基于免疫應激的補骨脂特異質肝毒性作用

高姝燕，麥麗克姆·麥圖如孜，王 春，霍仕霞，張?zhí)m蘭，竇 勤，張 云，李治建2,

[1.新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830049；3.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆 烏魯木齊 830011；4.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830000；5.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)生物研究所，山東 濟南 250103]

特異質肝損傷( Idiosyncratic drug-induced liver injury,IDILI)是一種不可預測的藥物不良反應，可導致急性肝功能衰竭，與藥物劑量無明顯關系，僅在少數(shù)病人身上發(fā)生[1]。近年來，傳統(tǒng)中藥引起的IDILI報道呈上升趨勢，這使中藥新藥開發(fā)和臨床應用面臨嚴峻挑戰(zhàn)。

補骨脂，為豆科植物補骨脂(PsoraleaCorylifoliaL.)的干燥成熟果實，其味辛、苦，性溫，主要歸腎、脾經，可用于治療陽痿遺精、腎脾虛弱、小便無度、腰膝冷痛、虛寒咳嗽、五更泄瀉等疾病[3]。收錄在2020年版《中國藥典》中的含有補骨脂的相關成方制劑多達41種[3]。在臨床中多用于治療皮膚病和骨關節(jié)炎等免疫炎癥性疾病。

臨床應用過程中發(fā)現(xiàn)，補骨脂可引起多種不良反應，其中肝損傷最為明顯[4]，主要表現(xiàn)為膽汁淤積型和肝細胞壞死型肝損傷[5]。補骨脂引起肝臟損傷的發(fā)生與用藥時間、用藥劑量無明顯相關性，服用補骨脂的病人多出現(xiàn)機體免疫失衡，提示了補骨脂誘發(fā)IDILI風險。且已有研究表明，在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的免疫應激條件下，淫羊藿與補骨脂配伍使用可導致嚴重的肝損傷，主要機制可能是調節(jié)免疫炎癥和代謝功能障礙[6]。然而，補骨脂單獨作用是否會引起IDILI并未明確指出。為此，本研究通過LPS誘導的大鼠免疫應激模型，考察補骨脂肝毒性作用的特點及其毒性機制，為臨床合理使用補骨脂及其制劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物雄性SPF級SD大鼠(n=70)，體質量(180～200)g，購于新疆醫(yī)科大學動物實驗中心(生產許可證號：SCXK(新)2018-0002)。飼養(yǎng)于新疆維吾爾醫(yī)藥研究所藥品安全評價中心SPF級實驗室，許可證號：SYXK(新)2018-0001，12 h/12 h明/暗光照，周期環(huán)境溫度(20～26)℃，提供過濾的飲用水，自由飲食。本研究經新疆維吾爾醫(yī)藥研究所倫理委員會批準。

1.2 藥品與試劑補骨脂(購自新疆新奇康藥業(yè)股份有限公司，由新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所霍仕霞研究員鑒定為補骨脂的干燥果實，批號：20191219)；LPS(Sigma公司，批號:L2880)。

丙氨酸轉氨酶(ALT)檢測試劑盒(IFCC法，批號：140121001)、天冬氨酸轉氨酶(AST)檢測試劑盒(IFCC法，批號：140220013)、堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(速率法，批號：140320010)、總膽汁酸(TBA)檢測試劑盒(循環(huán)酶法，批號：143220011)均購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(批號：PC0020)；ELISA白介素-1(IL-1，批號：JL20896)、白介素-12(IL-12，批號：JL20874)、腫瘤壞死因子(TNF-α，批號：JL13202)均購自江萊生物科技有限公司；一抗ras同源家族成員A(RhoA)購自北京博奧森生物技術有限公司(批號：bs-1180R)；DAB顯色試劑盒(批號：ZLI-9018)、胰蛋白酶消化液(批號：ZLI-9010)購于北京中杉金橋生物技術有限公司、RNApure Tissue & Cell Kit 動物組織/細胞RNA提取試劑盒(批號：CW0584S)購自江蘇康為世紀生物科技有限公司。

1.3 儀器全自動生化分析儀：7100型，日立公司；低速大容量離心機：TGL-5-A，上海安亭科學儀器廠；普通光學顯微鏡：DM4000，德國萊卡公司；切片機：RM2245，德國萊卡公司；生物組織自動包埋機：KD-BMII，浙江金華科迪儀器設備有限公司；生物組織自動脫水機：KD-TS3D，浙江金華科迪儀器設備有限公司；攤片烤片機：KZPG-1A，天津天利航空機電有限公司；酶標儀：multiskan FC，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；qPCR實時定量系統(tǒng)：CFX96，美國伯樂公司。

1.4 方法

1.4.1補骨脂水提取物(WEFP)制備 補骨脂干燥果實，粉碎后經10倍量純化水煮沸提取3次，3次提取液混合后蒸發(fā)、回流、烘干得生藥量為7.74 g·g-1的棕褐色干燥粉末。經HPLC檢測WEFP含補骨脂素3.06 mg·g-1、異補骨脂素2.20 mg·g-1、補骨脂酚14.65 mg·g-1，用動物飲用水配制使用[11]。

1.4.2動物分組和給藥 將 70只雄性SD大鼠隨機分為：CON組、LPS組、WEFP組、LPS+WEFP組，CON與LPS每組20只，其余各組每組15只。LPS、LPS+WEFP組大鼠尾靜脈注射4 mg·kg-1LPS，對照組與WEFP組給予等體積生理鹽水；2 h后WEFP組與LPS+WEFP 組ig給予1.1 g·kg-1(等于8.514 g生藥·kg-1，按體表面積換算，約為大鼠等效劑量的7.9倍)的WEFP，對照組與 LPS 組給予等體積的生理鹽水，各組每日給藥1次，連續(xù)給藥7 d。

1.4.3體質量記錄及一般狀態(tài)觀察 給藥期間，每日稱量并記錄大鼠體質量，并對動物進行體征觀察。

1.4.4膽汁流速檢測 末次給藥當日23 ∶00左右禁食，次日稱量大鼠禁食體質量后，用20%烏拉坦0.6 mL·100 g-1腹腔注射進行麻醉。仰臥固定，于上腹部切口，分離膽總管，通過膽總管插管(PE管)，收集插管后2 h膽汁于預先稱質量的無菌塑料試管中，精密分析天平測定每只動物膽汁的總質量=(含膽汁試管質量-空試管質量)，分別計算出膽汁的密度、體積和膽汁流量。

膽汁密度的測定：移液器吸頭預先稱質量，用精密移液器(40～200 μL)吸取200 μL膽汁于吸頭中，再次測定總質量，則200 μL膽汁質量=含膽汁吸頭質量-空吸頭質量，按密度=質量/體積的公式，計算出膽汁密度，單位以kg·L-1表示。

膽汁總體積的計算：按體積=質量/密度的公式，計算出膽汁總體積，單位以mL表示。

按膽汁總體積/(收集時間×肝臟質量)的公式，計算單位時間(min)和肝質量(g)內的膽汁分泌量，即膽汁流量，單位以μL·min-1·g-1表示。

1.4.5肝臟系數(shù)及血清ALT、AST、ALP、TBA含量檢測 膽汁收集完畢，將以上動物進行腹主動脈取血，3 000 r·min-1離心10 min得到上清液，置于全自動生化儀中測定 ALT、AST、ALP、TBA含量。取出全部肝臟稱質量，計算肝臟質量系數(shù)=[肝臟質量(g)/體質量(g)×100%]。

1.4.6肝組織病理學檢查 分別給藥2 h、14 h、5 d、8 d，取各組肝臟用10%中性福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋、切片，采用HE染色，用電子顯微鏡進行組織病理學觀察。取各組肝臟制備的切片脫蠟和水化，PBS清洗后抗原修復。滴加RhoA一抗，4 ℃ 過夜，滴加聚合HRP標記抗兔IgG二抗，DAB 顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水、透明、樹脂封片。電鏡下觀察免疫陽性區(qū)域。采用Image Pro Plus5.0圖像分析軟件測定免疫陽性面積，以評價蛋白表達水平。

1.4.7肝臟組織內IL-1和TNF-α含量檢測 組織樣本制備10%的組織勻漿液：準確稱取大鼠肝組織200 mg，按質量(g) ∶體積(mL)=1 ∶9的比例，加入9倍體積預冷的PBS緩沖液，制成10%的勻漿液，取出混勻抽提l min，3 500 g離心10 min，取上清液BCA定量，按照試劑盒說明書檢測IL-1和TNF-α含量。

1.4.8實時熒光定量定量PCR(qPCR) qPCR檢測給藥d 8肝臟組織中Toll樣受體4(TLR4)、細胞間黏附分子(ICAM-1)、RhoA、法尼醇X受體(FXR)、Na+-?；悄懰峁厕D運蛋白(NTCP)、多耐藥蛋白-2(MRP2)和膽鹽輸出泵(BSEP)mRNA表達變化，提取肝臟組織總RNA，反轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行擴增，檢測mRNA表達量。引物序列見Tab 1。

2 結果

2.1 WEFP對免疫應激大鼠體質量的影響與CON組相比，給藥14 h，LPS和LPS+WEFP組大鼠體質量明顯下降(P<0.01)；給藥5 d，LPS組大鼠體質量出現(xiàn)增長，LPS+WEFP組大鼠體質量持續(xù)下降(P<0.01)；給藥8 d，LPS+WEFP 組大鼠體質量明顯低于CON組(P<0.05)。與WEFP組相比，給藥第14 h、d 5后，LPS+WEFP組體質量明顯降低(P<0.05，P<0.01)，見Fig 1。

2.2 WEFP對免疫應激大鼠膽汁流速的影響給藥14 h后，與CON組相比，WEFP組膽汁流速無明顯性差異，而LPS+WEFP組膽汁流速明顯下降(P<0.01)。給藥5 d后，各組膽汁流速恢復正常，見Fig 2。

Fig 1 Effects of different administration groups on body weight of rats

2.3 WEFP對免疫應激大鼠肝臟系數(shù)的影響給藥14 h后，與CON組相比，LPS+WEFP組大鼠肝臟系數(shù)均明顯升高(P<0.01)；與WEFP組相比，LPS+WEFP組肝臟系數(shù)也明顯升高(P<0.01)。給藥5 d后，LPS+WEFP組肝臟系數(shù)與CON組和WEFP組相比明顯升高(P<0.01)。持續(xù)給藥8 d后，各組肝臟系數(shù)恢復正常，見Fig 3。

2.4 WEFP對免疫應激大鼠血清ALT、AST、ALP、TBA含量的影響血清生化結果見Tab 2～5。經LPS誘導2 h后LPS與CON組相比血清ALT、AST、ALP和TBA含量并無明顯性改變，提示低劑量的LPS未造成肝臟損傷。給藥14 h后與CON組相比，LPS+WEFP組ALT、AST和ALP含量均明顯增加(P<0.05或P<0.01)，且LPS組和LPS+WEFP組TBA含量明顯增加(P<0.05或P<0.01)。給藥5 d后，與CON組相比，LPS+WEFP組TBA含量明顯升高(P<0.01)，LPS+WEFP組ALT、AST和ALP含量明顯減少(P<0.05或P<0.01)。給藥后d 8，與空白對照組相比，WEFP組和LPS+WEFP組ALT含量減少(P<0.05)，LPS+WEFP組AST、ALP、TBA含量減少(P<0.05)。

Fig 2 Effects of different administration groups on bile flow velocity **P<0. 01 vs CON group; ##P<0. 01 vs WEFP group.

Fig 3 Effects of different administration groups on liver coefficient in rats **P<0. 01 vs CON group; ##P<0. 01 vs WEFP group

Group2 h14 h5 d8 dCON338.25±84.50272.25±18.12303.67±44.29312.67±111.43LPS295.33±66.43319.40±30.94299.40±28.58257.00±66.86WEFP-239.60±27.34311.80±21.28197.60±41.34??LPS+WEFP-903.50±230.86??##138.00±14.12??##147.00±34.71??

Tab 3 Serum AST ( U·L-1 ) values of rats in each group at different time points n=5)

Tab 4 Serum ALP ( U·L-1 ) values of rats in each group at different time points

Tab 5 Serum TBA ( U·L-1 ) values of rats in each group at different time points

Fig 4 Typical histopathological section photographs of rat liver specimens for HE analysis (magnification 200×, 100×)

2.5 WEFP對免疫應激大鼠肝臟病理損傷的影響通過顯微檢查肝臟組織以分析肝臟的損傷程度。如Fig 4所示，CON組肝臟切片顯示正常的肝細胞結構。LPS組和LPS+WEFP組給藥14 h出現(xiàn)輕微炎癥細胞浸潤。WEFP處理的大鼠肝臟樣本除WEFP組在給藥第8 d表現(xiàn)出輕度脂肪變性外，其余與CON組大鼠的肝細胞形態(tài)相比沒有明顯病理學改變。LPS+WEFP組大鼠的肝臟樣本出現(xiàn)中央靜脈內膜脫落，以及門靜脈區(qū)域的炎癥細胞浸潤；在給藥d 5出現(xiàn)肝細胞局灶性壞死，脂肪變性和膽汁淤積。

2.6 WEFP對免疫應激大鼠肝臟組織內IL-1和TNF-α含量的影響給藥5 d后，LPS+WEFP組與CON組和WEFP組相比，肝臟中IL-1含量明顯增加(P<0.01或P<0.05)。給藥8 d后，與CON組相比，WEFP組IL-1含量有增加趨勢但無差異，但LPS+WEFP組肝臟中IL-1含量明顯增加(P<0.01)，見Fig 5A。

大鼠給藥2 h、14 h、5 d后，各組肝臟中TNF-α含量均無明顯變化；在給藥d 8，LPS+WEFP組與WEFP組相比肝臟中TNF-α含量明顯增加(P<0.05)，見Fig 5B。

2.7 WEFP對免疫應激大鼠肝臟組織中RhoA蛋白表達的影響RhoA染色位于細胞質中呈棕褐色，主要見于竇周，以沿間隔分布的梭形間質細胞表達為主，部分肝細胞、竇內皮細胞、血管內皮細胞和膽管上皮細胞的膜上表達也有所增強，見Fig 6A。給藥14 h 后與CON組相比，LPS組和LPS+WEFP組大鼠肝組織RhoA表達明顯增加(P<0.01)。給藥5 d后，與CON組相比，LPS組、WEFP組、LPS+WEFP組RhoA蛋白表達均明顯增加(P<0.01)；與WEFP組相比，LPS+WEFP組RhoA表達明顯增加(P<0.01)。給藥8 d后，與CON組相比，WEFP組和LPS+WEFP組RhoA表達明顯增加，見Fig 6B。

2.8 WEFP對免疫應激大鼠炎癥、膽汁代謝關鍵調控基因mRNA表達的影響對各組與炎癥相關基因表達進行分析。與CON組相比，LPS組和LPS+WEFP組肝臟組織中TLR4相對mRNA水平明顯升高(P<0.01)，LPS+WEFP組RhoA和ICAM-1相對mRNA水平明顯升高(P<0.01)。與WEFP組相比，LPS+WEFP組RhoA、TLR4 、ICAM-1mRNA表達均明顯升高(P<0.01)，見Fig 7A。與膽汁酸代謝相關基因中FXR、MRP2和BSEP mRNA表達含量與CON組相比WEFP組無明顯性變化，但LPS+WEFP組出現(xiàn)明顯升高(P<0.05、P<0.01)。與CON組相比，各組NTCP mRNA表達未出現(xiàn)明顯性改變，見Fig 7B。

Fig 5 Effect of different administration groups on IL-1 (A) and TNF-α (B) content **P<0. 01 vs CON group; #P<0. 05, ##P<0. 01 vs WEFP group.

Fig 6A Analysis of expression of RhoA in rat liver specimens by IHC (200×)

Fig 6B Area of RhoA protein expression n=3)

3 討論

補骨脂被廣泛用于許多傳統(tǒng)中醫(yī)藥配方中，臨床使用過程中造成的肝損傷具有偶發(fā)性、隱匿性、個體差異大等特點。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)補骨脂醇提取物(EEFP)2.25 mg·kg-1，連續(xù)給藥30 d，可誘發(fā)大鼠出現(xiàn)膽汁淤積肝損傷，與臨床肝損傷表現(xiàn)一致，但其用藥劑量為臨床等效劑量的50倍，且給藥時間較長，不能充分解釋補骨脂在臨床使用中肝損傷的發(fā)生原因[8]。此外，有研究報道，補骨脂可能會引起IDILI，但其毒性機制尚不明確[6]。為進一步考察補骨脂引起IDILI隨時間變化的動態(tài)毒性特點和毒性機制，本研究應用LPS建立免疫應激動物模型與WEFP聯(lián)合作用SD大鼠。研究結果顯示，LPS和WEFP單獨給藥對ALT、AST和ALP含量無明顯影響。相同劑量的LPS結合WEFP在給藥第14 h后ALT、AST和ALP含量明顯升高，繼續(xù)給藥5 d后明顯降低，這是由于肝臟損傷引起肝細胞變性或壞死，細胞膜破裂，導致胞漿酶滲漏到血液中，引起血清酶升高。為了進一步證實這一結果，我們進行了肝臟組織病理學檢測，結果發(fā)現(xiàn)LPS誘導炎癥細胞浸潤，WEFP組出現(xiàn)輕度的脂肪沉積，但并均未見肝細胞損傷；在LPS+WEFP處理的大鼠中，出現(xiàn)肝細胞壞死和膽汁淤積。以上結果提示，非肝毒性劑量LPS引起的輕微炎癥反應可降低WEFP發(fā)生肝毒性閾值，導致肝細胞凋亡增加。

Fig 7 Effect of WEFP on expression of liver injury-related genes after continuous administration for 7 d in immunologically stressed rats

TLR4參與LPS信號傳遞，并作為CD14的細胞表面共受體，導致LPS介導的NF-κB激活并刺激單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等釋放大量的細胞因子和炎癥介質，產生一系列炎癥反應[9]。IDILI產生應激反應主要原因之一是激活肝臟中TNF-α和IL-1等細胞因子和趨化因子的釋放，促進和放大炎癥而加劇藥物毒性反應[10]。本研究結果顯示，與LPS單獨給藥組相比，WEFP同時作用能明顯增加LPS處理大鼠IL-1、TNF-α的分泌，加劇炎癥反應。ICAM-1是一種可誘導的細胞黏附的糖蛋白，當局部炎癥發(fā)生時受到多種炎癥因子刺激，導致細胞間ICAM-1表達上調，使白細胞和單核細胞穩(wěn)定粘附于內皮細胞。RhoA可調控肌動蛋白細胞骨架的形成、細胞聚集、活性氧、形成和凋亡等。除此之外，RhoA在LPS誘導的炎癥性免疫應激過程中發(fā)揮重要作用。RhoA信號通路被促炎癥因子激活后誘導NF-κB自細胞質向細胞核移動，激活 NF-κB 通路促進炎癥因子釋放，導致炎癥因子大量聚集導致炎癥反應加劇。RhoA信號通路影響NF-κB的激活和ICAM-1的表達。研究表明，LPS通過TLR4作用，刺激RhoA表達，從而誘導NF-κB反式活化和ICAM-1基因表達[11]。本文實驗結果顯示，WEFP可明顯增加免疫應激大鼠TLR4受體 mRNA的表達，進一步刺激大鼠體內RhoA和ICAM-1 mRNA的表達量增加。

促炎細胞因子通過影響導管膽汁形成，使膽汁酸代謝發(fā)生障礙，導致膽汁酸反流入血，血清TBA濃度升高，引起膽汁淤積[12]。FXR被稱為“膽汁酸受體”，它可與膽汁酸結合，調節(jié)膽汁酸代謝，維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)。細胞內膽汁酸水平的異常升高，使膽汁酸與 FXR 的配體結合區(qū)結合增加，激活 FXR 的靶基因，繼而負反饋調節(jié)膽汁酸的生成、分泌、重吸收，以維持機體膽汁酸和膽固醇的穩(wěn)態(tài)平衡。多藥耐藥蛋白(MRPs)和BSEP是一種定位于肝細胞的蛋白質，在將膽鹽運輸?shù)侥懝艿倪^程中發(fā)揮重要作用。研究結果顯示，LPS+WEFP給藥14 h膽汁流速出現(xiàn)明顯下降，造成膽汁淤積；在給藥8 d后膽汁流速逐漸恢復正常，同時mRNA結果顯示LPS+WEFP作用可引起FXR、MRP2和BSEP表達升高。提示LPS+WEFP早期作用引起的膽汁酸代謝和轉運失調造成的膽汁淤積，反饋性引起FXR、MRP2和BSEP表達升高，促進膽汁酸代謝和外排以維持機體膽汁酸穩(wěn)態(tài)。

綜上所述，非肝毒性劑量LPS引發(fā)的免疫應激狀態(tài)降低WEFP發(fā)生肝毒性的閾值，導致IDILI。其毒性機制可能是通過激活RhoA，進一步調節(jié)NF-κB反式激活和ICAM-1的表達，誘導炎癥反應加劇，導致膽汁酸外排受到阻礙，最終導致臟損傷。本文初步探索了WEFP誘發(fā)IDILI的發(fā)展過程及毒性作用機制，為解釋補骨脂引起的肝損傷的作用機制提供了新的思路。