiàn)良好， 是消落帶植被修復(fù)重建的首選樹種之一[1-4]， 目前已被廣泛用于消落帶植被修復(fù)重建項(xiàng)目中． 然而， 當(dāng)前用于消落帶植被修復(fù)重建的落羽杉苗木基本上來自省外采購， 病蟲害發(fā)生率較高， 苗木質(zhì)量參次不齊， 一級(jí)苗占比較低， 運(yùn)輸、 栽植及管護(hù)成本居高不下． 落羽杉為杉科(Taxodiaceae)落羽杉屬(TaxodiumRich.)落葉性大喬木， 樹干通直， 基部常較粗大， 原產(chǎn)地位于北美， 現(xiàn)已廣泛引種到世界各地[5]． 落羽杉的種子繁殖實(shí)驗(yàn)表明， 因種皮太厚且種子具有明顯銳利的棱脊， 發(fā)芽率低， 利用種子大規(guī)模繁殖較為困難[6]． 與此同時(shí)， 落羽杉的扦插繁殖也存在插穗數(shù)量受限、 時(shí)間耗費(fèi)較長(zhǎng)、 成本較高、 采條部位對(duì)插苗的性狀表現(xiàn)影響較大等諸多問題[7]． 因此， 組織培養(yǎng)已經(jīng)成為落羽杉種苗擴(kuò)繁的重要途徑． 如果將長(zhǎng)期處于三峽庫區(qū)消落帶水淹—落干—水淹—落干逆境條件且已完全適應(yīng)的落羽杉人工林作為組培外植體， 無疑將會(huì)明顯加快所需落羽杉種苗的繁育速度并提高繁育成效． 組織培養(yǎng)繁殖速度快、 不受季節(jié)限制、 能保存母本的全部?jī)?yōu)良性狀[8-12]． 在組織培養(yǎng)時(shí)， 對(duì)于不同物種外植體的選取不盡相同[13-14]， 通常用于組織培養(yǎng)的外植體主要有胚軸、 葉片、 葉柄、 莖段等． 目前落羽杉的組織培養(yǎng)多采用種子成熟胚或幼苗為外植體[15-16]， 這對(duì)于三峽庫區(qū)消落帶而言， 這些外植體來源受到明顯的限制(種子及幼苗極少)． 相反， 如果以三峽庫區(qū)消落帶現(xiàn)有長(zhǎng)勢(shì)良好的落羽杉莖段為外植體來源， 則可以獲得大量來自于消落帶原位生境的組培材料， 進(jìn)而為三峽庫區(qū)消落帶提供大量落羽杉良種壯苗， 為三峽庫區(qū)消落帶生態(tài)修復(fù)與重建所需種苗做出切實(shí)貢獻(xiàn)． 當(dāng)前， 有關(guān)以三峽庫區(qū)消落帶現(xiàn)有適生的落羽杉莖段為外植體來源進(jìn)行組培的研究還未見報(bào)道． 因此， 本文以生長(zhǎng)于三峽庫區(qū)消落帶原位的10年生落羽杉優(yōu)株為試驗(yàn)材料， 選取落羽杉莖段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)， 探索三峽庫區(qū)消落帶落羽杉外植體的最佳組培實(shí)踐技術(shù)， 以期為三峽庫區(qū)消落帶原位生長(zhǎng)的落羽杉優(yōu)株快速擴(kuò)繁提供技術(shù)支撐．

1 材料與方法

1.1 外植體類型的篩選

試驗(yàn)材料選自三峽庫區(qū)重慶市忠縣石寶鎮(zhèn)汝溪河消落帶落羽杉人工林． 在165～175 m海拔之間選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的10年生落羽杉隨機(jī)剪取樹冠中部的當(dāng)年生未木質(zhì)化枝條、 半木質(zhì)化枝條， 長(zhǎng)約15 cm， 及時(shí)噴水保濕， 24 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室處理． 剪去針狀葉片， 用洗衣粉清洗3遍， 置于水龍頭下沖洗2 h． 用75%的乙醇漂洗30 s， 無菌水沖洗3次， 再用0.1% HgCl2消毒3 min， 無菌水沖洗3～5次， 切割成2～3 cm的莖段， 接種到MS培養(yǎng)基上． 本試驗(yàn)隨機(jī)設(shè)置3個(gè)重復(fù)小區(qū)， 每個(gè)小區(qū)接種外植體70個(gè)， 每個(gè)處理共接種外植體210個(gè)， 培養(yǎng)15 d后觀察統(tǒng)計(jì)外植體的存活率和污染率．

1.2 外植體部位的篩選

根據(jù)1.1試驗(yàn)結(jié)果， 選取最佳外植體類型， 消毒方法同1.1， 將其切割分為上、 中、 下3部分， 分別接種到MS培養(yǎng)基上． 隨機(jī)設(shè)置3個(gè)重復(fù)小區(qū)， 每個(gè)小區(qū)接種外植體16個(gè)， 每個(gè)處理共接種外植體48個(gè)， 培養(yǎng)15 d后觀察統(tǒng)計(jì)外植體的存活率和污染率．

1.3 表面消毒劑和消毒時(shí)間的篩選

根據(jù)1.2試驗(yàn)結(jié)果， 選取明確的最佳外植體部位， 在無菌條件下， 先用75%的乙醇消毒不同時(shí)間(10 s， 20 s， 30 s， 40 s)， 無菌水沖洗3次后接種到MS培養(yǎng)基中． 選擇乙醇的最佳消毒時(shí)間進(jìn)行第1次消毒后分別用2% NaCIO， 5% NaCIO， 0.1% HgCl2消毒不同時(shí)間(1 min，1.5 min，2 min，2.5 min，3 min)， 無菌水沖洗3～5次． 切割成2～3 cm長(zhǎng)的莖段， 接種于MS培養(yǎng)基中． 隨機(jī)設(shè)置3個(gè)重復(fù)小區(qū)， 每個(gè)小區(qū)接種外植體8個(gè)， 每個(gè)處理共接種24個(gè)外植體， 培養(yǎng)15 d后觀察統(tǒng)計(jì)外植體的存活率和污染率．

1.4 抑菌劑的篩選

選取1.2試驗(yàn)結(jié)果中最佳外植體部位， 選取1.3中明確的最佳消毒方法， 培養(yǎng)基中分別加入PPM(0.1%， 0.2%， 0.4%)和益培靈(0.05 g/L， 0.1 g/L， 0.2 g/L)， 隨機(jī)設(shè)置3個(gè)重復(fù)小區(qū)， 每個(gè)小區(qū)接種外植體8個(gè)， 每個(gè)處理共接種24個(gè)外植體， 培養(yǎng)25 d后觀察統(tǒng)計(jì)外植體的存活率和污染率．

1.5 落羽杉莖段腋芽的誘導(dǎo)

選取1.2試驗(yàn)結(jié)果中最佳外植體部位， 選取1.3中明確的最佳消毒方法， 之后切成2～3 cm的莖段， 培養(yǎng)基中加入0.2% PPM， 接種到以下含不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中： MS+激動(dòng)素(KT)(0.5 mg/L， 1 mg/L， 2 mg/L)+萘乙酸(NAA)(0.1 mg/L， 0.2 mg/L， 0.4 mg/L)． 隨機(jī)設(shè)置3個(gè)重復(fù)小區(qū)， 每個(gè)小區(qū)接種外植體8個(gè)， 每個(gè)處理共接種24個(gè)外植體， 培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)腋芽的誘導(dǎo)率、 繁殖系數(shù)和生長(zhǎng)狀況．

1.6 落羽杉叢芽誘導(dǎo)

誘導(dǎo)出的莖段腋芽約長(zhǎng)至2 cm時(shí)， 接種到以下含不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中， DCR+6-芐氨基嘌呤(6-BA)(0.5 mg/L， 1 mg/L)+吲哚丁酸(IBA)(0.2 mg/L， 0.4 mg/L， 0.6 mg/L)；1/2 MS+6-BA(0.5 mg/L， 1 mg/L)+IBA(0.2 mg/L， 0.4 mg/L， 0.6 mg/L)， 均去除細(xì)胞分裂素濃度低于生長(zhǎng)素濃度的組合． 隨機(jī)設(shè)置3個(gè)重復(fù)小區(qū)， 每個(gè)小區(qū)接種外植體4個(gè)， 每個(gè)處理共接種12個(gè)外植體， 培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)叢芽的誘導(dǎo)率、 繁殖系數(shù)和生長(zhǎng)狀況．

1.7 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基含蔗糖30 g/L， 瓊脂6.5 g/L， pH值為5.8． 培養(yǎng)溫度為(25±1)℃， 光照強(qiáng)度為30 μmol/(m2·s)， 光照時(shí)間12 h/d．

1.8 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2010和SPSS 22.0 軟件對(duì)測(cè)定的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理， 采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差(One-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析． 單因素方差分析采用Duncan多重比較(Duncan’s multiple range test)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)， 顯著性水平設(shè)為α=0.05． 所有圖像均用Origin 9.0(Origin lab Corporation)軟件制圖．

2 結(jié)果

2.1 落羽杉外植體類型的篩選

從表1可以看出， 未木質(zhì)化莖段的存活率和污染率與半木質(zhì)化莖段差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義． 半木質(zhì)化莖段的污染率達(dá)到了71.24%， 而未木質(zhì)化莖段的污染率卻只有21.91%， 提高了2.25倍． 試驗(yàn)觀察記錄也發(fā)現(xiàn)， 半木質(zhì)化莖段絕大部分長(zhǎng)菌， 未木質(zhì)化莖段長(zhǎng)菌較少． 與此同時(shí)， 半木質(zhì)化莖段的存活率只有19.05%， 與未木質(zhì)化莖段的存活率達(dá)到60%相比， 降低了2.15倍． 因此， 以存活率和污染率綜合評(píng)判， 未木質(zhì)化莖段為最佳的外植體類型．

表1 不同外植體類型的污染率和成活率

2.2 外植體部位的篩選

將外植體切割成上、 中、 下3部分之后， 分別接種于培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)15 d后觀察統(tǒng)計(jì)外植體的存活率和污染率． 對(duì)存活率和污染率方差分析結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)(表2)， 3個(gè)部位莖段的存活率相互之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；盡管中部莖段的存活率最高且達(dá)到41.67%， 但與上部和下部莖段的存活率相差不大． 相反， 下部莖段的污染率和上部、 中部莖段相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 下部莖段污染率為50.00%， 達(dá)到最高， 顯著高出中部0.33倍， 高出上部0.85倍． 因此， 基于存活率和污染率進(jìn)行綜合判定， 莖段中部為外植體最佳選取部位．

表2 外植體不同部位處理的存活率和污染率

2.3 表面消毒劑和消毒時(shí)間的篩選

經(jīng)消毒處理的外植體在培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d后， 其存活率和污染率情況分別見表3和表4． 結(jié)果表明， 不同種類及濃度的消毒劑對(duì)外植體的污染率和存活率影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義． 由表3可知， 用75%乙醇溶液漂洗30 s時(shí)存活率最高(29.17%)， 漂洗10 s， 20 s時(shí)外植體全部長(zhǎng)菌污染死亡． 用75%乙醇溶液漂洗40 s時(shí)污染率最低(37.50%)， 但其存活率較30 s時(shí)有所下降． 由表4可知， 當(dāng)用2% NaCIO消毒1 min， 1.5 min， 在第5d， 6 d時(shí)外植體就會(huì)全部長(zhǎng)菌． 消毒時(shí)間延長(zhǎng)至3 min時(shí)， 污染率依舊達(dá)到83.33%． 增加NaCIO的濃度到5%后， 在相同的消毒時(shí)間內(nèi)， 隨著NaCIO濃度的升高消毒效果明顯增強(qiáng)， 消毒時(shí)間為3 min時(shí)效果最好， 污染率降到41.67%， 存活率也提高到45.83%． 用0.1% HgCI2漂洗1 min時(shí)外植體全部長(zhǎng)菌， 隨著HgCI2消毒時(shí)間的延長(zhǎng)， 污染率逐漸降低， 漂洗3 min時(shí)是所有消毒處理中效果最好的， 污染率降至33.33%． 綜上所述， 在本試驗(yàn)中， 先用75%乙醇漂洗30 s， 再用0.1% HgCI2消毒3 min是落羽杉莖段消毒的最佳處理方法．

表3 乙醇消毒時(shí)間對(duì)外植體消毒效果的影響

表4 消毒試劑次氯酸鈉(NaCIO)與氯化汞(HgCI2)在不同消毒時(shí)間條件下對(duì)外植體消毒效果的影響

2.4 抑菌劑對(duì)外植體存活率和污染率的影響

將消毒過后的外植體接種至加入了抑菌劑的培養(yǎng)基中， 結(jié)果表明， 加入抑菌劑組和對(duì)照組(CK)相比存活率、 污染率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表5)． 與對(duì)照組相比， 加入抑菌劑后的處理組污染率顯著降低， 其中0.2% PPM組污染率最低， 只有16.67%． 盡管加入0.2 g/L益培靈處理組污染率最高， 達(dá)到33.33%， 但仍然顯著低于對(duì)照組． 相應(yīng)地， 各處理組存活率與對(duì)照組相比顯著提高， 存活率提高最大的是培養(yǎng)基中加入0.2% PPM處理組， 其存活率達(dá)到75.00%， 高出對(duì)照組1.25倍；即使是存活率提高最低的0.05 g/L益培靈處理組， 存活率也達(dá)到了50.00%， 高出對(duì)照組0.5倍．

表5 不同抑菌劑對(duì)外植體存活率和污染率的影響

2.5 落羽杉莖段腋芽的誘導(dǎo)

將消毒過后的外植體接種到腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中， 結(jié)果表明， 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度組合顯著影響莖段腋芽的誘導(dǎo)(表6)． 由表6可知， 與不加激素(圖1a)相比， 單一激素也能誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)， 并隨著NAA濃度的升高萌發(fā)率也升高， MS+0.4 mg/L NAA處理組的萌發(fā)率達(dá)到25.00%． 混合激素對(duì)腋芽萌發(fā)的效果更好， 當(dāng)KT濃度為0.5 mg/L時(shí)， 隨著NAA濃度的升高， 腋芽萌發(fā)率和繁殖系數(shù)均升高， 萌發(fā)率最高達(dá)到66.67%(圖1b)， 繁殖系數(shù)達(dá)1.50倍． 當(dāng)KT濃度為2 mg/L時(shí)， 隨著NAA濃度的升高， 腋芽萌發(fā)率和繁殖系數(shù)均下降， 萌發(fā)率最高為33.50%， 繁殖系數(shù)最高為1.00倍． 當(dāng)NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)， 隨著KT濃度的升高， 萌發(fā)率和繁殖系數(shù)呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)， 當(dāng)NAA濃度為0.2 mg/L和0.4 mg/L時(shí)， 萌發(fā)率和繁殖系數(shù)均隨著KT濃度的升高呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)． 在本次試驗(yàn)中， 從繁殖系數(shù)和萌發(fā)率來看， 最適合落羽杉腋芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為A6， 即MS+0.5 mg/L KT+0.4 mg/L NAA， 且腋芽生長(zhǎng)較快， 其次為A5．

表6 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)落羽杉莖段腋芽的誘導(dǎo)

圖1 落羽杉莖段腋芽誘導(dǎo)

2.6 落羽杉叢芽誘導(dǎo)

以落羽杉腋芽(無菌苗)為外植體接種到設(shè)定的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)， 結(jié)果表明， 不同基本培養(yǎng)基和不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類、 濃度組合顯著影響落羽杉叢芽的誘導(dǎo)(表7， 圖2)． 比較B1-B6可知， 除B5外， 加入激素的處理組叢芽誘導(dǎo)率和繁殖系數(shù)均比不加激素的高；當(dāng)6-BA濃度一定時(shí)， 叢芽的誘導(dǎo)率和繁殖系數(shù)隨著IBA濃度的升高而降低；當(dāng)IBA濃度一定時(shí)， 6-BA濃度越高誘導(dǎo)率和繁殖系數(shù)越低， 誘導(dǎo)率最高達(dá)75.00%， 繁殖系數(shù)最高為2.25倍． 比較B7-B12可知， 當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L時(shí)， 隨著IBA濃度的升高， 誘導(dǎo)率和繁殖系數(shù)也升高． 當(dāng)6-BA濃度為1 mg/L時(shí)， 隨著IBA濃度的升高， 誘導(dǎo)率和繁殖系數(shù)先升高后降低． 當(dāng)IBA濃度一定時(shí)， 誘導(dǎo)率和繁殖系數(shù)均隨著6-BA濃度的升高而降低． 誘導(dǎo)率最高為83.33%， 繁殖系數(shù)最高為2.58倍． 綜合繁殖系數(shù)、 叢芽誘導(dǎo)率、 單芽總數(shù)等指標(biāo)， 腋芽叢芽在B8培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率和繁殖系數(shù)最高， 顯著高出其他處理組， 而且B8的叢芽長(zhǎng)勢(shì)和生長(zhǎng)狀態(tài)相較更好， 因此腋芽叢芽誘導(dǎo)最佳的培養(yǎng)基為B8， 即1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L IBA， 其次為B1和B3．

表7 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)叢芽誘導(dǎo)的影響

圖2 叢芽誘導(dǎo)

3 討論

3.1 落羽杉莖段外植體的初代培養(yǎng)

試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)， 與大多數(shù)植物一樣， 在落羽杉組織培養(yǎng)過程中， 外植體污染是普遍遇到的難題， 若外植體材料污染的問題無法得到有效解決， 則將十分影響后續(xù)階段培養(yǎng)步驟的進(jìn)行[17-18]． 所以科學(xué)合理的消毒滅菌步驟顯得尤為重要． 獲取外植體的環(huán)境條件、 取材部位、 取材時(shí)間以及接種時(shí)操作是否規(guī)范都會(huì)對(duì)外植體的帶菌情況造成影響， 尤其是長(zhǎng)期生長(zhǎng)在室外環(huán)境條件下的植物自身易攜帶大量的細(xì)菌微生物， 表面消毒時(shí)化學(xué)消毒劑很難將其徹底殺死[19-20]． 目前許多外植體消毒都是用單一的消毒劑進(jìn)行消毒， 不能達(dá)到良好的效果． 組織培養(yǎng)常用的消毒劑有乙醇、 次氯酸鹽、 HgCl2、 過氧化氫等． 75%的乙醇具有一定的殺菌力， 而且具有濕潤(rùn)作用， 可排除掉植物材料上的空氣， 利于與其他消毒劑配合使用[21]． 次氯酸通過侵入細(xì)胞內(nèi)與蛋白質(zhì)發(fā)生氧化作用或破壞其磷酸脫氫酶， 使糖代謝失調(diào)而致細(xì)胞死亡；HgCl2中的Hg2+可與帶負(fù)電的細(xì)菌蛋白質(zhì)結(jié)合， 使蛋白變性， 酶蛋白失活， 進(jìn)而使細(xì)胞致死[22]． 本試驗(yàn)采用了乙醇與HgCl2和NaCIO聯(lián)合消毒的方式， 大大提高了消毒的效果． 試驗(yàn)結(jié)果顯示， 2%的NaCIO滅菌效果差， 增大濃度到5%之后隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)， 污染率出現(xiàn)明顯的降低， 但在相同的消毒時(shí)間內(nèi)效果不如0.1% HgCl2， 這與茶條槭(Acerginnala)外植體消毒效果相似[23]． 這極有可能是因?yàn)镹aCIO滅菌作用較溫和且容易去除， 配置后穩(wěn)定性較差， 容易分解． 在試驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)， 雖然采取聯(lián)合消毒的方式對(duì)外植體進(jìn)行消毒的效果更好， 但總體的污染率還是很高， 部分外植體在接種1個(gè)月后有腋芽萌動(dòng)時(shí)還會(huì)出現(xiàn)污染， 給后續(xù)試驗(yàn)帶來很大程度的干擾． 因此， 在初代培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基中有必要加入一定濃度的植物抗菌劑來抑制外植體攜帶的各種微生物污染． 植物抑菌劑可以有效抵制酶催化作用， 影響菌體細(xì)胞壁的合成， 最終導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)受阻[24]． 加入抑菌劑后， 外植體污染率大大降低， 這與辣木(MoringaoleiferaLam.)結(jié)果相似[25]． 本次試驗(yàn)中雖然提高了NaCIO的濃度， 但是沒有延長(zhǎng)消毒時(shí)間， 在接下來的試驗(yàn)中我們將考慮延長(zhǎng)NaCIO消毒的時(shí)間， 觀察其滅菌效果．

3.2 落羽杉莖段腋芽的誘導(dǎo)

通過腋芽增殖和間接器官發(fā)生的方法建立腋芽增殖體系， 能否成功誘導(dǎo)出腋芽是其中關(guān)鍵的一步[26]． 在落羽杉莖段腋芽誘導(dǎo)階段一般采用細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素相結(jié)合的辦法． 落羽杉屬常用的激素有6-BA， NAA， KT， ZT等[16， 27]． 在墨西哥落羽杉組織培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)其對(duì)6-BA的濃度變化較為敏感， 濃度達(dá)到1～2 mg/L就會(huì)出現(xiàn)誘導(dǎo)率降低， 甚至出現(xiàn)玻璃化、 白化芽的現(xiàn)象[28]． 激動(dòng)素(Kinetin)是一種非天然的細(xì)胞分裂素， 它可以促進(jìn)細(xì)胞分化、 分裂、 生長(zhǎng)， 誘導(dǎo)組織長(zhǎng)芽， 解除頂端優(yōu)勢(shì)． 它的活性比腺嘌呤更高， 一般用來促進(jìn)生芽[29]． NAA是生長(zhǎng)素的一種， 通過在植物體內(nèi)促進(jìn)一系列的合成反應(yīng)， 進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)含量的上升， 蛋白質(zhì)的積累有益于促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)器官縱向生長(zhǎng)[30]． KT與NAA的組合在落羽杉腋芽萌發(fā)過程中誘導(dǎo)率最高達(dá)66.67%， 幾乎未出現(xiàn)玻璃化， 每個(gè)莖段產(chǎn)生腋芽數(shù)2～5個(gè)， 且在適宜的濃度下腋芽生長(zhǎng)速度較快， 30 d左右腋芽能長(zhǎng)至1～1.5 cm， 顏色嫩綠， 長(zhǎng)勢(shì)良好． 試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)在低濃度的NAA中， 容易出現(xiàn)膨大的芽， 這與百合(LiliumL.)試管鱗莖結(jié)果相似[31]， 膨大的芽簇生在一起長(zhǎng)勢(shì)較慢．

3.3 叢芽誘導(dǎo)與褐化

針葉樹種離體快繁在增殖誘導(dǎo)階段時(shí)， 通常使用6-BA與IBA或6-BA與NAA的組合來誘導(dǎo)不定芽[32]． 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的混合使用效果遠(yuǎn)優(yōu)于單一激素[33-34]． 在這個(gè)階段采用0.5 mg/L 6-BA和0.4 mg/L IBA組合叢芽誘導(dǎo)率最高， 這與墨西哥落羽杉幼苗為起始外植體的組培結(jié)果相似[28]． 在試驗(yàn)過程中我們發(fā)現(xiàn)， 落羽杉莖段組培芽在添加激素的條件下進(jìn)行增殖培養(yǎng)30 d后會(huì)有叢芽產(chǎn)生， 多數(shù)單芽萌發(fā)多個(gè)叢芽， 但不添加激素時(shí)幾乎沒有叢芽產(chǎn)生． 落羽杉莖段組培芽培養(yǎng)30 d后， 部分芽苗葉緣慢慢發(fā)黃， 最終整個(gè)外植體枯黃死亡． 究其原因可能是木本植物本身含有較多的酚類物質(zhì)， 將腋芽切割下來用于叢芽誘導(dǎo)時(shí)， 外植體細(xì)胞受到破壞， 細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶、 多酚氧化酶等酶釋放或合成， 在合適的pH值、 溫度、 光照等條件下， 與細(xì)胞液泡里的酚類物質(zhì)發(fā)生酶促氧化反應(yīng)， 形成有毒的棕褐色醌類物質(zhì)， 從而使組織發(fā)生褐變[35-36]． 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)， 醌類物質(zhì)逐漸積累， 最終導(dǎo)致整個(gè)外植體死亡． 在本試驗(yàn)中， 通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度的吸附劑AC[37-38]， 褐化程度有一定的緩解， 但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)， 最終芽苗還是會(huì)枯黃死亡， 對(duì)于這個(gè)現(xiàn)象的解決辦法還有待進(jìn)一步的研究．

4 結(jié)論

本研究運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)獲得了一定數(shù)量的無菌外植體， 再通過腋芽誘導(dǎo)和叢芽誘導(dǎo)擴(kuò)繁獲得了無菌苗． 結(jié)果表明， 在落羽杉組培初代培養(yǎng)階段外植體的存活率和污染率受外植體類型、 外植體部位、 消毒劑的種類、 消毒劑作用時(shí)間等多個(gè)因素的影響， 選擇最佳的外植體以及消毒方式對(duì)之后的培養(yǎng)過程至關(guān)重要． 在本試驗(yàn)中采用乙醇與HgCl2和NaClO聯(lián)合消毒并加入植物抑菌劑的方法， 顯著提高了消毒的效果． 在腋芽誘導(dǎo)和叢芽誘導(dǎo)階段， 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑以及濃度均顯著影響其誘導(dǎo)率．