大烏泡抗炎藥效部位的篩選及其有效成分含量測定的研究

唐念，王群*，張美麗，王嬌嬌，李雯君，湯瑾，金陽

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550001）

0 引言

大烏泡為薔薇科懸鉤子屬（Rubus multibracteatus Levl.&Vant.），以根及全株入藥，味微苦，性涼，入肝、脾二經(jīng)，主產(chǎn)于貴州、云南、四川等地，為我省苗族常用藥，具有祛風(fēng)除濕、清熱解毒、接骨、涼血、止血的功效，常被當(dāng)?shù)孛缱逵糜诟忻?、發(fā)熱、腸炎、痢疾、鼻出血等疾病的治療[1]。以大烏泡為主藥的齲齒寧含片，具有治療牙周炎，牙齦炎，齲齒痛療效[2]。大烏泡治療不同病癥時使用的藥用部位有所不同，例如用大烏泡治療痢疾、倒經(jīng)常用大烏泡的根和莖入藥，清熱解毒時常用大烏泡葉入藥[3,4]。因此，有必要對大烏泡進行藥效部位的篩選。文獻報道[5]，槲皮素和山奈酚可能為大烏泡抗炎鎮(zhèn)痛的藥效物質(zhì)。蘆丁屬于黃酮類化合物，具有抗自由基活性[6-9]，抗脂質(zhì)過氧化作用[10,11]。因此，測定這三種活性成分含量對大烏泡的質(zhì)量控制具有重要意義。鑒于此，本研究對大烏泡抗炎藥效部位進行篩選，并采用HPLC、UV法對大烏泡藥效部位中山奈酚、槲皮素及蘆丁等成分進行含量測定。

1 材料

1.1 儀器

電熱鼓風(fēng)干燥器（201-2AB，天津市泰斯特儀器有限公司），水浴恒溫振蕩器（THZ-82，常州市中貝儀器有限公司），數(shù)據(jù)恒溫水浴鍋（DRHH-S4，上海市雙捷實驗設(shè)備有限公司），高效液相色譜儀（lc-2040C3D，島津中國有限公司），紫外可見分光光度計（UV-5900，島津中國有限公司），電子分析天平（JA2003，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），羅氏全自動生化分析儀（cobacc501，Roche）。

1.2 試藥

蘆?。?00080-202012，中國食品藥品檢定院，純度>98%），槲皮素（100081-201010，中國食品藥品檢定院，純度>98%），山奈酚（110861-202013，中國食品藥品檢定院，純度>98%），吲哚美辛（H12035637，河北山姆士藥業(yè)有限公司）乙腈，甲醇（色譜級），其余試劑均為分析純。

1.3 實驗動物

昆明種雄性小鼠（18.39±2.82）g，購自貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物所，飼養(yǎng)于通風(fēng)良好，室溫18℃～25℃，按常規(guī)定期消的動物房，按每籠8只分裝。由專人飼養(yǎng)管理。小鼠人性化飼養(yǎng)，自由飲水及飼料。動物實驗經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會許可，實驗操作和處理嚴格遵循國際準則。

1.4 大烏泡不同部位提取物的制備

取1 kg大烏泡用10倍量70%乙醇回流提取3次，每次為3 h，3 h，2 h，合并濾液，回收乙醇至無味，濃縮至1 g/mL，即得大烏泡乙醇提取物。取適量乙醇提取物，依次用4倍量的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取3次，收集萃取液，回收溶劑，制備干浸膏，即得大烏泡石油醚，乙酸乙酯，正丁醇提取部位。

2 實驗方法

2.1 有效部位的篩選

2.1.1 分組與給藥

分別將小鼠隨機分為6組，每組8只。大烏泡服用量為30g/天[3]，根據(jù)人服用劑量換算小鼠劑量，大烏泡70%乙醇提組（780 mg/kg）、石油醚組(90.17 mg/kg)、乙酸乙酯組(144.30 mg/kg )、正丁醇組(267.54 mg/kg)為給藥組，吲哚美辛為陽性藥對照組（6.5 mg /kg），正常小鼠為空白對照組。各組均連續(xù)給藥7天，空白對照組給予同體積蒸餾水。

2.1.2 樣本收集

各組小鼠末次給藥后l h于小鼠右耳前后兩面涂抹二甲苯，致耳腫脹后，取血，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、TGF-β水平。取血后處死，剪下雙耳，用直徑9 mm自動打孔器，在兩耳廓中間部位同一位置打下耳片，稱重。

小鼠耳腫脹度計算：腫脹度=右耳重-左耳重

2.1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2.2 HPLC測定大烏泡中槲皮素、山奈酚的含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱為ACE Excel 5 C18-AR（250×4.6 mm，5μm）；流動相以0.3%磷酸-甲醇（30:70）等度洗脫，檢測的波長為360nm，柱溫為30℃；流速為0.8mL/min；進樣體積為10μL。

2.2.2 對照品與樣品溶液的制備

分別精密稱取槲皮素對照品1.85 mg、山奈酚對照品1.25 mg，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，制成槲皮素濃度為0.185 mg/mL；山奈酚濃度為0.125 mg/mL的對照品溶液。取大烏泡乙酸乙酯，正丁醇部位干浸膏混合均勻，得有效成分提取物，精密稱取此提取物1 g，轉(zhuǎn)移至50 mL錐形瓶中，加入鹽酸甲醇溶液（含10%鹽酸）25mL，稱定重量，冷浸30min后，超聲提取60 min（80HZ，60℃），取提取液放至室溫，補量，過濾，即得大烏泡提取物樣品溶液。

2.2.3 線性關(guān)系的考察

吸取不同濃度的槲皮素（4.60、9.25、18.50、37.00、74.00、111.00μg/mL）和山奈酚（1.25、6.25、12.50、25.00、75.00、125.00μg/mL）對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定。將測得的峰面積與相應(yīng)的濃度作線性方程。

2.2.4 專屬性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗

分別精密吸取“2.2.2”項下槲皮素和山奈酚標準溶液，及供試品溶液。按“2.2.1”項下色譜條件，分別進行6次測定，對儀器精密度及方法重復(fù)性進行考察。并考察樣品24小時內(nèi)的穩(wěn)定性。

2.2.5 加樣回收率實驗

精密稱取1 g已知含量槲皮素和山奈酚的大烏泡有效部位提取物樣品6份，加入對照品，按“2.2.2”項下的方法制備，按照“2.2.1”的色譜條件檢測。

2.2.6 樣品含量測定

按“2.2.2”項的方法制備樣品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣分析，記錄槲皮素和山奈酚的峰面積，采用外標一點法計算出大烏泡藥效部位中槲皮素和山奈酚的含量。

2.3 UV測定大烏泡中蘆丁的含量

2.3.1 對照品與樣品溶液的制備

精密量取蘆丁對照品10.00mg，用60%乙醇溶液定容至50mL容量瓶中，制備成濃度為0.2mg/mL的對照品溶液。精密稱取大烏泡有效部位提取物1 g，移至錐形瓶中，加入25mL甲醇溶液，稱重，超聲提取50min（80HZ，60℃），冷至室溫，補重，靜置濾過，為供試品溶液。

2.3.2 檢測波長的選擇

精密吸取蘆丁對照品溶液2mL，用60%乙醇溶液稀釋至10mL。精密吸取大烏泡供試品溶液1mL，將其轉(zhuǎn)移至10mL的容量瓶中，甲醇溶液稀釋至刻度。對照品及試品溶液分別進行200～800nm波長范圍內(nèi)的全波長掃描。

2.3.4 線性關(guān)系考察

精密吸取蘆丁對照品溶液稀釋成一系列濃度（0.00501、0.01002、0.01503、0.02004、0.02505、0.03006mg/mL），375nm波長下測定吸光度。以濃度及其吸光度作線性回歸，得線性回歸方程。

2.3.5 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗

精密吸取蘆丁標準溶液5mL，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，加入60%乙醇稀釋至刻度。375nm波長下測定吸光度，重復(fù)6次，計算其吸光度的RSD%。制備6份供試品溶液，每份精密吸取2 mL，加入甲醇溶液稀釋至10mL，計算其吸光度的RSD%。并考察樣品24小時內(nèi)蘆丁含量的穩(wěn)定性。

2.3.6 加樣回收試驗

稱取大烏泡有效部位提取物6份，每份約0.5 g，分別精密加入蘆丁對照品溶液，按“2.3.2”項下方法制備，375nm波長下測定吸光度，測定其含量的RSD%。

3 實驗結(jié)果

3.1 藥效試驗

與模型組比較，大烏泡70%乙醇提取物組、正丁醇、乙酸乙酯提取部位組能顯著緩解二甲苯對小鼠耳朵刺激而產(chǎn)生的腫脹，降低炎癥小鼠血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）水平。結(jié)果見圖1。

圖1 各組小鼠各項指標的檢測結(jié)果（±sD，n=8）

3.2 HPLC測定大烏泡中槲皮素、山奈酚的含量測定

3.2.1 線性關(guān)系的考察

結(jié)果見圖2。槲皮素回歸方程為：y=16334x+30160，r=0.9997，濃度在4.600～111.000μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；山奈酚回歸方程為：y=14148x+2623.3，r=0.9996。濃度在1.250～125.000μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 槲皮素、山奈酚的線性回歸曲線

3.2.2 專屬性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗

色譜圖見圖3，對照品及樣品在相同色譜條件下進行測定，結(jié)果表明含量測定方法專屬性好。對照品及6份樣品溶液，測得槲皮素、山奈酚含量RSD%<3%，實驗精密度、重復(fù)性良好，結(jié)果見表1。24小時內(nèi)，所測定有效成分槲皮素和山奈酚含量RSD<3%，樣品穩(wěn)定性好，結(jié)果見表2。

表1 精密度和重復(fù)性結(jié)果（n=6）

表2 供試品溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果（n=6）

圖3 山奈酚、槲皮素對照品和供試品溶液HPLC譜圖

3.2.3 加樣回收率實驗

結(jié)果見表3，大烏泡樣品含量測定方法回收率性良好。

表3 槲皮素、山奈酚加樣回收率（n=6）

3.2.4 樣品含量測定

三批大烏泡藥效提取部位槲皮素、山奈酚的含量見表4。

表4 大烏泡藥效部位中槲皮素和山奈酚含量測定的結(jié)果（n=3）

3.3 UV測定大烏泡中蘆丁的含量

3.3.1 線性關(guān)系考察

結(jié)果見圖4。槲皮素回歸方程為：y=24.511x +0.014，r=0.9994，濃度在0.00501～0.03006mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖4 蘆丁線性回歸曲線

3.3.2 精密度試驗

對照品重復(fù)進樣6次，及6份樣品溶液測得蘆丁峰面積RSD（%）<3%，實驗精密度、重復(fù)性良好，結(jié)果見表5。24小時內(nèi)，所測定有效成分蘆丁含量RSD<3%，樣品穩(wěn)定性好，穩(wěn)定性結(jié)果見表6。

表5 精密度和重復(fù)性結(jié)果（n=6）

表6 穩(wěn)定性考察（n=6）

3.3.3 加樣回收試驗

結(jié)果見表7，大烏泡藥效提取部位中蘆丁的含量測定方法回收率性良好。

表7 蘆丁加樣回收率考察（n=6）

3.3.4 大烏泡藥效提取部位中蘆丁的含量測定

三批大烏泡藥效提取部位中蘆丁含量見表8。

表8 蘆丁的含量（n=3）

4 討論

本課題通過抗炎藥效篩選實驗，篩選出正丁醇部位、乙酸乙酯部位為主要抗炎活性部位，而這兩個部位是黃酮類化合物聚集的主要部位，因此，大烏泡抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)可能是黃酮類物質(zhì)。本實驗以黃酮類成分槲皮素、山奈酚、蘆丁為指標成分，采用高效液相色譜法對山奈酚與槲皮素進行含量測定，采用紫外線-可見光分光度法對蘆丁進行含量檢測，槲皮素和山奈酚均在360～365nm波長處有較好的檢測效能。經(jīng)過對檢測方法的專屬性、線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率等進行考察，結(jié)果顯示，大烏泡中有效成分的含量檢測方法，穩(wěn)定可靠、重復(fù)性良好。

孟鑫、劉瑤等[12,13]根據(jù)大烏泡化合物的1H-NMR、13C-NMR譜圖進行綜合解析后發(fā)現(xiàn)，大烏泡正丁醇萃取部位化學(xué)成分主要為槲皮素和山奈酚。槲皮素具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[14-19]。司天雷[20]在槲皮素體內(nèi)外抗炎作用研究中發(fā)現(xiàn)，槲皮素體外能有效抑制前列腺素E2和一氧化氮表達，調(diào)控誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶表達，抑制促炎細胞因子產(chǎn)生的作用；對內(nèi)毒素血癥小鼠模型中促炎因子的基因表達有抑制作用，能夠有效控制促炎因子的合成與釋放。山奈酚能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的人單核細胞MAPK通路的表達[21]。也可阻斷哮喘小鼠氣道上皮細胞Tyk-STAT信號通路，抑制STAT3的激活，有效抑制炎癥的發(fā)生[22]。蘆丁則可以通過抑制一些參與炎癥的細胞信號通路和關(guān)鍵酶的表達，產(chǎn)生抗炎作用[23]。綜上所述，槲皮素、山奈酚、蘆丁等成分可能是大烏泡發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵活性成分。