馬兜鈴酸體內(nèi)外抗單純皰疹病毒作用

王兆琦，閆 涵，孫立山，王 偉

(中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，海洋藥物教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)感染是影響全球人類健康的重要問題。HSV屬于皰疹病毒科α皰疹病毒亞科，是一種線性雙鏈DNA包膜病毒，根據(jù)包膜蛋白抗原性的差別可分為HSV-1及HSV-2兩種類型[1]。免疫系統(tǒng)正常時，HSV主要造成口腔、生殖器及眼睛等部位的感染，而免疫受損的人群還會表現(xiàn)出腦炎癥狀[2]。HSV一旦感染，就會在宿主周圍神經(jīng)元中建立終生可逆的潛伏期[3-4]。HSV-1會導(dǎo)致口腔皰疹和角膜炎爆發(fā)，同時潛伏在三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)；而HSV-2通常侵入骶神經(jīng)節(jié)，引發(fā)生殖器皰疹[5]。有報告稱，生殖器皰疹會使艾滋病病毒感染的危險度增加3倍左右[6-7]。目前市面上用于治療HSV感染的藥物主要是阿昔洛韋(acyclovir，ACV)及其相關(guān)的核苷類似物，但是長期使用可能會產(chǎn)生不良反應(yīng)和病毒耐藥株[3]，并且目前尚無能夠預(yù)防HSV的有效疫苗[6]。因此，尋找低耐藥性的新型抗HSV藥物尤為重要。

馬兜鈴酸(aristolochic acids，AAs)屬于硝基菲類羧酸類化合物家族，是馬兜鈴、木通、細辛、廣防己等植物的主要成分[8-9]。AAs具有多種藥理活性，主要包括：抗病毒、抗炎、抗腫瘤等[8]。長期以來，含有AAs類化合物的中藥制劑被廣泛用于治療各種疾病。但是，已有報道證明，AAs具有腎毒性，可導(dǎo)致馬兜鈴酸腎病(aristolochic acids nephropathy，AAN)。馬兜鈴酸I是AAs中含量最高、毒性最強的成分，小鼠以20 mg·kg-1劑量給藥5 d即出現(xiàn)明顯腎損傷現(xiàn)象[9]。綜上，AAs用于臨床時應(yīng)嚴格把控劑量，合理使用。

目前為止，鮮有對AAs抗皰疹病毒活性的報道，本研究對AAs的體內(nèi)外抗HSV作用及其作用機制進行了初步探究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥物 AAs(313-67-7)購于陶素化工有限公司(中國上海)。ACV購于湖北午時藥業(yè)股份有限公司。

1.1.2細胞和病毒 非洲綠猴腎細胞(Vero)培養(yǎng)于MEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清(ExCell Bio，中國)，青霉素(100 kU·L-1)，鏈霉素(100 mg·L-1)，培養(yǎng)于37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中。HSV-1 F株購于ATCC(美國)。HSV-2 333株來源于中國科學(xué)院武漢病毒研究所。

1.1.3試劑 4%多聚甲醛(上海源葉生物科技有限公司)；5%結(jié)晶紫染色液、5×蛋白上樣緩沖液、PMSF、RIPA裂解液、堿性磷酸酶檢測試劑盒、蘇木素-伊紅染色試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司，胎牛血清從ExCell Bio公司購買，瓊脂粉、MEM干粉購于Gibco公司，0.25% 胰酶、雙抗購于新賽美生物科技有限公司，β-actin抗體從Cell Signalling Technology公司購買，HSV gD、gB、ICP27抗體購于Abcam公司，RNA提取試劑盒購于Aid lab公司，One Step TB Green?Prime ScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ試劑盒購于TaKaRa公司。

1.1.4儀器 Ⅱ級B2型生物安全柜購于新加坡Esco公司；CO2培養(yǎng)箱及臺式離心機購于美國Thermo公司，酶標(biāo)儀購于美國伯騰儀器有限公司；蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜設(shè)備從美國Bio-Rad公司購買；倒置相差顯微鏡購于日本Olympus公司；ABI 7500型定量PCR儀購于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2 方法

1.2.1細胞毒性實驗 接種Vero細胞于96孔板中，至其長滿單層，吸棄原培養(yǎng)液，將梯度稀釋的AAs(終濃度200、180、160、140、120、100、50、25 μmol·L-1)加入96孔板，每個濃度3個復(fù)孔，同時設(shè)有空白對照組。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h后，吸棄藥物，加入4%多聚甲醛室溫固定15 min，吸棄，加入5%結(jié)晶紫室溫染色15 min，清洗晾干后用酶標(biāo)儀測定A540nm值。

細胞存活率/%=實驗組A540nm/陰性對照組A540nm×100%。

1.2.2致細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)抑制實驗 將AAs梯度稀釋(終濃度50、25、12.5、6.25 μmol·L-1)，對HSV-1/HSV-2感染的細胞進行全過程給藥(預(yù)處理細胞、預(yù)處理病毒、吸附時、吸附后)。預(yù)處理細胞(Pre+Cell)：AAs于37 ℃作用細胞1 h，吸棄，37 ℃吸附HSV(MOI=0.1)1 h，換成維持液；預(yù)處理病毒(Pre+Virus)：AAs與HSV于37 ℃混合孵育1 h后，加入吸棄原培養(yǎng)基的96孔板中，37 ℃作用1 h，換成維持液；吸附時(adsorption)給藥：AAs與HSV(MOI=0.1)混合后加入96孔板中，于37 ℃作用1 h，換成維持液；吸附后(post-adsorption)給藥：HSV于37 ℃吸附細胞1 h，換成含有AAs的維持液。每個濃度設(shè)有3個復(fù)孔，同時設(shè)有病毒對照組和空白對照組。30 h后按“1.2.1”方法檢測A540nm，計算CPE抑制率。CPE抑制率/%=(實驗組A540nm-病毒對照組A540nm)/(空白對照組A540nm-病毒對照組A540nm)×100%。

1.2.3空斑實驗 接種Vero細胞于12孔板中，至其長滿單層。按照“1.2.2”中4種不同方式分別加入AAs(終濃度20 μmol·L-1)；或者先用HSV-1(MOI=0.1)于37 ℃吸附細胞1 h，吸棄，然后加入不同濃度的AAs(終濃度40、20、10、5 μmol·L-1)處理細胞；此外，先用HSV-1(MOI=0.1)于37 ℃吸附細胞1 h，之后于吸附后不同時間段(0～2、2～4、4～6、6～8、8～10、10～12、0～6、0～12 h)加入AAs(終濃度20 μmol·L-1)。24 h后收取上清，同時設(shè)病毒對照組。收取的上清稀釋10～1 000倍，于37 ℃吸附細胞1 h，吸棄，加入配制好的覆蓋培養(yǎng)基，待其冷卻凝固后，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中。至其出斑后，固定染色，進行空斑計數(shù)。

1.2.4間接免疫熒光實驗 接種Vero細胞于3.5 cm玻底皿，待細胞長至密度30%～40%時，用AAs(終濃度20 μmol·L-1)按照1.2.2中4種不同作用方式處理HSV-1(MOI=1.0)，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h。然后用PBS清洗細胞，4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS清洗2 min，0.25% Triton X-100通透10 min，PBS清洗2 min，2% BSA于37 ℃封閉1 h，PBS清洗3次，加入ICP5的抗體(1 ∶100稀釋)于4 ℃孵育16 h，清洗后加入DyLight 649?偶聯(lián)二抗于4 ℃孵育4 h，清洗3次，DAPI處理10 min，清洗后進行共聚焦成像，并使用ImageJ(NIH)(美國)進行分析。

1.2.5膜融合抑制實驗 接種Vero細胞于12孔板中，待細胞長滿單層，用HSV-1/HSV-2(MOI=0.1)于37 ℃感染細胞1 h，然后將含有不同濃度AAs(終濃度20、10、5、2.5 μmol·L-1)的維持液加入相應(yīng)孔中，同時設(shè)有病毒對照組和空白對照組。12 h后進行蘇木精-伊紅染色(HE染色)，顯微鏡下拍照后用ImageJ處理圖像。

1.2.6Western blot實驗 接種Vero細胞于6孔板中，待細胞長滿單層，用HSV-1/2(MOI=0.1)于37 ℃感染細胞1 h，然后將含有不同濃度AAs(終濃度20、10、5、2.5 μmol·L-1)的維持液加入相應(yīng)孔中，同時設(shè)有病毒對照組和空白對照組，16 h后收樣；Vero細胞接種于12孔板中，HSV-1(MOI=0.1)于37 ℃吸附細胞1 h，于吸附后不同時間段(0～2、2～4、4～6、6～8、8～10、10～12、0～6、0～12 h)加入AAs(終濃度20 μmol·L-1)，16 h后收樣；接種Vero細胞于6孔板中，待細胞長滿單層，用HSV-1(MOI=0.1)于37 ℃感染細胞1 h，然后將含有不同濃度AAs(終濃度80、40、10、5 μmol·L-1)的維持液加入相應(yīng)孔中，同時設(shè)有病毒對照組和空白對照組，24 h后收樣。每孔加入100 μL細胞裂解液(800 μL RIPA，200 μL 5×蛋白上樣緩沖液，10 μL PMSF)，冰上裂解17 min，將裂解液刮下后轉(zhuǎn)移到EP管中，100 ℃煮樣20 min，放在-20 ℃冰箱備用。用BCA試劑盒測定提取的蛋白濃度后進行SDS-PAGE電泳，將電泳膠通過半干法轉(zhuǎn)移到NC膜上，將NC膜用5%的奶粉于4 ℃封閉過夜，1×TBST洗滌3次，用HSV-1/HSV-2 ICP27和gB蛋白抗體、抗磷酸化p38 MAPK和NF-κB的抗體稀釋液(1 ∶1 000稀釋)于37 ℃孵育2 h，繼續(xù)洗滌3次，然后用二抗稀釋液(1 ∶5 000稀釋)于37 ℃孵育2 h。用堿性磷酸酶檢測試劑盒顯色，拍照后用ImageJ處理圖像。

1.2.7實時熒光定量PCR 接種Vero細胞于6孔板中，待細胞長滿單層，用HSV-1/2(MOI=0.1)于37 ℃感染細胞1 h，然后將含有不同濃度AAs(終濃度20、10、5、2.5 μmol·L-1)的維持液加入相應(yīng)孔中，同時設(shè)有病毒對照組和空白對照組。16 h后用RNA提取試劑盒提取總RNA。對提取的RNA進行濃度檢測后，利用Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR System，按照One Step TB Green? Prime ScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ試劑盒的說明書進行操作。

引物序列：HSV-1(gD) mRNA Forward primer：5′-AGCAGGGGTTAGGGAGTTG-3′;HSV-1(gD) mRNA Reverse primer：5′-CCATCTTGAGAGAGGCATC-3′;HSV-2(gD) mRNA Forward primer：5′-AGCATCCCGATCACTGTGTACTA-3′;HSV-2(gD) mRNA Reverse primer：5′-GCGATGGTCAGGTTGTACGT-3′;Actin mRNA Forward primer：5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′;Actin mRNA Reverse primer：5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。

1.2.8無病毒膜融合實驗 分別接種Vero細胞與BSRT7/5細胞于6孔板中，待細胞長至50%～70%，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。Vero細胞共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+) HSV-2-gB、pcDNA3.1(+) HSV-1-gD、pcDNA3.1(+) HSV-1-gH、pcDNA3.1(+) HSV-1-gL、pCAGGS-T7 luc質(zhì)粒(以下簡稱gB、gD、gH、gL、T7 luc)，轉(zhuǎn)染比例為1 ∶1 ∶2 ∶2 ∶4，BSRT7/5細胞共轉(zhuǎn)染gB、gD、gH、gL質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染比例為1 ∶1 ∶2 ∶2。轉(zhuǎn)染后24 h，將兩種細胞分別消化，1 ∶1混合接種于新的孔板中，同時給藥組加入不同濃度的藥物(楊梅素終濃度10、5 μmol·L-1，AAs終濃度20、10、5 μmol·L-1)，于37 ℃培養(yǎng)42 h后利用熒光素酶檢測試劑盒進行檢測。

1.2.9動物實驗 使用3～4周齡的BALB/c雌鼠，體質(zhì)量(14～15) g，動物許可證號SCXK(魯)20190003。隨機分為5組，每組12只：空白對照組，病毒對照組，陽性藥ACV(10 mg·kg-1·d-1)組，AAs高劑量(10 mg·kg-1·d-1)組及AAs低劑量(5 mg·kg-1·d-1)組。采用滴鼻方式接毒[13]，接毒后4 h給藥，連續(xù)給藥5 d。接毒后72 h解剖，取小鼠的肺及脊髓，通過空斑實驗及實時熒光定量PCR驗證藥物在體內(nèi)抗HSV-1的作用效果。以接毒日為起始日，連續(xù)14 d觀察小鼠臨床癥狀，每天記錄小鼠體質(zhì)量變化及生存情況。

1.2.10統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析及繪制統(tǒng)計圖表均采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件。各組數(shù)據(jù)先進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，采用單因素方差分析和t檢驗比較組間的差異。

2 結(jié)果

2.1 AAs的細胞毒性實驗將AAs稀釋為終濃度25、50、100、120、140、160、180、200 μmol·L-1，分別處理細胞24 h，結(jié)果如Fig 1所示，AAs在25 μmol·L-1時，細胞存活率接近80%；隨著濃度逐漸增大，細胞存活率逐漸下降，當(dāng)濃度達到180 μmol·L-1時細胞存活率下降至50%左右。經(jīng)計算，AAs對Vero細胞的半數(shù)細胞毒性濃度CC50值為193.1 μmol·L-1。

Fig 1 Cytotoxicity of aristolochic acids on Vero n=3)

2.2 CPE抑制實驗評價AAs對HSV-1及HSV-2的抑制作用我們進一步利用CPE抑制實驗評價了AAs全過程給藥對于HSV-1和HSV-2的抑制作用。結(jié)果如Fig 2所示，AAs在6.25～50 μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)對HSV-1及HSV-2感染均有明顯抑制作用。其中，AAs對HSV-1感染的抑制效果略優(yōu)于HSV-2，其IC50值約為11.12±3.06 μmol·L-1，治療指數(shù)為17.37(Tab 1)。同時設(shè)置ACV作為陽性對照組，結(jié)果顯示AAs抑制HSV-1感染的IC50值略低于ACV，但抑制HSV-2感染的IC50值略高于ACV，說明AAs對HSV-1的抑制作用略優(yōu)于ACV。根據(jù)CC50和IC50值計算治療指數(shù)(SI)，結(jié)果表明ACV的SI值分別是AAs的7倍和10倍，說明AAs的藥物安全性相對較差，其藥物毒性問題仍需進一步解決。本研究中體外實驗的AAs使用劑量以終濃度40 μmol·L-1為例，在Vero細胞上給藥100 μL時AAs含量約為0.014 mg，相當(dāng)于體內(nèi)實驗中一只15 g的小鼠以腎毒性劑量(20 mg·kg-1)給藥時AAs含量(0.3 mg)的1/20。

Fig 2 Inhibition of HSV-1/HSV-2 infection by aristolochic acids on Vero n=3)

2.3 空斑實驗檢測AAs在不同作用方式下對HSV增殖的抑制作用AAs以4種作用方式作用于HSV感染的Vero細胞后，24 h收取上清液。用收取的上清液進行空斑實驗，檢測病毒滴度，進一步評價AAs對病毒增殖的抑制作用。結(jié)果如Fig 3所示，預(yù)處理細胞組、預(yù)處理病毒組、吸附時給藥組對病毒滴度降低的作用不大，但是吸附后給藥組明顯降低病毒滴度，在20 μmol·L-1的濃度下幾乎完全抑制了HSV的增殖。這說明AAs主要作用于病毒吸附后的感染階段。

2.4 間接免疫熒光和空斑實驗評價不同濃度AAs抗HSV的作用方式我們進一步利用間接免疫熒光實驗評價AAs在不同作用方式下對HSV-1病毒蛋白gD表達的抑制作用。AAs按照上述4種不同作用方式處理細胞或病毒，8 h后利用免疫熒光檢測病毒gD蛋白的表達情況。結(jié)果如Fig 4A所示，無藥物處理的病毒組可以檢測到大量gD蛋白的紅色熒光，預(yù)處理細胞、預(yù)處理病毒及吸附時給藥組的紅色熒光相對于病毒組大幅減少，而吸附后給藥組的紅色熒光最弱。因此，AAs在吸附后給藥對于HSV蛋白表達抑制作用最強。

Tab 1 The inhibitory effects of aristolochic acids and acyclovir on Vero n=3)

Fig 3 Results of plaque assay of aristolochic acids in different treatment conditions on HSV n=3)

Fig 4 Inhibition of aristolochic acids on viral titer in HSV infected Vero n=3)

此外，我們還評價了不同濃度的AAs以吸附后給藥的方式作用于Vero細胞對于HSV增殖的抑制作用，設(shè)置ACV作為陽性對照組。即在HSV感染24 h后收取上清液，用收取的上清稀釋液進行空斑實驗，檢測病毒滴度。結(jié)果如Fig 4B所示，AAs在2.5～40 μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)能明顯抑制HSV在Vero細胞中的增殖，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。同時，與ACV組進行對比，在藥物濃度為10 μmol·L-1時，AAs處理可使病毒滴度下降約2.7個Lg(PFU·mL-1)，而ACV處理使病毒滴度下降約2.2個Lg(PFU·mL-1)，可見AAs抑制HSV-1增殖效果略優(yōu)于ACV，這進一步說明AAs主要通過影響病毒吸附后的感染事件來抑制HSV的增殖。

2.5 AAs對HSV誘導(dǎo)的膜融合的抑制作用HSV進入Vero細胞，需要病毒-細胞膜融合，這種融合需要HSV包膜糖蛋白gB、gD、gH/L異源二聚體的參與[10-11]。Vero細胞感染HSV-1或HSV-2后，用不同濃度的AAs(5、10、20 μmol·L-1)處理，30 h后對細胞進行HE染色，結(jié)果如Fig 5A-D所示，無藥物處理的病毒對照組出現(xiàn)明顯的膜融合現(xiàn)象(紅色箭頭指示合胞體形成)， 而不同濃度AAs處理后，膜融合現(xiàn)象受到明顯抑制。其中20 μmol·L-1時抑制現(xiàn)象最明顯，這種抑制作用同樣具有劑量依賴性(Fig 5B和5D)。

HSV的gB、gD、gH、gL蛋白對于膜融合現(xiàn)象的產(chǎn)生起著關(guān)鍵作用，于是我們進一步利用無病毒細胞-細胞膜融合實驗(分子膜融合實驗)檢測AAs是否與gB、gD、gH、gL 4種蛋白直接作用而抑制膜融合現(xiàn)象。由于4種HSV包膜蛋白(gB、gD、gH/L異源二聚體)對于細胞-細胞融合現(xiàn)象的產(chǎn)生必要且充分[11]。于是，我們將Vero細胞共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-gB、pcDNA3.1(+)-gD、pcDNA3.1(+)-gH、pcDNA3.1(+)-gL及pCAGGS-T7 luc 這5種質(zhì)粒，BSRT7/5細胞共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-gB、pcDNA3.1(+)-gD、pcDNA3.1(+)-gH、pcDNA3.1(+)-gL 4種質(zhì)粒后24 h，將兩種轉(zhuǎn)染細胞混合，同時加入不同濃度的藥物，培養(yǎng)42 h后利用熒光素酶檢測試劑盒進行定量檢測。前期的研究中我們發(fā)現(xiàn)，楊梅素可與病毒gD蛋白質(zhì)直接作用從而對膜融合現(xiàn)象產(chǎn)生抑制[12]。因此，本研究中以楊梅素作為膜融合抑制的陽性對照藥。結(jié)果如Fig 5E和5F所示，楊梅素濃度為5 μmol·L-1時即可減少約70%由gB、gD、gH/L引起的膜融合現(xiàn)象，當(dāng)其10 μmol·L-1時幾乎可以完全抑制膜融合，與之前的報道是一致的。但是，用不同濃度AAs處理后，膜融合現(xiàn)象并未被抑制。因此，AAs并非通過與gB、gD、gH/L 4種蛋白直接相互作用對膜融合現(xiàn)象產(chǎn)生抑制，而是通過抑制HSV的其它吸附后的感染事件來間接抑制HSV誘導(dǎo)的膜融合。

2.6 AAs在吸附后不同作用時間段對HSV的抑制作用通過上述實驗可以看出，AAs主要在吸附后階段對HSV感染產(chǎn)生抑制作用，于是，我們進一步利用Western blot及空斑實驗對AAs在HSV感染后不同時間階段給藥的抑制活性進行了評價。如Fig 6所示，Western blot及空斑實驗結(jié)果基本一致，AAs在吸附后2～4 h及4～6 h給藥可明顯降低病毒滴度，在6～8、8～10、10～12 h幾乎沒有抑制作用。另外，在0～6 h或0～12 h用AAs處理對病毒增殖的抑制作用更為明顯。因此，AAs在HSV感染后的早期階段即2～6 h作用效果較好。

2.7 AAs對病毒蛋白表達和mRNA表達的抑制作用既然AAs主要作用于病毒吸附后的2～6 h的感染階段，我們進一步利用Western blot和RT-PCR評價了AAs對病毒蛋白表達和mRNA表達的抑制作用。首先，在Vero細胞感染HSV-1或HSV-2后，按照吸附后給藥的方式，用AAs(2.5、5、10、20 μmol·L-1)處理細胞，16 h后收取蛋白樣品并進行SDS-PAGE電泳。我們選擇HSV-1蛋白ICP27及HSV-2蛋白gB進行檢測。結(jié)果如Fig 7A-D所示，AAs在2.5～20 μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)對HSV-1的ICP27蛋白和HSV-2的gB蛋白的表達都具有明顯的抑制作用。總之，AAs對HSV感染后蛋白的表達具有明顯抑制作用，且具有劑量依賴性。

此外，我們還利用實時熒光定量PCR法評價了AAs對病毒gD蛋白mRNA的表達的影響。結(jié)果如Fig 7E和7F所示，在AAs濃度為5 μmol·L-1以上時，對HSV-1和HSV-2的gD蛋白的mRNA表達具有明顯的抑制作用，與Western blot實驗結(jié)果基本一致，這說明AAs可以在病毒吸附后的復(fù)制過程中產(chǎn)生抑制作用，且這種抑制作用具有明顯的劑量依賴性。

Fig 5 Inhibition of aristolochic acids on membrane fusion induced by n=3)

Fig 6 Inhibition of aristolochic acids on HSV in different time periods after n=3)

Fig 7 Inhibition of aristolochic acids on HSV protein and mRNA

2.8 AAs對p38 MAPK/NF-κB信號通路蛋白表達的影響前期實驗發(fā)現(xiàn)，AAs可以抑制HSV吸附后的某些步驟，降低HSV的mRNA和蛋白表達，因此我們進一步探討AAs是否可以影響HSV感染細胞的相關(guān)信號通路。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是絲氨酸-蘇氨酸激酶，介導(dǎo)與一系列細胞活動相關(guān)的細胞內(nèi)信號，包括細胞增殖、分化、存活、死亡等[13]。p38 MAPK與細胞炎癥、凋亡、生長有關(guān)，據(jù)報道，HSV-1感染細胞p38 MAPK的激活可促進病毒的復(fù)制[14]。NF-κB可以調(diào)控炎性細胞因子和趨化因子的表達，在抑制細胞凋亡，以及免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[15-16]。據(jù)報道，HSV感染可以激活NF-κB，從而提高病毒復(fù)制的效率[16]。在此基礎(chǔ)上，我們檢測了在HSV-1感染后，AAs對細胞p38 MAPK及NF-κB信號蛋白的影響。

如Fig 8A、B所示，在細胞感染HSV-1 24 h后，病毒組中的p38 MAPK蛋白磷酸化水平約為正常對照組2.1倍。然而，AAs(20、40、80 μmol·L-1)處理后，p-p38 MAPK水平從正常對照組的2.1倍明顯下降到1.2、0.8和0.7倍，證明AAs能夠明顯降低由HSV感染導(dǎo)致的p38 MAPK的活化。

NF-κB是p38 MAPK通路的下游信號之一。如Fig 8A、8C所示，在細胞感染HSV-1 24 h后，病毒組中的NF-κB蛋白磷酸化水平約為正常對照組1.5倍。然而，AAs(40、80 μmol·L-1)處理后，NF-κB水平從正常對照組的1.5倍明顯下降到1和0.7倍，證明AAs能夠明顯降低由HSV感染導(dǎo)致的NF-κB的活化，抑制HSV的復(fù)制。因此，細胞p38 MAPK/NF-κB信號通路可能參與AAs體外抗HSV作用。

2.9 AAs的體內(nèi)抗HSV作用我們進一步利用HSV-1感染BALB/c小鼠建立HSV感染的小鼠肺炎和腦炎模型評價AAs的體內(nèi)抗HSV作用，并與陽性藥ACV進行對比分析。據(jù)報道，感染HSV的小鼠以ACV(10 mg·kg-1)處理7 d即可明顯降低死亡率[17]，本研究設(shè)置陽性藥ACV組劑量為10 mg·kg-1?；贏As腎毒性劑量約為20 mg·kg-1，同時為了控制實驗變量，在相同劑量下比較受試藥物AAs的療效，選擇1/4和1/2腎毒性劑量(5、10 mg·kg-1)的AAs進行體內(nèi)研究。結(jié)果如Fig 9A所示，與空白組相比，病毒組小鼠體質(zhì)量在接毒后持續(xù)下降，并始終輕于原始體質(zhì)量。陽性藥ACV組(10 mg·kg-1)體質(zhì)量前3 d緩慢下降，d 3后開始持續(xù)回升；AAs高劑量組(10 mg·kg-1)前9 d體質(zhì)量一直緩慢下降，d 9后開始緩慢回升，但仍低于空白組；AAs低劑量組(5 mg·kg-1)前7 d體質(zhì)量一直緩慢下降，d 7后開始緩慢回升，但仍低于空白組。

而Fig 9B的小鼠生存率結(jié)果表明，病毒組小鼠在接毒后d 2開始出現(xiàn)死亡，并且在d 6時生存率降至30%；而陽性對照藥ACV組(10 mg·kg-1)在接毒后d 1開始出現(xiàn)死亡，d 9時生存率降至70%；AAs高劑量組(10 mg·kg-1)在接毒后未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；AAs低劑量組(5 mg·kg-1)在接毒后d 5開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，在d 8時生存率降低至60%。AAs處理后，與病毒組相比小鼠體質(zhì)量上升趨勢不明顯，且AAs高劑量組體質(zhì)量下降程度大于低劑量組，推測AAs可能在10 mg·kg-1時就具有腎毒性。但是，AAs處理組的生存率明顯提高(P<0.01)，這說明AAs處理能夠明顯改善小鼠感染HSV-1后的生存狀況，提高小鼠生存率。

此外，我們利用空斑實驗檢測肺部組織的病毒載量，并利用實時熒光定量PCR檢測脊髓組織中的病毒載量，以此來評價AAs對于HSV體內(nèi)增殖的影響。結(jié)果如Fig 9C所示，與病毒組相比，陽性藥ACV組肺病毒載量下降了0.3個lg(PFU·mL-1)，AAs高劑量組肺病毒載量下降了0.9個lg(PFU·mL-1)，而AAs低劑量組下降了1.3個lg(PFU·mL-1)。AAs低劑量組優(yōu)于高劑量組，且都略優(yōu)于陽性藥組。另外，F(xiàn)ig 9D的結(jié)果表明，與病毒組相比，陽性藥ACV降低了小鼠脊髓組織中的約80%的病毒載量，AAs高劑量組降低了約70%的病毒載量，AAs低劑量組則降低了約90%。AAs低劑量組優(yōu)于高劑量組，且效果都優(yōu)于陽性藥ACV組。上述結(jié)果表明，AAs在體內(nèi)動物水平上能夠明顯降低小鼠組織中的病毒載量，且效果優(yōu)于陽性藥ACV。

Fig 8 Effect of aristolochic acids on p38 MAPK and NF- κB activation after HSV

Fig 9 Inhibition effect of aristolochic acids on HSV infection in vivo

3 討論

AAs具有廣泛的生物活性和藥理作用，主要有抗病毒、抗腫瘤、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛以及對心血管的藥理作用[7-8]。目前為止，尚無關(guān)于AAs抗HSV作用的報道。本研究前期利用Vero細胞模型發(fā)現(xiàn)AAs具有抗HSV-1及HSV-2的活性，且對Vero細胞毒性較低。本研究從體外和體內(nèi)兩個方向入手，對AAs抗HSV的活性進行了探究。

我們體外研究發(fā)現(xiàn)，吸附后給藥能夠明顯抑制HSV感染導(dǎo)致的細胞病變效應(yīng)，同時無病毒膜融合現(xiàn)象不能被AAs抑制，提示其可能作用于病毒進入或后續(xù)感染步驟，且作用靶點并非HSV gB、gD、gH/gL蛋白。病毒吸附后不同時間范圍給藥實驗表明AAs在病毒吸附后的早期階段即2～6 h作用效果較好。吸附后加入AAs能夠抑制HSV感染誘導(dǎo)的膜融合且能夠抑制ICP27、gB、gD蛋白的表達，再次證明AAs能夠抑制病毒吸附后的感染過程。同時，AAs能明顯減少病毒感染后p38 MAPK和NF-κB蛋白的磷酸化程度，這可能與病毒感染后AAs抑制HSV復(fù)制的過程有關(guān)。

此外，利用HSV-1感染BALB/c小鼠建立HSV感染的小鼠肺炎和腦炎模型評價AAs的體內(nèi)抗HSV作用。研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射AAs治療HSV-1感染的小鼠可明顯提高小鼠的存活率；但經(jīng)AAs處理后，小鼠體質(zhì)量無明顯上升，可能與其毒性有關(guān)。肺勻漿空斑實驗及脊髓勻漿實時熒光定量PCR實驗看出，AAs可明顯抑制HSV在肺和脊髓中的增殖，效果略優(yōu)于陽性藥ACV。

綜上所述，AAs具有很好的體內(nèi)外抗HSV感染作用，其主要作用于病毒吸附后的感染階段，但其具體作用靶點仍有待進一步探究。AAs對HSV在小鼠肺和脊髓中的增殖有明顯抑制作用，但其體內(nèi)毒性問題仍待解決。本研究首次揭示了AAs的抗HSV作用，并對其抗HSV作用機制進行了初步探究。研究結(jié)果表明，AAs具有開發(fā)成抗HSV藥物的潛力，但需要嚴格控制使用劑量，值得后續(xù)進一步研究。