補(bǔ)骨脂素在2D/3D肝細(xì)胞模型上的毒性比較及對(duì)線粒體融合分裂的影響

趙 琳，蘇世家，王嘉瑞，于英莉，2，周 昆，2

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院， 2. 省部共建組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617)

補(bǔ)骨脂是豆科植物補(bǔ)骨脂(PsoraleacorylifoliaL)的干燥成熟果實(shí)，歸腎、脾經(jīng)，具有溫腎助陽(yáng)，納氣平喘，溫脾止瀉的功效，是二神丸、青娥丸等經(jīng)典方劑的重要組成成分，已被廣泛用于治療白癜風(fēng)、骨折、骨質(zhì)疏松癥等[1]多種疾病。隨著在臨床上的廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多的臨床報(bào)告表明補(bǔ)骨脂具有潛在的肝毒性[2]，引發(fā)了學(xué)者對(duì)于補(bǔ)骨脂中毒性成分的關(guān)注。補(bǔ)骨脂素是補(bǔ)骨脂水煎液體內(nèi)吸收的主要活性成分之一，其含量是補(bǔ)骨脂藥材質(zhì)量控制的限定標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)代藥理研究表明，補(bǔ)骨脂素具有抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)、抗炎等藥理作用[3]。補(bǔ)骨脂素在長(zhǎng)期或大劑量給藥情況下可引起大鼠、小鼠、斑馬魚等動(dòng)物嚴(yán)重肝損傷，其毒性機(jī)制與膽汁酸代謝，細(xì)胞色素P450代謝以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等引起的氧化應(yīng)激、線粒體毒性、肝細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)[3]。

人肝癌細(xì)胞(human hepatocellular carcinomas，HepG2)是分離自人類肝癌組織的細(xì)胞系，在培養(yǎng)中相對(duì)容易維持，具有許多正常肝細(xì)胞特征，也是目前用于肝毒性評(píng)估最常用的人類細(xì)胞模型之一[4]。然而，在傳統(tǒng)的2D單層培養(yǎng)中，HepG2細(xì)胞中細(xì)胞色素P450(CYP450)酶[5]表達(dá)水平較低，而CYP450酶的活性和誘導(dǎo)性是預(yù)測(cè)藥物體內(nèi)過程和毒性不良反應(yīng)的關(guān)鍵指標(biāo)[6]。因此，在藥物開發(fā)和肝毒性研究中，細(xì)胞體外三維類(3D)組織聚球體培養(yǎng)成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一。相比傳統(tǒng)2D細(xì)胞培養(yǎng)，3D培養(yǎng)可以更好地模擬細(xì)胞和組織功能，具有更好的建模效果。其最大特點(diǎn)是增強(qiáng)了細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)的相互作用并提高了肝臟特異性功能的表達(dá)，從而在體內(nèi)提供了生理上更相關(guān)的模型[7]。但體外肝臟3D模型在中藥毒性評(píng)價(jià)方面的應(yīng)用仍處于初級(jí)階段，有待進(jìn)行更多的驗(yàn)證和探索。

本研究首先利用低吸附U形底多孔板法構(gòu)建HepG2細(xì)胞的3D多細(xì)胞聚球體模型，并對(duì)該模型進(jìn)行肝臟特異性功能檢測(cè)；分別使用2D和3D培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞模型評(píng)價(jià)補(bǔ)骨脂素的毒性并比較其差異性，進(jìn)一步探討補(bǔ)骨脂素的肝毒性作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑補(bǔ)骨脂素(≥98%，19101703)購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培基(2053260)購(gòu)自以色列BI公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，1922693)購(gòu)自以色列BI公司；青鏈霉素(MA0110)購(gòu)自大連美侖生物有限公司；CCK-8(59122500)購(gòu)自Biosharp；總RNA小量抽提試劑盒(P10301)，TRANZOL UP(P10301)，Trans Script First-Strand CDNA Synthesis Super Mix(P20610)均來(lái)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Ultra SYBR Mixture(33620)購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；四甲基羅丹明甲酯(tetramethylrhodamine methyl ester，TMRM，43818)購(gòu)自美國(guó)Med Chem Express；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，4083S)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology；白蛋白(Albumin，ALB，200921)試劑盒和尿素氮(Urea nitrogen，BUN，201041)試劑盒均購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司；乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH，LE647)試劑盒購(gòu)自日本Dojindo Laboratories。

1.2 儀器熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；高內(nèi)涵篩選儀(INcell Analyzer 2500 HS)購(gòu)自美國(guó)GE公司；NanoDrop One超微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；全自動(dòng)血清生化儀購(gòu)自日本Hitachi公司；酶標(biāo)儀(SPARK)來(lái)自瑞士THCAN公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞系取自中國(guó)科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫(kù)，將HepG2細(xì)胞接種于25 mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，使用含F(xiàn)BS(10%)、青霉素(100 kU·L-1)和鏈霉素(100 kU·L-1)1% DMEM，于37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行單層培養(yǎng)。培養(yǎng)基隔天更換，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)覆蓋瓶底80%～90%時(shí)可傳代。

1.4 3D細(xì)胞模型的構(gòu)建本研究使用低吸附U形底多孔板法構(gòu)建3D細(xì)胞模型[8]。以每孔1 500、4 500和7 500個(gè)細(xì)胞接種于超低吸附U型底96孔板(購(gòu)自美國(guó)Corning公司)中，每孔100 μL懸液，在超凈臺(tái)中放置5 min，使用顯微鏡觀察細(xì)胞，放于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，隔天進(jìn)行半換液；于接種后d 1～4，6、8、10進(jìn)行顯微鏡觀察，用顯微鏡拍照記錄不同接種密度的3D HepG2聚球體的聚集形態(tài)。

1.5 肝功能評(píng)價(jià)將細(xì)胞分別進(jìn)行2D和3D細(xì)胞模型培養(yǎng)。通過全自動(dòng)血清生化檢測(cè)儀檢測(cè)3D培養(yǎng)條件下HepG2細(xì)胞聚球體在d 2、4、6、8、10中，以及2D培養(yǎng)條件下細(xì)胞d 2的ALB和BUN分泌的含量。

1.6 Q-PCR檢測(cè)將HepG2細(xì)胞分別進(jìn)行2D和3D細(xì)胞模型培養(yǎng)，取2D培養(yǎng)2 d,以及3D條件下培養(yǎng)4 d和10 d的細(xì)胞聚球體為樣本，通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈鎖反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction，Q-PCR)測(cè)定其CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4以及UGT1A1的mRNA表達(dá)水平。另取3D條件下培養(yǎng)4 d，不同濃度補(bǔ)骨脂素給藥24 h的細(xì)胞聚球體為樣本，通過Q-PCR測(cè)定其線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白 1(dynamin-related protein 1，DRP1)、線粒體融合蛋白2(mitofusin 2，Mfn-2)以及視神經(jīng)萎縮蛋白 1(optic atrophy 1，OPA1)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。其引物由上海生工生物科技有限公司合成。采用通用型總RNA提取試劑盒進(jìn)行樣本RNA提取，使用NanoDrop ND-2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定所提取的細(xì)胞中RNA的濃度和純度。隨后采用TransScript First-Strand CDNA Synthesis Super Mix進(jìn)行CDNA反轉(zhuǎn)錄，將配置完成的反應(yīng)體系充分混勻后放入Q-PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。設(shè)置反應(yīng)程序：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min(收集熒光)；40個(gè)PCR循環(huán)。Q-PCR所用引物見Tab 1，為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，從60 ℃緩慢加熱到90 ℃。以GAPDH為內(nèi)參，采用Livak(2-ΔΔCt)法進(jìn)行相對(duì)基因表達(dá)分析。

Tab 1 Q-PCR target gene primer sequences

1.7 2D細(xì)胞模型評(píng)價(jià)補(bǔ)骨脂素毒性補(bǔ)骨脂素分為5個(gè)劑量組，分別為對(duì)照組、50、100、200和400 μmol·L-1組。2D細(xì)胞模型以4.5×103個(gè)/孔的密度接種于普通96孔板，培養(yǎng)24 h后，棄去全部的舊培養(yǎng)基，再給予100 μL藥物進(jìn)行處理。24 h后換成100 μL含CCK-8試劑的培養(yǎng)基，在37 ℃下孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀450 nm測(cè)光密度(optical density，OD)值，檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.8 3D細(xì)胞模型評(píng)價(jià)補(bǔ)骨脂素毒性補(bǔ)骨脂素分為5個(gè)劑量組，分別為對(duì)照組、50、100、200和400 μmol·L-1組。3D聚球體細(xì)胞模型以4.5×103個(gè)/孔的密度接種于低吸附U型底96孔板，培養(yǎng)4 d后，棄去全部的舊培養(yǎng)基，再給予100 μL藥物進(jìn)行處理。24 h后換成100 μL含CCK-8試劑的培養(yǎng)基，在37 ℃下孵育4.5 h后，使用酶標(biāo)儀450 nm測(cè)OD值，檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.9 LDH漏出量測(cè)定移取“1.7”“1.8”中2D單層細(xì)胞，3D HepG2聚球體給藥24 h后的上清液50 μL在普通96孔板中，按照日本都津道分子技術(shù)公司的活性/細(xì)胞毒性復(fù)合檢測(cè)試劑盒的說明進(jìn)行LDH漏出水平的測(cè)定。每孔加入50 μL工作液，室溫黑暗孵育25 min。每孔加入25 μL的stop溶液，用酶標(biāo)儀記錄490 nm處的OD值，檢測(cè)LDH漏出量。

1.10 線粒體膜電位水平2D/3D細(xì)胞模型的培養(yǎng)及給藥方式如“1.7”“1.8”所示，給藥24 h后，使用TMRM和DAPI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，分別用高內(nèi)涵篩選儀的2D和3D模式，以548 nm的激發(fā)波長(zhǎng)、570 nm的發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)TMRM和以350 nm的激發(fā)波長(zhǎng)、460 nm的發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)DAPI的熒光強(qiáng)度并進(jìn)行圖像分析，通過高內(nèi)涵分析軟件計(jì)算平均熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 3D培養(yǎng)模型的建立和評(píng)價(jià)

2.1.1細(xì)胞聚球體的形成 由形態(tài)觀察可見，3D條件下，微球直徑隨著培養(yǎng)時(shí)間及初始接種密度的增加而增大，連續(xù)培養(yǎng)3 d細(xì)胞自發(fā)聚集形成致密穩(wěn)定的球形，以1 500、4 500、7 500個(gè)/孔的接種密度分別進(jìn)行接種，如Fig 1A，B所示，對(duì)比3種接種密度的球體增長(zhǎng)情況來(lái)看，1 500個(gè)/孔HepG2球體的初始直徑較小，球體體積總體較小。4 500個(gè)/孔的HepG2細(xì)胞聚球體生長(zhǎng)速度明顯快于7 500個(gè)/孔細(xì)胞聚球體，體積變化幅度大，且符合在細(xì)胞球直徑為200 μm左右時(shí)活性較高，且不會(huì)出現(xiàn)大量的核壞死的條件[9]。因此選擇4 500個(gè)/孔的密度種板進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.23D模型具有較高的ALB和BUN分泌水平以及肝藥酶活性 通過不同的培養(yǎng)方式，在細(xì)胞培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，分別對(duì)ALB和BUN含量進(jìn)行檢測(cè)。如Fig 2A，B示，3D培養(yǎng)2 d后，白蛋白和尿素氮分泌都達(dá)到較高水平，且均顯著性高于2D培養(yǎng)水平。該水平一直維持到培養(yǎng)10 d后。該結(jié)果表明，3D模型可以長(zhǎng)時(shí)間保持高水平ALB和BUN分泌，維持其肝臟功能。

肝藥酶活性是影響藥物肝毒性的重要因素。為檢測(cè)3D模型培養(yǎng)下細(xì)胞的代謝能力，通過Q-PCR測(cè)定重要的CYP450酶的活性，評(píng)價(jià)細(xì)胞模型的代謝功能，并與2D細(xì)胞進(jìn)行比較。如Fig 2C所示，3D細(xì)胞培養(yǎng)至d 4和d 10時(shí)，CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4和UGT1A1的mRNA表達(dá)與2D細(xì)胞相比均升高，其中3D細(xì)胞培養(yǎng)至d 4時(shí)CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4和UGT1A1 mRNA的表達(dá)分別為2D細(xì)胞的2.49、6.44、4.17和3.78倍。

Fig 1 Formation of 3D HepG2 cell

2.2 比較補(bǔ)骨脂素對(duì)2D/3D培養(yǎng)HepG2細(xì)胞的肝毒性差異在2D和3D細(xì)胞模型中，補(bǔ)骨脂素均明顯降低細(xì)胞存活率。在2D細(xì)胞培養(yǎng)模型中，與對(duì)照組相比，400 μmol·L-1的補(bǔ)骨脂素處理后，細(xì)胞的存活率下降到86.78%(Fig 3A)，而LDH漏出量增加至115.33%(Fig 3B)。3D細(xì)胞模型相比于2D細(xì)胞，在更低的劑量下表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，與對(duì)照組相比，100、200和400 μmol·L-1的補(bǔ)骨脂素處理后，細(xì)胞的存活率分別下降到83.97%、79.02%和72.45%(Fig 3C)。LDH漏出量也從100 μmol·L-1開始出現(xiàn)明顯增加，分別增加至111.21%、127.28%和137.60%(Fig 3D)。因此，結(jié)果顯示3D 細(xì)胞培養(yǎng)模型對(duì)補(bǔ)骨脂素的反應(yīng)更為敏感。

2.3 比較補(bǔ)骨脂素對(duì)2D/3D培養(yǎng)HepG2細(xì)胞的線粒體損傷差異線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)是評(píng)估線粒體功能的關(guān)鍵參數(shù)，細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)多伴有MMP的下降。使用熒光染料TMRM染色線粒體，一旦MMP喪失，TMRM積累將停止，信號(hào)變暗或消失。如Fig 4C，D所示，3D條件培養(yǎng)的細(xì)胞聚球體TMRM熒光強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組。當(dāng)補(bǔ)骨脂素為100、200和400 μmol·L-1時(shí)，3D聚球體的TMRM熒光強(qiáng)度明顯降低，分別為對(duì)照組的52.80%、55.54%和34.85%(Fig 4C)。相反，如Fig 4A，B所示，2D細(xì)胞模型與對(duì)照組相比，僅在400 μmol·L-1時(shí)，TMRM熒光強(qiáng)度明顯下降至88.23%。

Fig 2 3D model with higher levels of albumin and urea secretion and liver drug enzymatic

Levels of (A)albumin and (B)urea secretion in 2D/3D cell models; C：CYP3A4，CYP2E1，CYP1A2 and UGT1A1 mRNA level.*P<0. 05，**P<0. 01vs2D;#P<0. 05，##P<0.01vs3D-4 d.

Fig 3 Comparison of hepatotoxicity of psoralen in 2D/3D HepG2 cell

Fig 4 Psoralen induced mitochondrial membrane potential reduction in 2D/3D HepG2

2.4 補(bǔ)骨脂素誘導(dǎo)線粒體融合分裂失衡DRP1是介導(dǎo)線粒體分裂的主要蛋白之一。線粒體外膜之間的融合是由線粒體融合蛋白Mfn-1和Mfn-2介導(dǎo)的，而線粒體內(nèi)膜之間的融合是由OPA1介導(dǎo)。如Fig 5所示，Q-PCR檢測(cè)了3D HepG2細(xì)胞膜型中線粒體分裂-融合動(dòng)態(tài)的關(guān)鍵指標(biāo)，比照對(duì)照組，DRP1的表達(dá)明顯增加至162.84%；而線粒體融合相關(guān)蛋白Mfn-2未有顯著性差異，OPA1表達(dá)明顯降低，為對(duì)照組的82.99%。提示補(bǔ)骨脂素誘導(dǎo)了線粒體分裂。

Fig 5 Effect of psoralen on expression of mitochondrial fusion and fission-related genes in 3D HepG2 cell model *P<0. 05 vs control

3 討論

由于傳統(tǒng)的2D細(xì)胞模型的局限性，建立合適的模型對(duì)于臨床前藥物開發(fā)和疾病研究非常迫切。與傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)相比，3D細(xì)胞培養(yǎng)通過模擬細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用，以及多種新技術(shù)提供類似體內(nèi)的生物物理環(huán)境[10]。低吸附U形底多孔板法構(gòu)建的3D HepG2細(xì)胞聚球體模型，操作簡(jiǎn)單，成本相對(duì)較低，可大量快速進(jìn)行肝細(xì)胞類組織球體構(gòu)建，模型功能表現(xiàn)突出，并能實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期培養(yǎng)[11]，可進(jìn)行常規(guī)的藥物安全性評(píng)估，直接應(yīng)用于高通量高內(nèi)涵等相關(guān)檢測(cè)設(shè)備，方便快捷。與2D模型相比，該模型可以長(zhǎng)期培養(yǎng)，且能夠保持較高的白蛋白和尿素氮分泌水平和肝藥酶活性。

通過對(duì)細(xì)胞存活率以及LDH漏出量的檢測(cè)，結(jié)果表明補(bǔ)骨脂素對(duì)于3D培養(yǎng)的細(xì)胞損傷更為嚴(yán)重，而且更低濃度的補(bǔ)骨脂素即可造成細(xì)胞明顯損傷，提示3D細(xì)胞模型對(duì)補(bǔ)骨脂素的肝毒性更為敏感。3D培養(yǎng)模型中藥物代謝酶活性較高與人肝細(xì)胞代謝能力強(qiáng)的特征較為符合，這可能是2D/3D培養(yǎng)條件下同種細(xì)胞作用于相同化合物出現(xiàn)毒性差異的原因之一。3D細(xì)胞模型在評(píng)價(jià)藥物代謝后的肝臟毒性方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

線粒體在藥物性肝損傷中起著中心作用[12]。有研究顯示，補(bǔ)骨脂素能夠破壞肝細(xì)胞線粒體膜完整性，引起ATP合成障礙[13]。因此，明確補(bǔ)骨脂素對(duì)線粒體的影響尤為重要。正常的MMP是維持氧化磷酸化和產(chǎn)生 ATP 的先決條件，MMP下降是細(xì)胞凋亡的一個(gè)早期標(biāo)志[14]。補(bǔ)骨脂素在3D HepG2聚球體上以更低的藥物濃度就可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞MMP降低，表現(xiàn)出線粒體毒性。正常情況下，線粒體分裂和融合是動(dòng)態(tài)平衡的，線粒體形態(tài)改變受線粒體融合分裂蛋白控制。線粒體動(dòng)態(tài)平衡是保證膜結(jié)構(gòu)完整的重要條件，也是維持正常膜電位的重要機(jī)制，在維持線粒體功能方面起著關(guān)鍵作用，是保證細(xì)胞正?；顒?dòng)的重要基礎(chǔ)[15-16]。補(bǔ)骨脂素給藥后，3D HepG2細(xì)胞膜型中線粒體分裂蛋白DRP1表達(dá)明顯升高，而線粒體融合蛋白OPA1表達(dá)明顯降低，提示線粒體分裂增加、融合減少。過度的線粒體裂變會(huì)破壞線粒體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，導(dǎo)致線粒體功能障礙并伴隨MMP的降低，激活線粒體途徑的細(xì)胞凋亡[17-18]。

綜上所述，由低吸附U形底多孔板法構(gòu)建的3D HepG2細(xì)胞模型與2D細(xì)胞相比，有更好的代謝特征。補(bǔ)骨脂素對(duì)3D細(xì)胞模型造成的細(xì)胞毒性和線粒體損傷作用強(qiáng)于2D模型。補(bǔ)骨脂素造成線粒體過度分裂，可能是其誘導(dǎo)線粒體功能失常、細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性因素，但補(bǔ)骨脂素如何導(dǎo)致線粒體DRP1和OPA1的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。