訶子湯炮制草烏血中移行成分差異研究

策力木格，許 良，松 林，圖 雅

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)1.蒙醫(yī)藥學(xué)院、2. 化學(xué)與材料學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；4.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥研發(fā)中心，北京 100700)

草烏為毛茛科烏頭屬植物北烏頭(AconitumkusnezoffiiReichb.)的干燥塊根，是中醫(yī)、蒙醫(yī)常用藥，其毒性極大，因此臨床用藥都先經(jīng)過炮制。蒙醫(yī)認為訶子可解草烏毒。多年以來，蒙醫(yī)大夫應(yīng)用草烏多與大劑量訶子配伍使用，或以藥對形式配伍入煎劑，或以訶子湯炮制品入丸散劑以達到調(diào)和藥性、降低毒性，更好地發(fā)揮療效[1-2]。多年經(jīng)驗證實此方法的可行性，同時，近年來響應(yīng)國家注重天然藥物的發(fā)展趨勢，訶子湯炮制草烏蒙醫(yī)特色炮制方法收到了廣泛的關(guān)注。但是，目前，國內(nèi)外有關(guān)訶子解草烏毒的研究主要從毒性評價、化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)等方面闡明配伍減毒增效的機制，而從藥物吸收代謝入血成分(即特征性有效成分)的角度闡述訶子解草烏毒的相關(guān)報道研究較少[3-6]。對此，本研究基于血清藥物化學(xué)方法，運用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測灌胃給藥大鼠血漿中生草烏及訶子湯炮制草烏入血成分，以此探討訶子湯炮制草烏機制。為今后進一步深入研究訶子湯炮制草烏的機制、代謝規(guī)律以及臨床安全合理用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與設(shè)備UPLC I-CLASS超高效液相色譜儀；G2-SQTof質(zhì)譜儀；Waters ACQUITY uplc-i-class系統(tǒng)數(shù)；十萬分之一電子天平(MettlerToledo公司，美國)；移液槍(Rainin Instrument公司，美國，10 μL，100 μL、200 μL、1 000 μL)；超聲波清洗器(上海必能信超聲有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海，亞榮生化儀器廠)；低溫冰箱(三洋公司，日本)。

1.2 藥品與試劑草烏(湖北聚瑞中藥飲片有限公司，批號：141001)經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院松林教授鑒定為毛茛科植物北烏頭(AconitumcarmichaeliDebeaux)的干燥塊根；對照品：烏頭堿(批號：MUST-15013008)、次烏頭堿(批號：MUST-15090918)、新烏頭堿(批號：MUST-15091504)、苯甲酰烏頭原堿(MUST-15012215)、苯甲酰次烏頭原堿(MUST-150108006)、苯甲酰新烏頭原堿(MUST-16012816)、塔拉薩敏(MUST-14111811)、次烏頭原堿(MUST-14123010)、滇烏頭堿(MUST-14110715)、草烏甲素(MUST-14100913)、硬飛燕草堿(MUST-14102105)、烏頭原堿(MUST-14121101)、新烏頭原堿(MUST-16030604)、高烏甲素(MUST-15030509)、宋果靈(MUST-16032515)、附子靈(MUST-15060810)、尼奧林(MUST-14052513)、多根烏頭堿(MUST-15031213)、德爾塔林(MUST-14091408)；乙腈(HPLC-MS級，F(xiàn)isher Scientific公司)，氨水(色譜純，F(xiàn)luKa公司)，醋酸銨(色譜純，DikmaPure公司)，乙醚(分析純，國藥集團化學(xué)試劑公司)，超純水(自制)。訶子(仁和中藥有限公司，批號：20140101)經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院松林教授鑒定為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz.的干燥成熟果實。甲醇(HPLC-MS級，F(xiàn)isher Scientific公司)；冰醋酸(四平巨能藥業(yè)有限公司)；乙醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑廠)；實驗用水為自制去離子水。磷酸二氫鈉(Japan.Batch，093k0096)、氯化鎂(天津市福晨化學(xué)試劑廠，20151220)、生理鹽水、肝素鈉(天津生物化學(xué)制藥有限公司)、水合氯醛(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 實驗動物清潔級SD大鼠，♂，體質(zhì)量(200±20)g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可合格證號SYXK(京)2017-0033。飼養(yǎng)于室溫22～24 ℃，相對濕度60%。實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，自由飲水和進食。

2 方法

2.1 分組取SD大鼠24只，隨機分為空白組、生草烏組、訶子湯炮制草烏組，每組8只。所有大鼠實驗前禁食12 h，自由飲水。

2.2 訶子湯炮制草烏的制備取生草烏藥材量1/2 的訶子加10倍量水煎煮1 h，4層紗布過濾，用濾液浸泡生草烏2 d再煎煮8 h，撈出草烏置于方盤中60 ℃烘干。

2.3 藥物制備稱取生草烏、訶子湯炮制草烏干燥粉末適量，加適量0.5%羧甲基纖維素鈉，混勻，配制成濃度為0.16 kg·L-1的生草烏、炮制制草烏混懸液(大鼠給藥計量為1.6 g·kg-1)。

2.4 給藥及血清樣本采集給藥組大鼠稱體質(zhì)量后1 mL·100 g-1的劑量灌胃給藥，空白組灌胃給羧甲基纖維素鈉，分別與給藥后15、30、45 min、1、1.5、2、4、8、12、24 h眼眥采血0.5 mL，放入肝素化的EP管中靜置40 min后，4 ℃、4 000 r·min-1離心10 min，取上清液，合并同一采血時間點的不同大鼠的血漿，作為各時間點含藥血漿，備用。

2.5 含藥血漿的檢測

2.5.1血漿樣品的處理 將“2.4”項下制備所得血漿生草烏組10個時間點各取200 μL混合作為生草烏含藥血漿，訶子湯炮制草烏組10個時間點各取200 μL混合作為訶子湯炮制草烏含藥血漿。

取200 μL血漿加40 μL氨水混懸1 min，再加入1 mL乙醚混懸5 min，10 000 r·min-1離心10 min，取上清，氮氣吹干，40 μL 70%乙腈復(fù)溶，進樣檢測。

2.5.2混合對照品樣品的制備 分別取烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、塔拉薩敏、次烏頭原堿、滇烏頭堿、草烏甲素、硬飛燕草堿、烏頭原堿、新烏頭原堿、高烏甲素、宋果靈、附子靈、尼奧林、多根烏頭堿、德爾塔林；對照品適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加入空白血漿超聲溶解并定容，取200 μL加氨水混懸1 min，再加入乙醚混懸5 min，10 000 r·min-1離心10 min，取上清，氮氣吹干，70%乙腈復(fù)溶，制得質(zhì)量濃度為1.000 g·L-1的混合對照品溶液備用。

2.5.3分析條件 色譜條件：色譜柱：ZOX Extend-C182.1×100 mm 1.8 μm；柱溫：40 ℃；進樣量：0.1 μL；水相A：10 mmol醋酸銨水溶液(氨水調(diào)pH=9.02)，有機相B：乙腈洗脫時間梯度見Tab 1。

Tab 1 Elution time gradient

質(zhì)譜條件：毛細管電壓：0.5 kV；錐孔采樣電壓：40 V；去溶劑氣溫度：450 ℃；去溶劑氣流量：900(L·h-1)；錐形氣體流量：50(L·h-1)；離子源溫度：100 ℃；碰撞能量：使用自動碰撞能量(電子伏特)6；質(zhì)量精度保持使用鎖定噴霧與亮氨酸腦啡肽濃度在200 g·L-1和流量10 μL·min-1作為參考[m/z556.276 6 ESI(+)和554.262 0 -(-)]；掃描方式為正離子掃描，質(zhì)量掃描范圍50～1 200。

3 結(jié)果

3.1 實驗結(jié)果在上述提取方法及檢測條件下，樣品及對照品檢測結(jié)果如Fig 1。

由圖可知，血中移行成分在含藥血漿中濃度較低，容易被大量的血漿內(nèi)源性成分色譜峰所掩蓋，很難在全掃描模式下被直觀地檢測出，故需采用提取離子流圖對草烏血中移行成分進行逐一比對分析。

3.2 血中移行成分的分析表征利用MasslynxV4.1工作站中的“strip”工具，設(shè)定空白血漿樣品圖譜作為基線背景，輸入含藥血漿圖譜進行處理去除血漿中內(nèi)源性成分，得到含藥血漿減去空白血漿的色譜圖后再進一步地手動排查確認，從而篩選出空白血漿中沒有、含藥血漿中有的色譜峰，推測草烏血中移行成分。將確定的血中移行成分的保留時間、精確分子質(zhì)量、碎片離子等信息與對照品、本研究前期工作草烏藥材化學(xué)成分鑒定結(jié)果、查閱文獻報道[6-14]以及Massbank數(shù)據(jù)庫，分析質(zhì)譜裂解規(guī)律，在大鼠口服生草烏后含藥血漿樣品中檢測到11個血中移行成分，共鑒定出其中6個原型成分和5個未知成分見Tab 2，大鼠口服訶子湯炮制草烏后含藥血漿樣品中檢測到14個血中移行成分，共鑒定出其中8個原型成分和6個未知成分，見Tab 3。

Fig 1 LC-MS spectrum of plasma detection

3.3 原型成分的鑒定示例以化合物次烏頭堿(保留時間為17.91)為例，與空白血漿相比，大鼠給藥后含藥血漿中檢測到準分子離子峰m/z616.314 0[M+H]+，在高碰撞能條件下將m/z616.314 0進一步打碎，得到碎片離子主要有m/z584.280 3；m/z556.285 7；m/z524.264 6；m/z496.269 9；m/z492.238 5；m/z338.174 3與對照品檢測圖譜中及草烏藥材化學(xué)成分圖譜中化合物次烏頭堿的保留時間及碎片離子一致，如Fig 2，因此推斷該化合物為次烏頭堿。

4 結(jié)論

本實驗在系統(tǒng)全面地建立大鼠口服草烏后血中移行成分分析方法的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Masslynx V4.1質(zhì)譜工作站，通過與空白血清與對照品對比，生草烏后含藥血漿樣品中檢測到11個血中移行成分，共鑒定出其中6個原型成分和5個未知成分，大鼠口服訶子湯炮制草烏后，含藥血漿樣品中檢測到14個血中移行成分，共鑒定出其中8個原型成分和6個未知成分。此外，對比血中移行成分鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)生草烏與訶子湯炮制草烏入血相同成分有9個，其中5種成分已鑒定出，分別為苯甲酰新烏頭原堿、尼奧林、新烏頭原堿、次烏頭原堿、烏頭堿，生草烏入血但訶子湯制草烏沒有成分有2個，已鑒定出其中一種為新烏頭原堿。訶子湯炮制草烏入血生草烏沒有的成分有5個，鑒定出其中3分別為苯甲酰次烏頭原堿、北烏堿A、10-羥基烏頭堿。由于，入血成分才有可能是藥效成分，因此以后訶子湯炮制草烏機理研究的重點可著重選擇幾個入血成分。此外，應(yīng)該重視草烏及其炮制品入血成分的差異成分，這些成分也有可能是訶子湯炮制草烏解毒機制的關(guān)鍵所在。

Tab 2 Identification of blood transitional components in raw Radix Aconiti kusnezoffii group

Tab 3 Identification of transitional components in prepared Radix Aconiti kusnezoffii blood

Fig 2 Fagment ion diagram of aconitine

5 討論

血清藥物化學(xué)的研究[15-17]目的是對含藥血清中外源性成分及其作用和代謝規(guī)律進行鑒定和表征，從而為快速、準確地闡明單藥及復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制提供理論依據(jù)。

草烏毒性大，且體內(nèi)吸收代謝過程復(fù)雜，因此給藥劑量大容易毒死實驗動物，給藥劑量小又不易檢測其血漿中移行成分，因此為了能夠更清晰、全面的檢出草烏血中移行成分，本實驗前期工作對實驗動物給藥劑量進行了優(yōu)化實驗，采用了本次實驗用草烏極限給藥劑量，即保證實驗動物不被毒死的情況下的最大給藥劑量。生草烏、訶子湯炮制草烏最大耐受量分別為1.6 g·kg-1、2.18 g·kg-1。

此外，由于生物樣品尤其是血液中含有大量的酶和蛋白，這些內(nèi)源性物質(zhì)的存在，可繼續(xù)降解血中藥物成分，降低待測成分的血藥濃度，干擾待測成分的檢測，同時對用于檢測的儀器設(shè)備亦有損傷。因此，本實驗在對血漿樣品分析檢測前需要進行除蛋白等前處理工作進行了優(yōu)化，分別對甲醇沉淀法、乙腈沉淀法和固相萃取法及液液萃取(乙醚萃取)法進行了考察。結(jié)果與甲醇、乙腈沉淀蛋白法固相萃取法相比，乙醚萃取法制備的血漿樣品，可檢測到的入血成分較多，以20 μg·L-1的混合標準品為標準，計算得相對峰面積可看出乙醚萃取成分含量高，同時，其得到的圖譜中色譜峰的分離效果好、離子強度高、空白干擾小，因此，選用乙醚萃取法作為血漿處理方法。此研究建立了生草烏、訶子湯炮制草烏有效成分血漿中檢測方法，得出不同時間點生草烏、訶子湯炮制草烏血藥濃度，給后續(xù)藥代、毒代動力學(xué)研究提供了依據(jù)。