一種快捷精準(zhǔn)的組織芯片制作方法

徐龍寬，鐘新梅，王文麗，伍愛華，韋 輝，李運千，莫長順，周英瓊，王緒明

組織芯片是將大量生物組織樣本按預(yù)先設(shè)計的陣列圖排列在同一蠟塊上形成矩陣的微縮組織塊[1]。組織芯片技術(shù)的建立實現(xiàn)了在一次實驗中對大量樣本進行平行研究，減少實驗誤差的同時，節(jié)省了試劑和時間，隨著該項技術(shù)的不斷發(fā)展，被廣泛運用到免疫組化、原位雜交和熒光原位雜交等實驗中。目前市場上的組織芯片成品價格昂貴，已有文獻介紹組織芯片技術(shù)的制作及應(yīng)用，但存在制作過程較復(fù)雜和位點較少等不足[2-10]。本文現(xiàn)介紹一種操作簡單、經(jīng)濟實用的組織芯片制作技術(shù)，通過電腦設(shè)計微陣列網(wǎng)格紙，用包埋機制作空白受體蠟塊，成型后用電磨筆打孔，最后用手持組織芯片槍獲取供體組織芯片柱，制作組織芯片。

1 材料與方法

1.1 材料收集2021年8月桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科經(jīng)病理檢查的正常扁桃體、胎盤和肝臟組織，包埋成供體蠟塊。

1.2 主要耗材及儀器優(yōu)質(zhì)包埋石蠟(熔點57～60 ℃，廣州維格斯公司)，手動組織芯片取樣槍(型號1026，廣州潔利公司)，手持微型電磨筆(琨匠voltage，3.7v，上海欽同公司)，組織包埋機(Thermo Histostor)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9070A，上海精宏公司)，高速黑白激光打印機(brotherHL-2140)，切片機(Leica RM2235)，常規(guī)不銹鋼包埋底模(規(guī)格：37 mm×24 mm×9 mm，江蘇世泰公司)，黏附載玻片(海門曙光器材廠)，普通A4紙。

1.3 方法

1.3.1制作工具 電磨筆配套直徑1.0、1.5、2.0 mm的麻花鉆頭，用于受體蠟塊的打孔(圖1)，手動組織芯片取樣槍配套直徑1.0、1.5、2.0 mm的槍頭，用于供體蠟塊的取樣及組織芯在受體蠟塊的植入(圖1)。

圖1 制作工具：A.手持微型電磨筆；B.電磨筆對應(yīng)麻花鉆頭；C.取樣槍配套對應(yīng)的槍頭；D.手動組織芯片取樣槍 圖2 自制7×11位點、8×13位點和10×16位點正方格網(wǎng)格紙及日常使用的不銹鋼底模 圖3 打孔前(上圖)及打孔后(下圖)的蠟?zāi)?圖4 8×13位點組織芯片HE染色低倍鏡(左圖)和高倍鏡(右圖)圖片 圖5 8×13位點組織芯片Hep Par-1蛋白免疫組化染色低倍鏡(左)和高倍鏡(右)圖片 圖6 8×13位點組織芯片Ki-67蛋白免疫組化染色低倍鏡(左)和高倍鏡(右)圖片

1.3.2受體蠟塊的制作 (1)在Microsoft Word 2007中插入表格，選擇表格屬性，在表格-選項-默認(rèn)單元格邊距中將上下左右均設(shè)置為0；行指定高度選擇固定值，列指定寬度，行和列的數(shù)值均比芯片孔徑大1 mm，如1.0 mm孔徑組織芯片，表格的行和列均設(shè)為2 mm；A4紙打印正方格網(wǎng)格紙，裁好后備用。采用上述方法可設(shè)計160(10×16)位點、104(8×13)位點及77(7×11)位點3種不同規(guī)格大小的微陣列，分別應(yīng)用于1.0、1.5、2.0 mm的組織。(2)裁剪好的網(wǎng)格紙置于包埋底模底部包埋成型后備用(圖2)。(3)用電磨筆配套相應(yīng)孔徑的麻花鉆頭垂直于受體蠟塊對應(yīng)網(wǎng)格打孔。(4)去掉網(wǎng)格紙，用切片機按10 μm厚度粗修受體蠟塊至平整(圖3)。

1.3.3供體蠟塊的處理 (1)用切片機粗修(5 μm)供體組織蠟塊，暴露組織至需要區(qū)域。(2)粗修后組織蠟塊置于37 ℃烘箱中預(yù)熱30 min軟化[4]，避免打孔時因組織過硬出現(xiàn)裂痕。

1.3.4組織芯片的制作 (1)使用組織芯片取樣槍在處理好的供體蠟塊上取出需要的組織芯柱。(2)將組織芯柱植入對應(yīng)受體蠟塊孔位。(3)全部移入后用玻璃板壓平，盡量使組織在同一平面。(4)將組織芯片蠟塊放入底模，使包埋盒在上，組織芯在下，保證組織芯柱落在同一平面上，平整放入預(yù)熱到57 ℃的烘箱中加熱30 min，使組織芯與受體蠟塊融為一體。(5)關(guān)閉烘箱，打開烘箱門自然冷卻10 min后取出組織芯片蠟塊，置于包埋機冷凍臺冷卻10 min。(6)冷卻后迅速敲出組織芯片。(7)切片機上稍粗修(5 μm)至最大切面，組織芯片蠟塊即制作完成。

1.3.5切片 組織芯片蠟塊置于4 ℃冰箱中充分預(yù)冷4 h后用切片機切取白片[5]。將切片放入46 ℃溫水中充分展片，用黏附載玻片撈取切片，自然晾干后65 ℃烤片2 h待用。

1.3.6HE染色 組織芯片進行常規(guī)HE染色，顯微鏡下評估組織芯片的HE染色效果。

1.3.7免疫組化 組織芯片以Hep Par-1、Ki-67抗體染色，染色方法為羅氏Ventana全自動免疫組化染色步驟。

2 結(jié)果

2.1 組織芯片成功制備組織芯片蠟塊，組織芯柱與受體蠟塊結(jié)合緊密，位點排列整齊，無移位、變形、缺失，未見開裂及氣泡產(chǎn)生。

2.2 HE染色結(jié)果以104(8×13)位點為例，制作的組織芯片染色結(jié)果顯示，各位點組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及細胞結(jié)構(gòu)均清晰可辨(圖4)。

2.3 免疫表型以104(8×13)位點為例，組織芯片Hep Par-1(圖5)及Ki-67(圖6)免疫組化染色結(jié)果顯示，Hep Par-1蛋白表達定位于肝細胞胞質(zhì)，Ki-67蛋白表達定位于細胞核，其蛋白定位分布、染色強度及特異性與常規(guī)石蠟切片行免疫組化染色相符。

3 討論

組織芯片因其規(guī)模大、高通量、標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點，具備十分重要的科研價值，目前最為標(biāo)準(zhǔn)的制作方法為運用全自動組織芯片儀制作，但設(shè)備昂貴，成本較高導(dǎo)致難以普及，而手工制作方法種類較多，主要有需要受體蠟塊[3-5,7-9]和澆注式[2,6,10]兩大類。澆注式對操作者的操作水平要求較高，且芯片陣列易出現(xiàn)錯亂現(xiàn)象；而需要受體蠟塊的方法可通過購買商品化的受體蠟塊[4,7]或手工自制[3-5,8-9]，商品化受體蠟塊成本較高，需要二次增加固相支撐(包埋盒)的步驟，過程繁瑣且溫度較難掌控，常因受體蠟塊和組織芯柱融合不佳導(dǎo)致切片時出現(xiàn)開裂；手工自制的規(guī)格不統(tǒng)一，位點排列不規(guī)范，制作過程較繁瑣。本方法的優(yōu)點：(1)電腦設(shè)計排列位點靈活標(biāo)準(zhǔn)；(2)微陣列網(wǎng)格紙直接黏附于受體蠟塊，打孔位點排列整齊；(3)受體蠟塊和固相支撐一次成型，黏附牢固；(4)鉆頭和組織槍孔徑標(biāo)準(zhǔn)化且有不同規(guī)格可選擇；(5)成本較低；(6)實驗重復(fù)性好，操作簡單；(7)切片染色質(zhì)量較好，位點變形率、丟失率低。

為提高芯片制作的效率及質(zhì)量，總結(jié)幾點經(jīng)驗：(1)網(wǎng)格紙在包埋時要盡量貼近底部鋪平，防止包埋時因網(wǎng)格紙不平整導(dǎo)致受體蠟塊底部凹凸不平；(2)打孔時盡量垂直于網(wǎng)格紙，使各位點保持大小一致；(3)打孔后務(wù)必粗修受體蠟塊使各位點在同一平面，避免后期切片時位點缺失；(4)選擇供體蠟塊時盡量避免較薄的組織，以免引起位點缺失；(5)芯片柱和受體蠟塊融合時溫度過高、時間過長，石蠟完全液化易引起點陣亂序，而溫度過低時間過短則融合不充分影響切片，所以建議融合溫度為石蠟熔點的下限，即57 ℃，時間在30 min以內(nèi)，可以反復(fù)融合2～3次以達到理想狀態(tài)；(6)切片時先將蠟塊切至最大切面，4 ℃預(yù)冷30～60 min后直接切片避免再修片，可提高切片質(zhì)量。

本方法采用電腦軟件設(shè)計組織微陣列及電磨筆打孔，確保各點陣排列整齊，HE及免疫組化染色效果良好，取得滿意的效果，無論在制作技術(shù)還是制作成本上均具有明顯的優(yōu)勢，可在臨床工作及科學(xué)研究中廣泛開展。