液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析在臨床化學(xué)中的應(yīng)用

李蕊（北京醫(yī)藥職工大學(xué)（中國北京同仁堂（集團）有限責任公司黨校）,北京 100079）

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC/MS/MS）是一種具有極高準確度和精密度的分析技術(shù)，但在臨床實驗室的常規(guī)使用中仍存在許多挑戰(zhàn)和缺陷，如各種分析前因素的影響，以及由于基體效應(yīng)而引起的離子抑制和與穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)標相關(guān)的問題等。質(zhì)譜分析是目前典型的實驗室檢測方法。隨著液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜程序變得越來越自動化，越來越多與質(zhì)譜分析相關(guān)的體外診斷商業(yè)化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在實驗室醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用將顯著增加。

1 介紹

每年都有越來越多的高靈敏度、用戶體驗良好的新型質(zhì)譜儀被推出，質(zhì)譜儀的更新升級是與時俱進的。質(zhì)譜分析技術(shù)已成為基礎(chǔ)生物學(xué)研究和臨床醫(yī)學(xué)的重要技術(shù)。隨著質(zhì)譜分析相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展，比如：樣品制備方法、標記試劑、穩(wěn)定同位素標記試劑和肽合成技術(shù)等，直接導(dǎo)致了“蛋白質(zhì)組學(xué)”和“代謝組學(xué)”的快速發(fā)展。例如，最近有報道稱，BoxCar采集方法可以在100分鐘內(nèi)對10,000個蛋白質(zhì)進行單次蛋白質(zhì)組學(xué)分析[1]。近年來，先進的儀器不僅用于基礎(chǔ)研究，也用于專門的臨床應(yīng)用。在臨床應(yīng)用情況下，樣品制備和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜被集成到一個系統(tǒng)中。此外，先進的電離程序、操作系統(tǒng)、所需的試劑、校準器、質(zhì)量控制樣品和隨時可用的溶劑，現(xiàn)在都可以擁有?，F(xiàn)有的幾種電離方法，如解吸電噴霧電離（Desorption Electro Spray Ionization，DESI）[2]、探針電噴霧電離（Probe Electro Spray Ionization，PESI）[3]和快速蒸發(fā)電離質(zhì)譜（Rapid Evaporative Ionization Mass Spectrometry，REIMS）[4]已用于術(shù)中快速病理診斷和生物標本實時分析。隨著技術(shù)創(chuàng)新的發(fā)展，質(zhì)譜的臨床應(yīng)用將變得更加廣泛。

質(zhì)譜分析在各個領(lǐng)域都有應(yīng)用，包括新生兒先天代謝錯誤篩查、法醫(yī)毒理學(xué)和治療藥物監(jiān)測等。質(zhì)譜分析在實驗室醫(yī)學(xué)中最成功的應(yīng)用是使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)快速鑒定微生物。事實上，臨床診斷微生物學(xué)已經(jīng)發(fā)生了革命性的轉(zhuǎn)變[5]，該技術(shù)在全球范圍內(nèi)得到越來越多的應(yīng)用。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)對于血液培養(yǎng)標本中的細菌快速鑒定特別有用，與傳統(tǒng)方法相比，其分析時間可縮短1.5-2天，從而有助于縮短住院時間并改善總體預(yù)后。

相比之下，基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的常規(guī)臨床化學(xué)檢測方法應(yīng)用仍較緩慢，因此應(yīng)用只局限于大型醫(yī)療機構(gòu)和參考實驗室。許多挑戰(zhàn)和限制阻礙了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的廣泛使用。例如：與全自動免疫分析平臺相比，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜涉及復(fù)雜的操作流程，這方面就限制了其發(fā)展。

2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在臨床化學(xué)中的應(yīng)用現(xiàn)狀

目前，免疫分析在臨床實驗室被廣泛用于檢測蛋白質(zhì)、多肽和激素。然而，免疫分析方法有一些局限性和缺點：如依賴于抗體特異性。在許多情況下，抗體的特異性不夠，可能導(dǎo)致密切相關(guān)的化合物之間發(fā)生交叉反應(yīng)。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜就可以克服這一局限性，因此其在臨床化學(xué)中得到越來越多的應(yīng)用。質(zhì)譜應(yīng)用于臨床實驗的任務(wù)是加快質(zhì)譜在臨床實驗室的實施，目的是幫助改善患者的護理標準，并降低醫(yī)療保健成本。

3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在臨床應(yīng)用中的挑戰(zhàn)和缺陷

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜是一種高度精確的分析技術(shù)，在臨床化學(xué)中越來越多地使用，但它在臨床實驗室的常規(guī)使用中仍然存在一些挑戰(zhàn)和缺陷[6]，具體而言，各種分析前因素的影響、基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致的離子抑制、穩(wěn)定同位素標記內(nèi)部標準的相關(guān)問題、自動化和標準化的缺乏等。

3.1 分析前因素的影響 體外診斷儀器的質(zhì)素保證以多種方式進行。膽紅素、血紅蛋白和乳糜的干擾也要用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢查。當抗體的使用包括在樣品制備的第一步，如1α，25-二羥基維生素D的測量[7]，類風濕因子對分析物的特定抗體的影響必須排除?？贵w常用于靶向蛋白質(zhì)組學(xué)，以量化低豐度多肽。

目前臨床化學(xué)實驗室使用的采血管主要用于比色分析和免疫分析，不適合用于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜。因此，當使用這些試管進行基于質(zhì)譜的分析時，可能獲得的結(jié)果并不準確。

其次，靜脈穿刺和血清分離之間的時間間隔對血清肽譜有顯著影響。在血清生物標志物的探索中，考慮儲存溫度和儲存周期的影響是非常重要的。從事臨床質(zhì)譜分析的人員必須考慮到從樣品采集到分析的一系列操作對檢測結(jié)果有很大的影響。

3.2 樣品制備對降低基質(zhì)效應(yīng)的作用 在組分極其復(fù)雜的生物樣品中，為了準確測量目標分析物，需要適當?shù)臉悠分苽??！盎|(zhì)效應(yīng)”是指共洗脫物質(zhì)的存在對離子源區(qū)域內(nèi)分析物的聚簇和電離過程產(chǎn)生的整體影響[8]。一般來說，適當?shù)臉悠分苽浜蜕V分離可以緩解基質(zhì)效應(yīng)。此外，由于粗樣品直接注入設(shè)備，樣品制備不足不僅縮短了液相色譜柱的壽命，還增加了設(shè)備停機的風險?；|(zhì)效應(yīng)可以通過柱后用t片將目標分析液從高效液相色譜柱注入淋洗液來確認[9]。磷脂是影響基質(zhì)效應(yīng)最顯著的因素之一，其洗脫模式可以通過前驅(qū)體離子掃描在質(zhì)譜圖中184m/z處峰位來進行確定。通過對四種樣品制備方法：蛋白沉淀法（PP）、液-液萃取法（LLE）、固相萃取法（SPE）和支撐液萃取法（SLE）的比較，液相色譜分離使用了反相分配系統(tǒng)的色譜柱，該系統(tǒng)根據(jù)脂溶性分離分析物。在指定的洗脫時間，使用蛋白沉淀法和固相萃取法檢測到較強的離子抑制，而液-液萃取法的離子抑制最小。

固相萃取并不能有效地去除基質(zhì)效應(yīng)，這很可能是因為固相萃取柱和液相色譜柱采用了相同的反相分離模式。為了有效的前處理，固相萃取必須采用不同于液相色譜柱的分離模式，如離子交換和混合模式。固相萃取中，磷脂柱里通過填充氧化鋯二氧化硅涂層來有效地去除磷脂的影響[10]。液-液萃取的離子抑制最弱，因為它的分離是基于極性，而不是相反的相位分布模式。由于固液萃取與液-液萃取的分離模式相同，有效地消除了基質(zhì)效應(yīng)。然而，液-液萃取不適合大規(guī)模研究，因為這種技術(shù)不是自動化的。另一方面，固相萃取，固液萃取可以很容易地自動化。自動化樣品制備使取樣程序一致。最終，包括數(shù)據(jù)分析和接口的完全自動化將是進一步加快液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。

基質(zhì)效應(yīng)的程度因電離模式的不同而有不同程度的影響。離子抑制在電噴霧電離正極模式下表現(xiàn)較好，而在電噴霧電離、大氣壓化學(xué)電離和大氣壓光電離下表現(xiàn)較差。最近有報道稱，一種新的商用大氣壓電離源UniSprayTM（Waters，USA）與電噴霧電離相比，根據(jù)目標分析物的不同，略微降低了基質(zhì)效應(yīng)[11]。

3.3 穩(wěn)定同位素標記內(nèi)標物 內(nèi)標物是十分必要的，可以補償基質(zhì)效應(yīng)和糾正樣品制備步驟中潛在的變化。一般將2H、13C、15N和18O標記的化合物用作內(nèi)標物，雖然2H標記內(nèi)標物的洗脫時間比反相分離的目標分析物略快，但仍需要仔細注意磷脂和其他化合物引起的基質(zhì)效應(yīng)。另一方面，13C、15N和18O標記的內(nèi)標物可能比2H標記的內(nèi)標物更有用，因為它們的洗脫時間幾乎接近目標分析物。值得注意的是，1H-2H交換是否會發(fā)生，取決于標記的位置的不同，導(dǎo)致的內(nèi)標物響應(yīng)也不同[12]。因此，穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)標物在臨床質(zhì)譜分析中是不可或缺的，但2H標記的內(nèi)標物在大多數(shù)潛在的分析物中并不廣泛可用。

3.4 校準器和血清認證標準物質(zhì) 校準器作為原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為目標分析物濃度的參考，使用有缺陷的校準器會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果?！都~約時報》2009年1月7日的一篇文章震驚了LC/MS/MS協(xié)會：Quest（美國著名的私人醫(yī)學(xué)實驗室之一）的一位發(fā)言人承認，由于校準器的問題，一些錯誤的1α，25-二羥基維生素D結(jié)果已經(jīng)被報道出來。盡管人們普遍認為，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測量的實驗室間差異與免疫分析相比要小很多，但根據(jù)FDA在2016年5月舉行的研討會上由美國病理學(xué)家學(xué)院（CAP）提出的關(guān)于1α，25-二羥基維生素D的調(diào)查結(jié)果顯示，情況并不是這樣的。如果使用通用校準器，實驗室間的差異可能會得到改善[13]?？紤]到他們提交給國際質(zhì)量評估計劃的結(jié)果顯示實驗室間的一致性較差，卡特和瓊斯試圖說明使用一個共同的標準是否可以減少這種不一致性[14]。

雖然校準器的基質(zhì)與真實樣品的基質(zhì)相同是可取的，但當目標分析物是內(nèi)源性化合物時，這種方法就不太可取。在沒有真正空白的情況下，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜成功定量生物樣品中的內(nèi)源分析物是十分具有挑戰(zhàn)性的。一種方法是對血清樣品進行預(yù)處理，盡可能多地去除特定的內(nèi)源性分析物；另一種方法是使用2H標記化合物作為生成校準曲線的替代分析物。

牛血清白蛋白（BSA）溶液（4%-7%）常被用作基質(zhì)替代品，但BSA溶液中可能含有與目標分析物的結(jié)合蛋白，應(yīng)予以注意。1α，25-二羥基維生素D值偏差較大可能是牛血清白蛋白中維生素D結(jié)合蛋白污染物造成的[14]。市售重組人血清白蛋白（HSA）不含可檢測到的1α，25-二羥基維生素D，可以用作基質(zhì)。因此在檢測中重要的是，不僅要注意用于校準器的基質(zhì)類型，而且要注意標準材料本身的純度。

3.5 數(shù)據(jù)分析和儀表控制軟件 目前最新的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜平臺，可以定義峰檢測方法，設(shè)置允許自動峰檢測?，F(xiàn)有的質(zhì)譜儀器采用了幾種不同的峰檢測算法，但對于其有效性，需要檢查自動得到的結(jié)果與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜專家手動得到的結(jié)果是否一致。為了使液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜平臺更適用于常規(guī)臨床實驗室分析需要全面的自動化，包括自動樣品制備、復(fù)雜的數(shù)據(jù)審查軟件，以及與實驗室信息系統(tǒng)的數(shù)據(jù)平臺接口。質(zhì)譜分析平臺制造商使用了易于操作的分析物進行他們的標準性能測試，以確保儀器的功能。

4 總結(jié)

目前，質(zhì)譜分析大多是實驗室開發(fā)的，勞動密集，并需要相當多的具有專業(yè)知識的工作人員來進行方法開發(fā)和驗證。隨著液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜程序變得越來越自動化，越來越多與質(zhì)譜相關(guān)的體外診斷商業(yè)化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在實驗室醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用將顯著加快。